楊屬派間不同種親緣關系的鑒定方法及鑒定試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種楊屬派間不同種親緣關系的鑒定方法及鑒定試劑盒。其中，該方法包括以下步驟：S1，采用多態性微衛星DNA引物對對楊樹進行基因分型，構建種間個體的微衛星DNA指紋圖譜；S2，采用多態性微衛星DNA引物對對待鑒定楊樹進行基因型擴增，并根據微衛星DNA指紋圖譜判斷待鑒定楊樹的親緣關系；其中，多態性微衛星DNA引物對包括：引物對1、引物對2、引物對3、引物對4和引物對5。應用本發明的技術方案，利用5對多態性高且兩兩不發生相互作用的微衛星DNA引物組合構建微衛星DNA指紋圖譜，然后通過微衛星DNA指紋圖譜判斷楊屬派間不同種親緣關系。本發明的方法快速、高效、穩定，適用于楊樹不同生長時期。
【專利說明】楊屬派間不同種親緣關系的鑒定方法及鑒定試劑盒
【技術領域】
[0001] 本發明涉及分子遺傳學【技術領域】，具體而言，涉及一種楊屬派間不同種親緣關系 的鑒定方法及鑒定試劑盒。
【背景技術】
[0002] 楊樹（Populus )是北半球重要的森林樹種，其種類豐富、分布廣泛、速生高產，在工 業生產及環境保護等方面具有舉足輕重的地位。我國處于世界楊樹中心分布區域，據徐緯 英（1988)統計，我國獨有的鄉土楊樹樹種達53種之多，因此，豐富的遺傳變異資源為楊樹 遺傳改良及群體進化遺傳學研究等奠定了基礎，同樣也為我們對其更好的保護和利用提出 了挑戰。然而，以無性繁殖為主要繁殖方式的楊樹，目前同物異名、同名異物現象相當嚴重， 迫切需要建立一套準確、高效、穩定的種間鑒定技術。
[0003] DNA指紋圖譜技術主要利用分子標記方法檢測并比較種間個體基因組DNA水平的 遺傳變異；不受組織、發育時期、季節環境限制，且遺傳信息含量豐富、多態性高，適合于分 析楊樹這樣種類豐富、育種周期較長、應用價值高的植物群體。高質量的指紋圖譜可為新品 種登記、注冊和產權保護提供技術保障，也為實施雜交育種改良提供重要的理論依據。與表 型性狀、染色體核型分析、同工酶分析等鑒定方法相比，借助于分子標記技術的DNA指紋圖 譜技術為品種和無性系的鑒定提供了新的手段。
[0004] 目前，國內雖然已構建了部分楊樹品種的AFLP指紋圖譜(宋紅竹，楊屬AFLP遺傳 多樣性研究和楊樹品種分子指紋圖譜構建，2005)，但其供試材料數目較少，且AFLP技術操 作程序復雜，對DNA質量及其酶切條件要求較高，結果穩定性差。因此，限制了該技術構建 的指紋圖譜廣泛應用于種質鑒定。因此，在當今分子標記輔助選擇育種策略逐漸被應用于 林木遺傳改良的時代，建立一種高效、穩定、易操作的方法，顯得十分迫切和必要。
【發明內容】
[0005] 本發明旨在提供一種楊屬派間不同種親緣關系的鑒定方法及鑒定試劑盒，以解決 現有技術中楊樹種間個體鑒定方法復雜及穩定性差的技術問題。
[0006] 為了實現上述目的，根據本發明的一個方面，提供了一種楊屬派間不同種親緣關 系的鑒定方法。該方法包括以下步驟：S1，采用多態性微衛星DNA引物對對楊樹進行基因分 型，構建種間個體的微衛星DNA指紋圖譜；S2,采用多態性微衛星DNA引物對對待鑒定楊樹 進行基因型擴增，并根據微衛星DNA指紋圖譜判斷待鑒定楊樹的親緣關系；其中，多態性微 衛星DNA引物對包括：引物對1、引物對2、引物對3、引物對4和引物對5，引物對1的堿基序 列為SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2 ;引物對2的堿基序列為SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO:4 ; 弓丨物對3的堿基序列為SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6;引物對4的堿基序列為SEQ ID NO: 7 和SEQ ID NO:8 ;引物對5的堿基序列為SEQ ID NO:9和SEQ ID NO: 10。
[0007] 進一步地，多態性微衛星DNA引物對中的正向引物的5'端采用熒光基團修飾，熒 光基團選自FAM、HEX或ROX中的一種。
[0008] 進一步地，步驟SI包括：提取各待鑒定楊樹DNA，采用多態性微衛星DNA引物對分 別對各待鑒定楊樹DNA進行PCR擴增，得PCR擴增產物；將PCR擴增產物進行毛細電泳檢 測，并將毛細電泳檢測的結果進行聚類分析，構建微衛星DNA指紋圖譜。
[0009] 進一步地，PCR擴增的條件是：94°C預變性5min，94°C變性30s，56°C退火30s，72°C 延伸lmin，35個循環，然后72°C延伸lOmin。
[0010] 進一步地，PCR擴增的體系為：多態性微衛星DNA引物對的濃度均為0. 3mol/ μ 1， 3·5μ 12 X PCR QIAGEN Multiplxe PCR Master Mix，2·0μ I DNA 模板，無菌水補至10μ 1。 toon] 根據本發明的另一個方面，提供一種楊屬派間不同種親緣關系的鑒定試劑盒。該 試劑盒包括多態性微衛星DNA引物對，多態性微衛星DNA引物對包括：引物對1、引物對2、 引物對3、引物對4和引物對5,引物對1的堿基序列為SEQ ID NO: 1和SEQ ID Ν0:2 ;引物 對2的堿基序列為SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4 ;引物對3的堿基序列為SEQ ID NO:5和 SEQ ID NO:6 ;引物對4的堿基序列為SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8 ;引物對5的堿基序列 為 SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO:10。
