一種利用枯草芽孢桿菌生產環磷腺苷的方法
【專利摘要】本發明公開了一種生產作為藥物和生化試劑有用的環磷腺苷的工業方法，編碼具有腺苷酸環化酶活性的蛋白并可用于上訴生產方法的基因，含有該基因的重組DNA，含有該重組DNA的新菌株，和使用該新菌株生產環磷腺苷的方法。
【專利說明】一種利用枯草芽孢桿菌生產環磷腺苷的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物菌種篩選的【技術領域】，特別涉及利用基因重組構建環磷腺苷高 產菌株及其發酵生產的技術。
【背景技術】
[0002] 本發明涉及一種生產作為藥物和生化試劑有用的環磷腺苷的工業方法，編碼具有 腺苷酸環化酶活性的蛋白并可用于上訴生產方法的基因，含有該基因的重組DNA，含有該重 組DNA的轉化子，和使用該轉化子生產環磷腺苷的方法。而環磷腺苷為循環系統用藥，屬于 能量合劑的一種，臨床主要用于心力衰竭、心肌炎、病竇綜合征、冠心病及心肌病，也可用于 心律失常的輔助治療。
[0003] 下列方法是生產環磷腺苷的已知方法：
[0004] (1)堿性水解法
[0005] Davidlipkin等人在1959年曾用堿性水解的工藝方法制得了環磷腺苷。此法主 要是利用三磷酸腺苷（ATP) 100°C時在氫氧化鋇強堿水溶液中水解并關環制得環磷腺苷。
[0006] (2)活性酯類法
[0007] 河北大學韓文炎和屠宛蓉在1986年報道了環磷腺苷的改進合成工藝方法。5-腺 苷酸、4-嗎啡啉-N，N_二環己基脒和金屬鈉在乙二醇單甲醚溶劑中反應，合成了環磷腺苷。
[0008] (3)DCC脫水法
[0009] M.Smith等在1961年用5-腺苷酸和4 一嗎啡啉一N，N-二環己基脒在吡啶溶劑 中，用DCC作脫水劑進行脫水反應，使5-腺苷酸發生內酯化反應，產物的收率可達80%。-
[0010] ⑷三氯氧磷法
[0011] 1989年，Genieser等報道了腺苷與三氯氧磷反應得到腺苷的合成工藝路線。中間 體腺苷二氯磷酸酯不經過分離，加堿環化得到環磷腺苷。此法原料容易得到，反應條件溫和 適中，但收率偏低（49% )。
[0012] 但以上方法全都屬于化學合成方法，難點在于反應所需原料都具有毒性和污染， 且工業化生產過于昂貴。
[0013] 本發明的目的是提供發酵法生產環磷腺苷的方法，為了更適于工業化生產，本發 明還提供了含有腺苷酸環化酶基因的轉化子。利用該轉化子可以大量生產環磷腺苷。
【發明內容】
[0014] 本發明的目的是提出一種構建環磷腺苷高產菌株并使之產生環磷腺苷的方法，依 此方法可有效的生產環磷腺苷。
[0015] 本發明的目的是通過如下的技術方案實現的：一種構建重組環磷腺苷產生菌株的 方法，其特征在于包括以下過程：從十字花科蔬菜黑腐病菌jsim-3017獲得腺苷酸環化酶 基因并連接于表達載體PHT01。電轉化該載體于宿主菌枯草芽孢桿菌jsim-1025。在青霉素 平板上挑取不敏感的菌落。于斜面培養基培養2-3天后，接種于裝有30ml液體發酵培養基 的250ml搖瓶，分1級或2級發酵，于28-36°C，轉速為200-220rpm的搖床中培養24-120h， 通過高壓液相色譜，檢測環磷腺苷產量，從而獲得高產的環磷腺苷產生菌。新的遺傳標記 為：黃嘌呤、組氨酸、硫胺素三重缺陷型（縮寫為Xan-、His-、Thi_)，鳥苷酸還原酶、腺苷酸 脫氨酶缺失（GMPred-、Deam-)，8-氮鳥噪呤抗性（8-AGr)以及腺苷酸環化酶陽性。
[0016] 上述的篩選平板中青霉素的含量為：50iig/ml。
[0017]上述的液體發酵培養基組成及質量含量為：葡萄糖30-100g，胰蛋白胨5_20g，K2HP045-8g，玉米漿l-3g，NaC12-10g溶于 1L自來水中，PH，5-9。
[0018] 本發明采用的通過重組得到的環磷腺苷高產菌株，設備簡單、方法宜行、效果良 好，發酵單位達到6-10g/L，最高可以達到12g/L。
【具體實施方式】
[0019] 實施例一
[0020] 本發明包括提取含有腺苷酸環化酶活性的蛋白基因，如序列號1所示氨基酸序列 的蛋白。
[0021] 含有腺苷酸環化酶基因的DNA片段可以從能夠產生環磷腺苷的微生物中獲得。任 何具有產生環磷腺苷的微生物都可以用于本發明。一株十字花科蔬菜黑腐病菌jsim-3017 是本
【發明者】擁有并保藏的。
[0022] 以下描述從十字花科蔬菜黑腐病菌jsim-3017獲得腺苷酸環化酶基因的方法。
[0023]通過常規DNA分離方法如苯酚方法（Biochem.Biophys.Acta, 72,619-629)，從十 字花科蔬菜黑腐病菌jsim-3017制備染色體DNA。
[0024] 可用常規方法合成引物PCR擴增序列1的DNA片段，跑膠回收PCR產物。
[0025] PCR引物序列如下：
【權利要求】
1. 一種環磷腺苷的生產方法，其特征是微生物發酵生產。
2. 依據權利要求1，其發酵菌株特征是以Bacillus subtilis JSM-1025腺苷產生菌 為宿主菌，采用基因重組方法，轉入能編碼腺苷酸環化酶的基因，得到新的工程菌。該突變 株不再積累腺苷而積累大量環磷腺苷。新的遺傳標記為：黃嘌呤、組氨酸、硫胺素三重缺陷 型（縮寫為乂&11-、把8-、1111-)，鳥苷酸還原酶、腺苷酸脫氨酶缺失（61^代(1-、〇6 &111-)，8-氮 鳥嘌呤抗性（8-AGr)以及腺苷酸環化酶陽性。
3. 依據權利要求2,該編碼腺苷酸環化酶的基因源自一株十字花科蔬菜黑腐病菌 jsim-3017。
4. 依據權利要求1，所述的一種發酵產生環磷腺苷的方法，其特點在發酵培養基中，于 28-36°C，轉速為200-220rpm的搖床中培養24-120h。
5. 依據權利要求1，發酵培養基組成及質量含量為：葡萄糖30-100g，胰蛋白胨5-20g， K2HP045-8g，玉米漿 l-3g，NaC12-10g 溶于 1L 自來水中。
6. 依據權利要求1，發酵過程中PH控制在5-9。
【文檔編號】C12P19/32GK104342468SQ201310311307
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年7月24日 優先權日:2013年7月24日
【發明者】朱曉宏, 朱曉慧, 魏薇, 單志萍, 孟妤, 陸茂林, 楊曉偉, 司竑飛 申請人:江蘇省微生物研究所有限責任公司