一種馬流產沙門菌pcr檢測試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發明涉及一種可用于檢測馬流產沙門氏菌的PCR檢測試劑盒，包括引物、dNTP、緩沖液和DNA聚合酶，其中的上游引物是5’ATTAGTGCCGGTTTTATCCT3’下游引物是5’TTACCACTCGCATCAAATC3’，PCR檢測方法：提供待測樣品模板；在PCR簿壁管中加入dNTP、10×buffer、引物、DNA聚合酶、待測樣品和ddH2O，混勻；令簿壁管中的混合物在PCR儀上擴增；在電泳設備中電泳擴增產物；分析并進行結果判斷。該PCR試劑盒配制方法簡便，易于產業化生產，PCR檢測方法檢測馬流產沙門菌的靈敏度高、檢測周期短、速度快、可操作性強、其檢測精度達30個菌或5.7pg的模板DNA，而檢測成本卻相對較低，在該病的臨床防控中具有重要的應用價值。
【專利說明】—種馬流產沙門菌PCR檢測試劑盒及其檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種可用于檢測馬流產沙門氏菌的PCR檢測試劑盒，具體內容是利用試劑盒中自行設計的特異引物，結合PCR檢測方法檢測馬流產沙門菌，為馬流產沙門菌的檢測提供了一種特異、敏感、快速的方法。
技術背景
[0002]馬副傷寒性流產是由馬流產沙門氏桿菌所引起的馬屬動物的一種慢性傳染病，在臨床上無明顯的全身癥狀，以孕馬突然流產為特征。該病廣泛地分布于世界各國，在歐洲18-19世紀大批流行，1893年由Smith和hlome發現本菌后，在世界各地均發現此病。渡部氏于1939年曾報告在內蒙海拉爾地區某些馬場中發現本病，1958年河北省壩上地區某些馬場中亦有發生。1959和1963年察北牧場流產80余匹，流產率分別達53%以上。
[0003]準確而快速的診斷是控制疾病的關鍵，在疾病暴發時顯得尤其重要。診斷的速度決定疾控響應的速度，而疾控響應的速度又決定疾病傳播的范圍、疾病控制的成敗和經濟損失的程度。在我國隨著養馬業的快速發展對馬流產的診斷也越來越受重視。
[0004]馬流產沙門菌傳統的診斷方法主要依靠流產病原材料中病原微生物學分離、培養和生化試驗等進行鑒定。這種方法存在諸多局限性，如馬流產沙門菌在生化試驗時往往出現不一致現象，可靠性差。另外檢測周期長，一般至少需要7~14d才能做出結果，極不利于對患馬進行及時治療。此外一些養殖場特別是發展中國家的普遍使用抗生素使得檢測沙門氏菌較困難。
[0005]隨著分子生物學技術的發展，許多新的分子生物學技術正在被用來進行馬流產沙門菌的分離鑒定。最近幾年出現了一些新的檢測方法，如:膠乳凝集反應，酶聯免疫吸附試驗，免疫熒光試驗、和DNA雜交試驗。這些方法雖然快速但特異性差，且免疫方法檢測沙門氏菌的檢出率較低，從而限制了它們的推廣和應用。
[0006]PCR技術近年來在檢測沙門氏菌方面得到了廣泛的應用，其具有敏感性高、特異性強、快速、簡便、能高通量檢測、重復性好等突出優點。總之PCR技術的應用很大程度上彌補了傳統鑒定方法的弊端。PCR法已被證明可為檢測沙門氏菌提供一個新方法。PCR診斷方法與傳統的形態染色、培養特性和生化鑒定方法相比較，能夠提高檢測靈敏度、縮短檢測時間、簡化檢測程序，實現檢測的自動化、快速化、特異化，在沙門氏菌的臨床診斷中具有重要的應用價值。
[0007]國內目前對馬流產沙門氏菌的研究較少，診斷也主要依靠傳統的分離、培養和生化試驗等進行鑒定，這些方法過程復雜，周期長，所需試劑繁多，可靠性差。目前PCR技術在檢測馬流產沙門氏菌方面的研究和應用還尚未見報道。
