一種基于特異引物鑒定5種常見儲糧扁谷盜的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種用于鑒定或輔助鑒定5種常見儲糧扁谷盜的試劑盒。本發明所提供的試劑盒包括如下5個引物對中的至少一對：引物對1（序列1和序列2）、引物對2（序列3和序列4）、引物對3（序列5和序列6）、引物對4（序列7和序列8）和引物對5（序列9和序列10）。實驗證明，利用本發明所提供的試劑盒對儲糧扁谷盜進行種的鑒定，與傳統形態鑒定方法相比，該方法不需要形態分類學基礎且實現了對非成蟲態的鑒定；而與其它分子生物學鑒定方法相比，該方法簡化了鑒定常見儲糧扁谷盜的分子檢測步驟，具有操作簡便、耗時較短、靈敏度高且較穩定，結果直觀等特點，為進一步鑒定扁谷盜屬近緣種的研究奠定了基礎。
【專利說明】—種基于特異引物鑒定5種常見儲糧扁谷盜的試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，涉及一種用于鑒定或輔助鑒定5種常見儲糧扁谷盜的試劑盒。
【背景技術】
[0002]扁谷盜隸屬于鞘翅目(Coleoptera)、扁谷盜科(Laemophloeidae)、扁谷盜屬(Cryptolestes)，該屬國內外共記述有20余種，其中危害儲糧的扁谷盜約為10種，在世界范圍內分布較為廣泛的為銹赤扁谷盜、長角扁谷盜、土耳其扁谷盜和開普扁谷盜等5種。
[0003]鞘翅目昆蟲在儲糧害蟲中數量最大、種類最多、檢疫意義最突出，扁谷盜即是鞘翅目儲糧害蟲中具有重要經濟意義的一個類群，其幼蟲和成蟲可危害谷物、豆類、油料等多種農產品與其加工產品，大量發生時能造成較為嚴重的經濟損失，主要通過農副產品的貿易進行跨境傳播。近年來，我國進出境檢驗檢疫部門截獲的扁谷盜批次明顯增多。明確口岸截獲和糧庫發生的儲糧扁谷盜種類，對檢疫決策制定和有害生物治理具有十分重要的意義。由于扁谷盜個體微小(體長2_左右)且種間外部形態極為相似等原因，傳統的形態學鑒定技術僅能鑒定具有明顯特征形態的成蟲，對鑒定人員的形態分類學技術要求較高，并不能滿足快速、準確鑒定扁谷盜種類的需求。
[0004]近幾年發展起來的分子生物學鑒定方法主要包括同工酶電泳技術、限制性片段長度多態性分析(RFLP)技術、隨機擴增DNA多態性分析(RAPD)技術、核酸序列分析技術及特異引物PCR技術。限制性片段長度多態性PCR技術結果較為準確，但篩選所需限制性內切酶種類的工作量較大。截至目前，未見針對銹赤扁谷盜、長角扁谷盜、微扁谷盜、土耳其扁谷盜和開普扁谷盜這5種世界常見儲糧扁谷盜的分子鑒定技術的報道。
【發明內容】
[0005]本發明的一個目的是提供一種用于鑒定或輔助鑒定儲糧扁谷盜的試劑盒。
[0006]本發明所提供的用于鑒定或輔助鑒定儲糧扁谷盜的試劑盒，可包括如下5個引物對中的至少一對:
[0007](1)由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的引物對I ;
[0008](2)由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的引物對2 ；
[0009](3)由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的引物對3 ；
[0010](4)由序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的引物對4 ；
[0011](5)由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的引物對5。
[0012]其中，序列I由21個核苷酸組成；序列2由20個核苷酸組成；序列3由21個核苷酸組成；序列4由23個核苷酸組成；序列5由22個核苷酸組成；序列6由22個核苷酸組成；序列7由21個核苷酸組成；序列8由22個核苷酸組成；序列9由19個核苷酸組成?’序列10由22個核苷酸組成。
[0013]在所述試劑盒中，組成每個引物對的兩條單鏈DNA的摩爾數相等。[0014]所述儲糧扁谷盜可為如下中的至少一種:銹赤扁谷盜、長角扁谷盜、微扁谷盜、土耳其扁谷盜和開普扁谷盜。
[0015]在所述試劑盒中，所述引物對I特異于銹赤扁谷盜；所述引物對2特異于長角扁谷盜；所述引物對3特異于微扁谷盜；所述引物對4特異于土耳其扁谷盜；所述引物對5特異于開普扁谷盜。