[0012] 進一步地，多態性微衛星DNA引物對中的正向引物的5'端采用熒光基團修飾，熒 光基團選自FAM、HEX或ROX中的一種。
[0013] 進一步地，多態性微衛星DNA引物對進行PCR擴增的條件是：94°C預變性5min， 94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸lmin，35個循環，然后72°C延伸10min。
[0014] 進一步地，多態性微衛星DNA引物對進行PCR擴增的體系為：多態性微衛星DNA引 物對的濃度均為 〇· 3mol/μ 1，3· 5μ 12 XPCR QIAGEN Multiplxe PCR Master Mix，2· 0μ 1 DNA模板，無菌水補至10 μ 1。
[0015] 應用本發明的技術方案，利用5對多態性高且兩兩不發生相互作用的微衛星DNA 引物組合構建微衛星DNA指紋圖譜，然后通過微衛星DNA指紋圖譜判斷楊屬派間不同種親 緣關系。本發明的方法快速、高效、穩定，適用于楊樹不同生長時期，易于自動化，在楊樹遺 傳學研究、種質鑒定及品種保護等方面都有著廣泛的應用前景，且部分引物擴增位點具有 楊樹派的特異性(青楊派為218bp，黑楊派為179bp)，為林木進化遺傳學研究以及楊樹種間 鑒定提供了直接有力的技術支持。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016] 構成本申請的一部分的說明書附圖用來提供對本發明的進一步理解，本發明的示 意性實施例及其說明用于解釋本發明，并不構成對本發明的不當限定。在附圖中：
[0017] 圖1示出了利用Multiplex Manager軟件，根據片段長度設計出的引物組合；以及
[0018] 圖2示出了擴增產物片段長度構建楊屬派間不同種的微衛星DNA指紋圖譜，引物 組的5對引物擴增片段大小從低到高依次對應圖1中的Populus SSR PrimerOl-Populus SSR Primer05〇
【具體實施方式】
[0019] 需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請中的實施例及實施例中的特征可以相 互組合。下面將參考附圖并結合實施例來詳細說明本發明。
[0020] 本發明針對應用傳統類型的指紋圖譜進行種質鑒定穩定性差、實驗操作復雜的不 足，提供了一種高效、便捷的對我國常見楊樹種質進行親緣關系鑒定的引物和方法，并構建 了楊樹不同種的微衛星DNA指紋圖譜，為后續的楊樹種質鑒定及分子標記輔助育種提供了 重要的技術支持。
[0021] 微衛星DNA標記，又稱簡單序列重復（Simple Sequence Repeat, SSR)是近些年 來發展良好，建立在聚合酶鏈式反應（PCR)擴增基礎上的理想分子標記類型，其具有可靠性 強、實驗重復性高、多態性豐富、種間轉移性高及共顯性等優點。特別是近幾年借助高通量 測序技術，在植物中開發出多種不同類型的微衛星DNA標記，使利用微衛星DNA標記進行屬 內近緣種的遺傳多樣性分析、指紋圖譜構建、及親緣關系鑒定等方面具有重要的發展潛力。 本發明的楊屬派間不同種親緣關系的鑒定方法和鑒定試劑盒正是基于此研發出來的。另 夕卜，本發明中引物的開發還參考了文獻（Du等，DNA Research (2013) 20, 31-44)和公共數據 庫（http://www. ornl. gov/sci/ipgc/ssr_resource. htm)〇
[0022] 根據本發明一種典型的實施方式，提供一種楊屬派間不同種親緣關系的鑒定方 法。該鑒定方法包括以下步驟：S1，采用多態性微衛星DNA引物對對楊樹進行基因分型，構 建種間個體的微衛星DNA指紋圖譜；S2,采用所述態性微衛星DNA引物對待鑒定楊樹進行 基因擴增，并根據微衛星DNA指紋圖譜判斷楊屬派間不同種親緣關系；其中，多態性微衛星 DNA引物對包括：引物對1、引物對2、引物對3、引物對4和引物對5，引物對1的堿基序列 為 SEQ ID N0:1 和 SEQ ID N0:2 ;引物對 2 的堿基序列為 SEQ ID N0:3 和 SEQ ID N0:4 ;弓I 物對3的堿基序列為SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6;引物對4的堿基序列為SEQ ID NO: 7和 SEQ ID N0:8;引物對5的堿基序列為SEQ ID N0:9和SEQ ID NO: 10,具體序列及擴增片段 大小如表1所示。
[0023] 應用本發明的技術方案，利用5對多態性高且兩兩不發生相互作用的微衛星DNA 引物組合構建微衛星DNA指紋圖譜，然后通過微衛星DNA指紋圖譜判斷楊屬派間不同種親 緣關系。本發明的方法快速、高效、穩定，適用于楊樹不同生長時期，易于自動化，在楊樹遺 傳學研究、種質鑒定及品種保護等方面都有著廣泛的應用前景。
