可用于檢測與精神分裂癥相關的drd3基因甲基化程度的試劑盒及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了可用于檢測與精神分裂癥相關的DRD3基因甲基化程度的試劑盒及其應用，特點是該試劑盒包括一對DRD3基因啟動子區甲基化特異性擴增引物及一個甲基化特異性測序引物，其中上游引物具有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，甲基化特異性測序引物如SEQIDNO.3所示，優點是該診斷試劑盒可以方便快捷地在分子水平上實現對精神分裂癥及其亞型的檢測，檢測效率高，針對性強，同時，以DRD3基因啟動子區甲基化為靶點的藥物有望成為精神分裂癥輔助診斷、檢測和篩選的一種新手段。
【專利說明】可用于檢測與精神分裂癥相關的_3基因甲基化程度的試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種個性化輔助診斷精神分裂癥的檢測試劑盒，尤其是涉及一種可用于檢測與精神分裂癥相關的DRD3基因甲基化程度的試劑盒及其應用。
【背景技術】
精神分裂癥(Schizophrenia)是重大的精神類疾病之一，其可引起思考方式及情緒反應的崩潰，具體表現有感覺、知覺、思維、情感以及意志行為等障礙。精神分裂癥是一種遺傳因素和環境心理因素共同作用引起的疾病。據了解，中國目前的精神分裂癥患者數量高達1300萬。全中國每100人中就有一名精神分裂癥患者。當前，雖然精神病學研究主要致力于神經科學領域，但至今未找出合理的發病機制。因此，開展可行性的精神分裂癥研究具有很大的前景。
[0002]多巴胺受體D3 0--?)分布于中腦邊緣區的伏隔核和Calleja島，是由基因編碼的一種G蛋白耦聯受體，而/--?基因位于3ql3.3 (第3號染色體長臂13區3帶)。目前國內外的研究已經證明“精神分裂癥的臨床癥狀是由于中樞多巴胺活動過強造成的”。而且也有研究背景表明:基因的甲基化是在不改變DNA序列情況下，影響基因表達。基因甲基化和精神分裂癥之間是否存在相關性有待進一步驗證。目前，國內外還沒有公開任何關于檢測與精神分裂癥相關的/----基因甲基化程度的試劑盒的相關研究報道。
【發明內容】
[0003]本發明所要解決的技術問題是提供一種可用于檢測與精神分裂癥相關的/--?基因甲基化程度的試劑盒及其應`用，該試劑盒通過各CpG點的差異顯著性分析，可以方便快捷地在分子水平上實現對精神分裂癥及精神分裂癥亞型的檢測，檢測效率高，針對性強。
[0004]本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為:可用于檢測與精神分裂癥相關的DRD3基因甲基化程度的試劑盒及其應用，該試劑盒包括一對/--?基因甲基化特異性擴增引物及甲基化特異性測序弓丨物，其中
所述的甲基化特異性擴增上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示:
5’ - AGGGAGTTAAGAGTTTAGATATAAGG -3’ (SEQ ID N0.1)；
所述的甲基化特異性擴增下游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示:
5’ - GTTTAGGGTTTGTAGGG -3’ (SEQ ID N0.2)；
所述的甲基化特異性測序引物如SEQ ID N0.3所示:
5’ -Biotin- ACCCAAAACCACCTCTAAACAT -3，(SEQ ID N0.3)。
[0005]一種可用于檢測與精神分裂癥相關的/--?基因甲基化程度的試劑盒的應用，在外周血檢測中，通過該試劑盒檢測得到的DRD3基因CpG2點甲基化程度與正常組具有顯著性差異，則判斷男性患有未定型及偏執型精神分裂癥，女性則患有未定型精神分裂癥；通過該試劑盒檢測得到的DRD3基因CpG3點甲基化程度與正常組具有顯著性差異，則判斷男性患有未定型及偏執型精神分裂癥，女性則患有未定型精神分裂癥；通過該試劑盒檢測得到的DRD3基因CpG5點甲基化程度與正常組具有顯著性差異，則判斷女性組患有偏執型精神分裂癥。
