一種馬腺疫鏈球菌的pcr檢測試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發明涉及一種可用于檢測馬腺疫鏈球菌(又稱馬鏈球菌馬亞種)的PCR檢測試劑盒，包括引物、dNTP、緩沖液和DNA聚合酶，其中的上游物是5’-CTATTAAAGTCTCCATTG-3’，下游引物是5'-AATGTTGTTCAAGCAAATTC-3’；PCR檢測方法：提供待測樣品模板；在PCR簿壁管中加入dNTP、10×buffer、引物、DNA聚合酶、待測樣品和ddH2O，混勻；令簿壁管中的混合物在PCR儀上擴增；在電泳設備中電泳擴增產物；分析并進行結果判斷。該PCR試劑盒配制方法簡便，易于產業化生產，PCR檢測方法檢測馬腺疫鏈球菌的靈敏度高、檢測周期短、速度快、可操作性強、其檢測精度達80個菌的模板DNA，而檢測成本卻相對較低，在該病的臨床診斷中具有重要的應用價值。
【專利說明】—種馬腺疫鏈球菌的PCR檢測試劑盒及其檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物生物【技術領域】，具體內容是關于一種可用于檢測馬腺疫鏈球菌(又稱馬鏈球菌馬亞種)的PCR檢測試劑盒，包括引物、dNTP、緩沖液和DNA聚合酶，其中的上游引物是 5’ -CTATTAAAGTCTCCATTG-3’，下游引物是 5’ -AATGTTGTTCAAGCAAATTC-3，；PCR檢測方法:提供待測樣品模板；在PCR簿壁管中加入dNTP、10 Xbuffer、引物、DNA聚合酶、待測樣品和ddH20，混勻；令簿壁管中的混合物在PCR儀上擴增；在電泳設備中電泳擴增產物；分析并進行結果判斷。 技術背景
[0002]馬腺疫鏈球菌(Streptococcus,equi subsp equi)能夠引起馬腺疫(Stangles),該病在一些發達國家流行并造成嚴重的經濟損失，是一種高度接觸性疫病，主要是在馬頸部和頭部出現化膿性淋巴管炎。因此，迫切需要對馬腺疫鏈球菌進行究。美、英等國家一直十分重視馬腺疫鏈菌的免疫和診斷研究。隨著我國養馬業的快速發展馬腺疫的防制也越來越受重視。
[0003]準確而快速的診斷是控制疾病的關鍵，在疾病暴發時顯得尤其重要。因為診斷的準確性決定疾控靶標的準確性，診斷的速度決定疾控響應的速度，而疾控響應的速度又決定疾病傳播的范圍、疾病控制的成敗和經濟損失的程度。
[0004]馬鏈球菌傳統的診斷方法主要依靠膿汁中病原微生物學分離、培養和生化試驗等進行鑒定。這種方法存在諸多局限性，如馬鏈球菌在生化試驗時往往出現不一致現象，可靠性差。另外檢測周期長，一般至少需要5~7d才能做出結果，不利于對患馬進行及時治療。
[0005]隨著分子生物學技術的發展，許多新的分子生物學技術正在被用來進行鏈球菌的分離鑒定。尤其是PCR技術近年來在檢測致病菌方面得到了廣泛的應用，其具有敏感性高、特異性強、快速、簡便、能高通量檢測、重復性好等突出優點。總之PCR技術的應用很大程度上彌補了傳統鑒定方法的弊端。
[0006]目前國內對馬腺疫的診斷方面的研究極少，目前對該菌的檢測仍普遍采用分離培養、生化鑒定、血清分型的傳統方法，耗時耗力，不適用生產中對檢測的需求。也有研究采用了 16SrDNA技術做輔助診斷，該診斷技術仍需要測序和序列分析進行驗證，并且特異性不強，使檢測周期延長(陳新華，康立超，黃新等，馬腺疫鏈球菌的分離與鑒定，中國獸醫雜志，2013 1(49):38-39)，不能滿足目前臨床及生產實踐中對該病快速簡便準確的診斷方法的需求。
[0007]發明目的