[0016]本發明的再一個目的是提供所述試劑盒的制備方法。
[0017]所述試劑盒的制備方法，具體可包括如下步驟:將組成所述試劑盒中各引物對的各單鏈DNA分別單獨包裝后，與下述物質中的至少一種包裝在同一試劑盒內:PCR反應緩沖液、DNA聚合酶和4種dNTP。
[0018]本發明的還一個目的是提供一種鑒定或輔助鑒定儲糧扁谷盜的方法。
[0019]本發明所提供的鑒定或輔助鑒定儲糧扁谷盜的方法，可為如下(a)_ (e)中的任一種:
[0020](a)鑒定或輔助鑒定待測儲糧扁谷盜是否為銹赤扁谷盜的方法，包括如下(al)和(a2)的步驟:
[0021](al)以所述待測儲糧扁谷盜的基因組DNA為模板，用由序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的引物對I進行PCR擴增；
[0022](a2)檢測步驟(al)得到的PCR產物的大小，按照如下方法根據PCR產物確定所述待測儲糧扁谷盜是否為銹赤扁谷盜:若所述PCR產物中含有158bp的DNA片段，則所述待測儲糧扁谷盜為或候選為銹赤扁谷盜；反之，則所述待測儲糧扁谷盜不為或候選不為銹赤扁谷盜；
[0023](b)鑒定或輔助鑒定待測儲糧扁谷盜是否為長角扁谷盜的方法，包括如下(bl)和(b2)的步驟:
[0024](bl)以所述待測儲糧扁谷盜的基因組DNA為模板，用由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的引物對2進行PCR擴增；
[0025](b2)檢測步驟(bl)得到的PCR產物的大小，按照如下方法根據PCR產物確定所述待測儲糧扁谷盜是否為長角扁谷盜:若所述PCR產物中含有371bp的DNA片段，則所述待測儲糧扁谷盜為或候選為長角扁谷盜；反之，則所述待測儲糧扁谷盜不為或候選不為長角扁谷盜；
[0026](C)鑒定或輔助鑒定待測儲糧扁谷盜是否為微扁谷盜的方法，包括如下(Cl)和(c2)的步驟:
[0027](Cl)以所述待測儲糧扁谷盜的基因組DNA為模板，用由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的引物對3進行PCR擴增；
[0028](c2)檢測步驟(Cl)得到的PCR產物的大小，按照如下方法根據PCR產物確定所述待測儲糧扁谷盜是否為微扁谷盜:若所述PCR產物中含有585bp的DNA片段，則所述待測儲糧扁谷盜為或候選為微扁谷盜；反之，則所述待測儲糧扁谷盜不為或候選不為微扁谷盜；
[0029](d)鑒定或輔助鑒定待測儲糧扁谷盜是否為土耳其扁谷盜的方法，包括如下(dl)和(d2)的步驟:
[0030](dl)以所述待測儲糧扁谷盜的基因組DNA為模板，用由序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的引物對4進行PCR擴增；[0031](d2)檢測步驟(dl)得到的PCR產物的大小，按照如下方法根據PCR產物確定所述待測儲糧扁谷盜是否為土耳其扁谷盜:若所述PCR產物中含有355bp的DNA片段，則所述待測儲糧扁谷盜為或候選為土耳其扁谷盜；反之，則所述待測儲糧扁谷盜不為或候選不為土耳其扁谷盜；
[0032](e)鑒定或輔助鑒定待測儲糧扁谷盜是否為開普扁谷盜的方法，包括如下(el)和(e2)的步驟:
[0033](el)以所述待測儲糧扁谷盜的基因組DNA為模板，用由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的引物對5進行PCR擴增；
[0034](e2)檢測步驟(el)得到的PCR產物的大小，按照如下方法根據PCR產物確定所述待測儲糧扁谷盜是否為開普扁谷盜:若所述PCR產物中含有289bp的DNA片段，則所述待測儲糧扁谷盜為或候選為開普扁谷盜；反之，則所述待測儲糧扁谷盜不為或候選不為開普扁谷盜。
[0035]在上述方法中，步驟(a)_步驟(e)中，所有的所述進行PCR擴增的退火溫度均為50。。。
[0036]在上述方法中，所述引物對1、所述引物對2、所述引物對3、所述引物對4和所述引物對5，組成每個引物對的兩條單鏈DNA在各自的PCR反應體系中的摩爾比均為1:1。在本發明中，每個引物對的兩條單鏈DNA在各自的PCR反應體系中的摩爾濃度均為0.2 μ M。