[0008]發明目的
[0009]針對目前國內馬業快速發展及馬流產沙門菌病診斷和研究中對于快速簡便診斷方法的需求，本發明提供了一種馬流產沙門菌PCR檢測試劑盒及其檢測方法。根據已發表的馬流產沙門菌基因序列，設計合成引物，擴增得到了 1300bp的基因產物。該PCR診斷方法與傳統的形態染色、培養特性和生化鑒定方法相比較，具有快速、準確的優點，并且具特異性好，靈敏度高，在該病的臨床診斷中具有重要的應用價值。
【發明內容】
[0010]本發明建立的馬鏈球菌馬亞種PCR診斷方法具有以下特征:
[0011](I)自行設計的鑒定引物，利用PCR方法擴增基因片段，擴增引物正向引物為上游引物是 5 ’ ATTAGTGCCGGTTTTATCGT3，下游引物是 5 ’ TTACCACTCGCATCAAATC3，經該引物的擴增應得到1300bp的條帶。
[0012](2)對被檢細菌的基因組的PCR擴增。
[0013]將提取馬流產沙門菌基因組DNA，經PCR擴增后，得到1300bp的條帶，與預期目的片段大小相符。
[0014](3)對建立的馬流產沙門菌PCR診斷試劑盒及方法的敏感性檢測。
[0015]提取細菌的基因組DNA，進行5倍梯度稀釋，對提取各稀釋度基因組DNA按最適條件進行PCR反應，以確定本方法對該菌的檢測限。
[0016](4)建立的馬流產沙門菌PCR診斷試劑盒及方法的特異性的檢測。
[0017]利用所建立的馬流產沙門氏菌PCR方法擴增經煮沸法提取的試驗菌株的基因組DNA,驗證本方法的特異性。
[0018]發明效果
[0019](I)與傳統和現有的方法相比該PCR檢測試劑盒的檢測法具有操作簡便的特點。
[0020](2)與傳統和現有的方法相比該PCR檢測試劑盒的檢測法具有檢測速度快的優點。
[0021](3)該PCR檢測試劑盒的檢測法具有靈敏度高的特點。
[0022](4)該PCR檢測試劑盒的檢測法具有特異性強的特點，非常適用于馬流產沙門氏菌的準確的檢測與診斷。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023]圖1是馬流產沙門氏菌標準菌株的PCR擴增產物于1%瓊脂糖凝膠中進行電泳結果圖。
M:DL2000DNA Marker ；1:陽性菌株2:陰性對照菌株。
[0024]圖2是馬流產沙門氏菌PCR檢測試劑盒的敏感性檢測結果圖。
M =DNAMarker DL20001:基因組未稀釋的2:基因組10倍稀釋3:基因組20倍稀釋4:基因組50倍稀釋5:基因組100倍稀釋6:基因組200倍稀釋7:基因組500倍稀釋8:基因組103倍稀釋9:基因組104倍稀釋。
[0025]圖3是建立的馬流產沙門氏菌PCR檢測試劑盒的特異性的檢測結果圖。
M:DNA Marker DL20001:馬流產沙門氏菌的標準菌株；2:金黃色葡萄球菌分離株3:鏈球菌獸疫亞種標準菌株4:大腸桿菌的標準菌株5:大腸桿菌DH5a菌株6:大腸桿菌BL21菌株。
具體實施方案[0026]為了更好地理解本發明，通過以下實施實例予以進一步說明，但并非對本發明的限定。
[0027]實施例1:被檢細菌基因組的提取及目標基因的PCR擴增。
[0028]基因組的提取
[0029]將純化好的菌株接種于3mL的液體培養基中，過夜培養。具體方法如下:
[0030](I)取過夜培養的1.5mL菌液，離心，棄去培養基，再用滅菌去離子水，400uL旋沉淀，充分混勻后，再次離心，12000rpm, 5min。重復上述操作一次。
[0031](2)棄去上清后，加入400uL的TE緩沖液，充分混勻后加入IOOuL (20mg/mL)溶菌酶和5uL的RNA酶，再次充分混勻后，37°C水浴lh30min。