[0008]針對目前在馬腺疫的診斷和研究中對于快速簡便診斷方法的需求，本發明提供了一種馬腺疫鏈球菌PCR檢測試劑盒。根據已發表的馬鏈球菌基因序列，設計合成引物，擴增得到了 567bp的基因產物。該PCR診斷方法與傳統的形態染色、培養特性和生化鑒定方法相比較，具有快速、準確的優點，并且具有特異性好，靈敏度高的特點，在該病的臨床診斷中具有重要的應用價值。
【發明內容】
[0009]本發明建立的馬鏈球菌馬亞種PCR診斷方法具有以下特征:
[0010](I)自行設計的引物，利用PCR方法擴增基因片段，擴增上游引物為5-CTATTAAAGTCTCCATTG-3’，下游引物是 5’ -AATGTTGTTCAAGCAAATTC-3’ ；經該引物的擴增應得到567bp的條帶。
[0011](2)對被檢細菌的基因組的PCR擴增。
[0012]將提取馬腺疫鏈球菌基因組DNA，經PCR擴增后，得到567bp的條帶，與預期目的片段大小相符。
[0013](3)對建立的馬腺疫鏈球菌PCR檢測試劑盒的敏感性檢測。
[0014]取馬腺疫鏈球菌過夜培養物，用血球計數板計數，將菌液按106，IO5, IO4, IO3等，以10倍系列稀釋，取DNA進行PCR反應。
[0015](4)建立的馬腺疫鏈球菌PCR檢測試劑盒的特異性的檢測。
[0016]選取金黃色葡萄球菌分離株GW2-1，沙門氏菌，大腸桿菌，以及獸疫鏈球菌等檢測馬腺疫鏈球菌PCR檢測試劑盒的特異性。
[0017]發明效果
[0018](1)與傳統和現有的馬腺疫檢測方法相比該PCR檢測試劑盒的檢測法具有操作簡便的特點。
[0019](2)與傳統和現有的方法相比該PCR檢測試劑盒的檢測法具有檢測速度快的優點。
[0020](3)該PCR檢測試劑盒的檢測法具有靈敏度高的特點。
[0021](4)該PCR檢測試劑盒的檢測法具有特異性強的特點，非常適用于馬腺疫鏈球菌的準確的檢測與診斷。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022]圖1是馬腺疫鏈球菌標準菌株的PCR擴增產物于1%瓊脂糖凝膠中進行電泳結果圖。
M.DL2000DNAMarker ；1.陽性標準菌株2.陰性對照3.空白對照
[0023]圖2是馬腺疫鏈球菌PCR檢測試劑盒的敏感性檢測結果圖。
M.DL2000DNA Marker ；1.1XlO2倍稀釋馬鏈球菌馬亞種基因組；2.1XlO3倍稀釋馬鏈球菌馬亞種基因組；3.1 X IO4倍稀釋馬鏈球菌馬亞種基因組；4.1 X IO5倍稀釋馬鏈球菌馬亞種基因組；5.1 X IO6倍稀釋馬鏈球菌馬亞種基因組；6.1 X IO7倍稀釋馬鏈球菌馬亞種基因組；
[0024]圖3是建立的馬腺疫鏈球菌PCR檢測試劑盒的特異性的檢測結果圖。
M.DL2000DNAMarker ；1.馬鏈球菌馬亞種2.馬鏈球菌獸疫亞種；3.乳酸菌；4.沙門氏
菌；
5.金黃色葡萄球菌25213 ;6.大腸桿菌35218 ;7.大腸桿菌DH5 α ；8.空白對照具體實施方案[0025]為了更好地理解本發明，通過以下實施實例予以進一步說明，但并非對本發明的限定。
[0026]實施例1:被檢細菌基因組的提取及目的基因的PCR擴增。
[0027]基因組的提取
[0028]將純化好的菌株接種于3mL的TH液體培養基中，過夜培養。具體方法如下:
[0029](I)取過夜培養的1.5mL菌液，離心，棄去培養基，再用滅菌去離子水，400uL旋沉淀，充分混勻后，再次離心，12000rpm, 5min。重復上述操作一次。
[0030](2)棄去上清后，加入400uL的TE緩沖液，充分混勻后加入IOOuL (20mg/mL)溶菌酶和5uL的RNA酶，再次充分混勻后，37°C水浴lh30min。