[0024] 優選地，多態性微衛星DNA引物對中的正向引物的5'端采用熒光基團修飾，熒光 基團為選自FAM、HEX或ROX中的一種，在氬激光照射下FAM、HEX或ROX分別會顯示藍色、綠 色、和紅色，用于區分不同的PCR產物，這樣可以得到帶有不同熒光標記的擴增結果，有利 于對電泳結果分析。在本發明的一種實施方式中，上述5對引物的修飾如表1中所示。
[0025] 表 1
[0026]
【權利要求】
1. 一種楊屬派間不同種親緣關系的鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟： S1，采用多態性微衛星DNA引物對對楊樹進行基因分型，構建種間個體的微衛星DNA指 紋圖譜； S2,采用所述多態性微衛星DNA引物對對待鑒定楊樹進行基因型擴增，并根據所述微 衛星DNA指紋圖譜判斷所述待鑒定楊樹的親緣關系； 其中，所述多態性微衛星DNA引物對包括：引物對1、引物對2、引物對3、引物對4和 引物對5,所述引物對1的堿基序列為SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2 ;所述引物對2的堿基 序列為SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4 ;所述引物對3的堿基序列為SEQ ID N0:5和SEQ ID NO: 6 ;所述引物對4的堿基序列為SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8 ;所述引物對5的堿基序列 為 SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO:10。
2. 根據權利要求1所述的鑒定方法，其特征在于，所述多態性微衛星DNA引物對中的正 向引物的5'端采用熒光基團修飾，所述熒光基團選自FAM、HEX或R0X中的一種。
3. 根據權利要求1所述的鑒定方法，其特征在于，所述步驟S1進一步包括： 提取各待鑒定楊樹DNA， 采用所述多態性微衛星DNA引物對分別對各所述待鑒定楊樹DNA進行PCR擴增，得PCR 擴增產物； 將所述PCR擴增產物進行毛細電泳檢測，并將所述毛細電泳檢測的結果進行聚類分 析，構建所述微衛星DNA指紋圖譜。
4. 根據權利要求3所述的鑒定方法，其特征在于，所述PCR擴增的條件是：94°C預變性 5min，94°C變性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 lmin，35 個循環，然后 72°C延伸 lOmin。
5. 根據權利要求3所述的鑒定方法，其特征在于，所述PCR擴增的體系為：所述多態性 微衛星 DNA 引物對的濃度均為 0· 3πιο1/μ 1，3· 5μ 12XPCR QIAGEN Multiplxe PCR Master Mix, 2· 0 μ 1 DNA模板，無菌水補至10 μ 1。
6. -種楊屬派間不同種親緣關系的鑒定試劑盒，其特征在于，包括多態性微衛星DNA 引物對，所述多態性微衛星DNA引物對包括：引物對1、引物對2、引物對3、引物對4和引物 對5,所述引物對1的堿基序列為SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2 ;所述引物對2的堿基序列 為SEQIDN0:3和SEQIDN0:4;所述引物對3的堿基序列為SEQIDN0:5和SEQIDN0:6 ; 所述引物對4的堿基序列為SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO:8 ;所述引物對5的堿基序列為SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO:10。
7. 根據權利要求6所述的鑒定試劑盒，其特征在于，所述多態性微衛星DNA引物對中的 正向引物的5'端采用熒光基團修飾，所述熒光基團選自FAM、HEX或R0X中的一種。
8. 根據權利要求6所述的鑒定試劑盒，其特征在于，所述多態性微衛星DNA引物對進行 PCR擴增的條件是：94°C預變性5min，94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸lmin，35個循 環，然后72°C延伸10min。
9. 根據權利要求6所述的鑒定試劑盒，其特征在于，所述多態性微衛星DNA引物 對進行PCR擴增的體系為：所述多態性微衛星DNA引物對的濃度均為0. 3mo 1 / μ 1， 3·5μ 12 XPCRQIAGEN Multiplxe PCR Master Mix，2·0μ 1 DNA模板，無菌水補至 10μ 1。
【文檔編號】C12Q1/68GK104293887SQ201310298553
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2013年7月16日 優先權日:2013年7月16日
【發明者】張德強, 杜慶章, 潘煒 申請人:北京林業大學