[0006]與現有技術相比，本發明的優點在于:本發明首次公開了可用于檢測與精神分裂癥相關的DRD3基因甲基化程度的試劑盒及其應用，DRD3基因的高甲基化水平導致/--?基因的低表達，從而影響/--?在腦部通路轉運的循環量減少，最后導致精神分裂癥的發生和發展。因此/--?基因甲基化水平在腦部與精神分裂癥患病率呈負相關。以檢測外周血/--?基因啟動子區甲基化水平為基礎的診斷試劑盒，可以方便快捷地在分子水平上實現對精神分裂癥及精神分裂癥亞型的檢測，檢測效率高，針對性強。該試劑盒可用于男女各人群精神分裂癥亞型的輔助診斷、檢測或篩查藥物中，應用前景廣泛。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0007]圖1為/--?基因被檢測序列所在區域以及所檢測的5個CpG點的關聯分析結果；(例如CpGl與CpG2相關性為0.862，CpG3與CpG4相關性為0.193)
圖2為甲基化水平檢測結果示例:表示甲基化程度，如圖示CpGl到CpG5的甲基化程度分別為 13%, 18%, 13%，8%，8%。
【具體實施方式】
[0008]以下結合附圖實施例對本發明作進一步詳細描述。 具體實施例
[0009]1、研究對象的收集
從某醫院收集精神分裂癥患者，總共354例，同時收集300名正常者作為對照組，經過年齡(最終選定樣本的年齡均在30歲上下)、性別、知識背景以及DNA相關濃度這些數據的分析，篩選出匹配指數(年齡，學歷，性別)較高的實驗樣本量:30名精神分裂癥患者(15名男性+15名女性)，30名正常對照組(15名男性+15名女性)。
[0010]2、基因組DNA的提取
應用Lab-Aid 820全自動核酸提取儀(中國廈門致善生物科技有限公司，500ul體系)提取樣本的全血基因組DNA，再通過核酸蛋白測定儀檢測所得DNA的濃度，以供/--似基因啟動子區DNA甲基化水平的檢測。
[0011]3、DNA甲基化水平測定
本研究采用重亞硫酸鹽焦磷酸測序技術對/--?基因啟動子區的5個CpG位點(如圖1)進行了 DNA甲基化水平檢測。此技術的基本原理:用試劑盒中的重亞硫酸鹽處理DNA樣品后，再應用聚合酶鏈反應(PCR)擴增，可使發生甲基化的胞嘧啶(C)堿基保持不變，而使未發生甲基化的C轉變成了尿嘧啶(U)，然后通過測序引物進行PCR測序，從而得到哪個位點發生了甲基化。本次研究采用PyroMark Assay Design軟件進行引物設計,用于實驗的PCR擴增引物和測序引物如下:
(I)甲基化特異性上游引物(Forward primer)
5’ - AGGGAGTTAAGAGTTTAGATATAAGG -3’ (SEQ ID N0.1),(2)甲基化特異性下游引物(Reverseprimer)
5’ - GTTTAGGGTTTGTAGGG -3’ (SEQ ID N0.2)；
(3)甲基化特異性測序引物(Sequencingprimer)
5’ -Biotin- ACCCAAAACCACCTCTAAACAT -3，(SEQ ID N0.3)。
[0012]上述擴增的具體步驟為:
A.采用QIAGEN EpiTect? 亞硫酸氫鹽處理試劑盒(EpiTech Bisulfite Kits;Qiagen; #59104)對樣本DNA進行亞硫酸氫鹽轉化；
B.取步驟A中轉化過的DNA樣本20ng加入到PyromarkPCR試劑盒(Pyromark PCRKit; Qiagen; #978703),并加入上述一對/--?基因啟動子區甲基化特異性擴增引物，進行PCR擴增，擴增條件:首先950C 15min的變性；接著95°C 15s, Tm 30s, 72°C 20s，共50個循環的退火反應；然后延伸反應72°C 5min (注:Tm在實驗中根據跑PCR梯度溫度確定)；
C.焦磷酸測序的前期準備:在PSQ96板中預先加入45ii I含有0.3 ii M上述甲基化特異性測序引物的退火緩沖液(PyroMark Annealing Buffer; Qiagen; #979009);將需要使用的混勻的瓊脂糖珠總量(每樣本3iU)轉移到一個Eppendorf管中；在瓊脂糖珠中加入結合緩沖液(PyroMark Binding Buffer; Qiagen; #979006),使得平均每個樣品約有50 u I的體積,將混合物混勻；將以上混合物加入PCR產物(50 ii I反應體積)中，每樣本50 ii I ;將PCR產物在常溫下混勻10分鐘，使得磁珠與生物素結合；在真空預備工作站中，四個樣品板中依次加入180ml 的高純水、70%乙醇、洗漆緩沖液(PyroMark Wash Buffer; Qiagen; #979008)和 120ml的變性緩沖液(PyroMark Denaturation Solution; Qiagen; #979007);打開真空預備工作站的泵，將真空準備工具在高純水中清洗30秒；然后將真空準備工具(PyroMark Vacuum PrepFilter Probes; Qiagen; #979010)移到PCR板中，抓取瓊脂糖珠(在磁珠與PCR產物結合后三分鐘內完成此操作)；拿起PCR板，檢查是否大部分磁珠都被吸附在了真空準備工具上；將真空準備工具放入70%乙醇中5秒；然后移到變性緩沖液中5秒；再移到洗滌緩沖液中清洗5 - 10秒；關掉泵；將真空準備工具放入含有測序引物的板中，搖動，釋放瓊脂糖珠(測序引物也可最后加入);使用高純水清洗真空準備工具；將放有樣品的PSQ96板放在加熱板上加熱到80°C 2分鐘，再冷卻到室溫，即可進行焦磷酸測序反應；
D.焦磷酸測序:在PyroMarkQ24焦磷酸測序儀上,采用Pyromark Gold Q24試劑盒(Pyromark Gold Q24 Reagents; Qiagen; #978802)對步驟 C 中的 PSQ96 板中的樣本進行測序，然后應用PyroMark CpG軟件對結果進行甲基化分析(甲基化水平檢測結果示例見圖2)。
[0013]4、數據分析
本次研究采用SPSS 16.0對數據進行整理分析。我們發現:被檢測的5個CpG位點中有4個位點(CpGl、CpG2、CpG4和CpG5)之間存在相關性(r > 0.6，且/7 < 0.001，見圖1)，因此我們用/MW各CpG位點的甲基化程度，分別作了性別與亞型之間的比較。
[0014]結果(見表1，表2)發現:在分亞型與性別及其CpG位點間的甲基化水平比較中，CpG2，CpG3在男性中與未定型及偏執型精神分裂癥都存在關聯(/7 < 0.05，但男性中偏執型與未定型差異不顯著，無法進一步進行區分);而CpG2在女性中與未定型精神分裂癥患者存在關聯(/? = 0.004 < 0.05)，CpG3在女性中與未定型精神分裂癥也存在關聯(p = 0.040
<0.05)，而CpG5在女性中卻與偏執型精神分裂癥存在關聯(/7 = 0.024 < 0.05)。
[0015]表1男性亞型中CpG位點的甲基化情況
【權利要求】
1.一種可用于檢測與精神分裂癥相關的/----基因甲基化程度的試劑盒，其特征在于:該試劑盒包括一對/--?基因啟動子區甲基化特異性擴增引物及甲基化特異性測序引物，其中所述的甲基化特異性擴增上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示:
5’ - AGGGAGTTAAGAGTTTAGATATAAGG _3’ ； 所述的甲基化特異性擴增下游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示:
5’ - GTTTAGGGTTTGTAGGG -3’ ； 所述的甲基化特異性測序引物如SEQ ID N0.3所示:
5’ -Biotin- ACCCAAAACCACCTCTAAACAT -3’ 。
2.一種如權利要求1所述的可用于檢測與精神分裂癥相關的/--?基因甲基化程度的試劑盒的應用，其特征在于:在外周血檢測中，通過該試劑盒檢測得到的DRD3基因CpG2點甲基化程度與正常組具有顯著性差異，則判斷男性患有未定型及偏執型精神分裂癥，女性則患有未定型精神分裂癥；通過該試劑盒檢測得到的DRD3基因CpG3點甲基化程度與正常組具有顯著性差異，則判斷男性患有未定型及偏執型精神分裂癥，女性則患有未定型精神分裂癥；通過該試劑盒檢測得到的DRD3基因CpG5點甲基化程度與正常組具有顯著性差異，則判斷女性組患有偏執型精 神分裂癥。
【文檔編號】C12Q1/68GK103602722SQ201310319417
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年7月25日 優先權日:2013年7月25日
【發明者】周科娜, 段世偉, 高樹貴, 成佳, 章凱, 鄭榮炯, 莊起東, 戴東君 申請人:寧波大學