[0031](3)加入80uL10% SDS溶液，充分混勻后，37°C水浴lh30min。
[0032](4)加入 100uL5mol/L Nacl 溶液和 80uL CTAB/Nacl 溶液，充分混勻，37°C水浴30min, -20°C放置 20min。
[0033](5)加入500uL酚:氯仿抽提液(酚:氯仿:異戊醇=25: 24: 1，充分混勻，12000rpm，離心lOmin。輕輕的吸取上清，轉移至另一干凈的離心管中。
[0034](6)重復(5) —次。
[0035](7)加入0.1倍體積的醋酸鈉(pH = 5.2)和0.6倍體積的異戊醇，輕輕的顛倒混勻，-20°C放置 20min。
[0036](8)離心 12000rpm, IOmin,棄上清，沉淀用 70 % 乙醇 400ul 清洗沉淀，12000rpm,Smin離心，用移液器輕輕的吸出上清，敞開管口，置于室溫，待乙醇揮發完全。加入20uL的TE緩沖液，充分溶解沉淀，-20°C凍存備用。
[0037]將提取后的基因組進行凝膠電泳鑒定。
[0038]目的基因的PCR擴增
[0039]PCR反應體系(20uL):滅菌雙蒸水IluL, Taq酶IuL, IOXbuffer 2uL，上游引物0.5uL，下游引物 0.5uL，模板 IuL, dNTP 4uL。
[0040]PCR擴增程序為:94°C預變性5min，94°C變性30S，53°C退火30S，72°C延伸90S，循環30次，72°C延伸10min，4°C保溫。
[0041]如圖1所示PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，可擴增得到片段長度約為567bp的陽性產物。
[0042]實施例2:馬腺疫鏈球菌PCR檢測試劑盒的敏感性檢測。
[0043]如圖2所示取馬腺疫鏈球菌過夜培養物，用血球計數板計數，將菌液按106，105，IO4, IO3,10倍稀釋，提取DNA進行PCR反應。對檢測結果的分析顯示所建立的馬腺疫鏈球菌PCR檢測試劑盒最小檢測限為80cfu。
[0044]實施例3:建立的馬腺疫鏈球菌PCR檢測試劑盒的特異性的檢測。
[0045]選取金黃色葡萄球菌，沙門氏菌，大腸桿菌，以及獸疫鏈球菌等檢測馬腺疫鏈球菌PCR檢測試劑盒的特異性。從圖3中可見，僅馬腺疫鏈球菌標準菌的DNA中出現了與目的片段大小一致的條帶，該檢測方法可以用于在馬群中特異性檢測馬腺疫鏈球菌。
【權利要求】
1.一種用于馬腺疫鏈球菌PCR檢測試劑盒包括引物，dNTP、緩沖液和DNA聚合酶，其特征在于，其中的上游引物是5’ -CTATTAAAGTCTCCATTG-3’，下游引物是5’-AATGTTGTTCAAGCAAATTC-3?。
2.根據權利要求1所述的的特異性引物對被檢測的細菌基因組進行PCR擴增應得到567bp的PCR擴增產物。
3.根據權利要求1所述的馬腺疫鏈球菌PCR檢測試劑盒，該診斷方法應當具有的敏感性為80個菌的模板DNA。
4.根據權利要求1所述的馬腺疫鏈球菌PCR檢測試劑盒，其特征是該試劑盒對金黃色葡萄球菌，沙門氏菌，大腸桿菌，以及獸疫鏈球菌等的擴增呈陰性結果。
5.根據權利要求1所述的馬腺疫鏈球菌PCR檢測試劑盒包括其在馬腺疫臨床診斷和研究中的應用。`
【文檔編號】C12Q1/68GK103555819SQ201310298835
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年7月17日 優先權日:2013年7月17日
【發明者】蘇艷, 劉云濤, 王彩蝶, 張寶江 申請人:新疆農業大學