[0032](3)加入80uL10% SDS溶液，充分混勻后，37°C水浴lh30min。
[0033](4)加入 IOOuL 5mol/L Nacl 溶液和 80uL CTAB/Nacl 溶液，充分混勻，37°C水浴30min, -20°C放置 20min。
[0034](5)加入500uL酚:氯仿抽提液(酚:氯仿:異戊醇=25: 24:1)，充分混勻，12000rpm，離心lOmin。輕輕的吸取上清，轉移至另一干凈的離心管中。
[0035](6)重復(5) —次
[0036](7)加入0.1倍體積的醋酸鈉(pH = 5.2)和0.6倍體積的異戊醇，輕輕的顛倒混勻，-20°C放置 20min。
`[0037](8)離心 12000rpm, IOmin,棄上清，沉淀用 70 % 乙醇 400ul 清洗沉淀，12000rpm,Smin離心，用移液器輕輕的吸出上清，敞開管口，置于室溫，待乙醇揮發完全。加入20uL的TE緩沖液，充分溶解沉淀，-20°C凍存備用。
[0038]將提取后的基因組進行凝膠電泳鑒定。
[0039]目的基因的PCR擴增
[0040]PCR反應體系(20uL):無酶水8.5uL，taq酶混合物10uL，上游引物0.5uL，下游引物 0.5uL，模板 0.5uL。
[0041]PCR擴增程序為:94°C預變性5min，94°C變性30S，54°C退火30S，72°C延伸90S，循環30次，72°C延伸10min，4°C保溫。
[0042]PCR產物用I %的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，片段長度約為1300bp的陽性產物。
[0043]實施例2:對建立的馬流產沙門菌PCR診斷試劑盒及方法的敏感性檢測。
[0044]初始濃度為57ng/ μ L的被檢菌基因組DNA經200倍稀釋后仍能觀察到擴增條帶(見圖2)，表明本PCR方法對培養菌DNA的檢測靈敏度約為5.7pg。
[0045]實施例3:建立的馬流產沙門菌PCR診斷試劑盒及方法的特異性的檢測。
[0046]利用建立的沙門氏菌PCR方法對數株細菌進行特異性檢測，沙門氏菌為陽性，而其他菌株均表現陰性(見圖3)，說明本研究建立的PCR方法具有特異性。
【權利要求】
1.一種用于馬流產沙門氏菌PCR檢測試劑盒包括引物，dNTP、緩沖液和DNA聚合酶，其特征在于，其中的上游引物是5’ ATTAGTGCCGGTTTTATCGT 3’，下游引物是5’ TTACCACTCGCATCAAATC 3’。
2.根據權利要求1所述的的特異性引物對被檢測的細菌基因組進行PCR擴增應得到1300bp的PCR擴增產物。
3.根據權利要求1所述的馬流產沙門氏菌PCR檢測試劑盒，該診斷方法應當具有的敏感性為30個菌或5.7pg的模板DNA。
4.根據權利要求1所述的馬流產沙門氏菌PCR檢測試劑盒，其特征是該試劑盒對金黃色葡萄球菌，大腸桿菌35218，大腸桿菌DH5 α，大腸桿菌BL21以及獸疫鏈球菌等的擴增呈陰性結果。
5.根據權利要求1所述的馬流產沙門氏菌PCR檢測試劑盒包括其在馬流產沙門菌病的臨床診斷和研究中的應 用。
【文檔編號】C12Q1/68GK103484537SQ201310298849
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年7月17日 優先權日:2013年7月17日
【發明者】蘇艷, 邵俊高, 楊康, 張寶江 申請人:新疆農業大學