[0037]在上述方法中，步驟(a)中，所述158bp的DNA片段的核苷酸序列具體為序列表中序列11 ;步驟(b)中，所 述371bp的DNA片段的核苷酸序列具體為序列表中序列12 ;步驟(c)中，所述585bp的DNA片段的核苷酸序列具體為序列表中序列13 ;步驟(d)中，所述355bp的DNA片段的核苷酸序列具體為序列表中序列14 ;步驟(e)中，所述289bp的DNA片段的核苷酸序列具體為序列表中序列15。
[0038]上述任一所述鑒定或輔助鑒定儲糧扁谷盜的方法中，所述待測儲糧扁谷盜屬于扁谷盜科(Laemophloeidae)的扁谷盜屬(Cryptolestes),具體為銹赤扁谷盜、長角扁谷盜、微扁谷盜、土耳其扁谷盜和開普扁谷盜中的至少一種。
[0039]本發明針對銹赤扁谷盜、長角扁谷盜、微扁谷盜、土耳其扁谷盜和開普扁谷盜這5種世界常見儲糧扁谷盜，基于mtDNA COI基因序列分別設計了特異引物，可直接鑒別以上5種儲糧扁谷盜。與傳統形態鑒定方法相比，該方法不需要形態分類學基礎且實現了對非成蟲態的鑒定；而與其它分子生物學鑒定方法(如限制性片段長度多態性PCR、核酸序列分析)相比，該方法簡化了鑒定常見儲糧扁谷盜的分子檢測步驟，具有操作簡便、耗時較短、靈敏度高且較穩定，結果直觀等特點，為進一步鑒定扁谷盜屬近緣種的研究奠定了基礎。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0040]圖1為用于鑒定銹赤扁谷盜的引物對CF84F21/CF222R20的特異性檢測結果。其中，泳道M為DNA相對分子量標準(DNA Marker II);其他泳道信息為1:開普扁谷盜(捷克布拉格)；2:土耳其扁谷盜(捷克布拉格)；3:土耳其扁谷盜(河南商丘)；4:銹赤扁谷盜(捷克布拉格)；5:銹赤扁谷盜(美國堪薩斯州)6:銹赤扁谷盜(山東濟寧)；7:銹赤扁谷盜(廣東湛江);8，9:微扁谷盜(云南瀘西)；10:長角扁谷盜(捷克布拉格)；11:長角扁谷盜(美國堪薩斯州)；12，13:長角扁谷盜(湖北武漢)；14，15:長角扁谷盜(海南海口)；16:陰性對照(ddH20)。[0041]圖2為用于鑒定長角扁谷盜的引物對CP53F21/CP401R23的特異性檢測結果。其中，泳道M為DNA相對分子量標準(DNA Marker II);其他泳道信息為1:開普扁谷盜(捷克布拉格);2:土耳其扁谷盜(捷克布拉格);3:土耳其扁谷盜(河南商丘);4:銹赤扁谷盜(捷克布拉格)；5:銹赤扁谷盜(美國堪薩斯州)6:銹赤扁谷盜(山東濟寧)；7:銹赤扁谷盜(廣東湛江);8，9:微扁谷盜(云南瀘西)；10:長角扁谷盜(捷克布拉格)；11:長角扁谷盜(美國堪薩斯州)；12，13:長角扁谷盜(湖北武漢)；14，15:長角扁谷盜(海南海口)；16:陰性對照(ddH20)。
[0042]圖3為用于鑒定微扁谷盜的引物對C038F22/C0601R22的特異性檢測結果。其中，泳道M為DNA相對分子量標準(DNA Marker II);其他泳道信息為1:開普扁谷盜(捷克布拉格)；2:土耳其扁谷盜(捷克布拉格)；3:土耳其扁谷盜(河南商丘)；4:銹赤扁谷盜(捷克布拉格)；5:銹赤扁谷盜(美國堪薩斯州)6:銹赤扁谷盜(山東濟寧)；7:銹赤扁谷盜(廣東湛江)；8,9:微扁谷盜(云南瀘西)；10:長角扁谷盜(捷克布拉格)；11:長角扁谷盜(美國堪薩斯州)；12，13:長角扁谷盜(湖北武漢)；14，15:長角扁谷盜(海南海口)；16:陰性對照(ddH20)。
[0043]圖4為用于鑒定土耳其扁谷盜的引物對CT81F21/CT414R22的特異性檢測結果。其中，泳道M為DNA相對分子量標準(DNA Marker II);其他泳道信息為1:開普扁谷盜(捷克布拉格)；2:土耳其扁谷盜(捷克布拉格)；3:土耳其扁谷盜(河南商丘)；4:銹赤扁谷盜(捷克布拉格)；5:銹赤扁谷盜(美國堪薩斯州)6:銹赤扁谷盜(山東濟寧)；7:銹赤扁谷盜(廣東湛江);8，9:微扁谷盜(云南瀘西)；10:長角扁谷盜(捷克布拉格)；11:長角扁谷盜(美國堪薩斯州)；12，13:長角扁谷盜(湖北武漢)；14，15:長角扁谷盜(海南海口)；16:陰性對照(ddH20)。
[0044]圖5為用于鑒定開普扁谷盜的引物對CC82F19/CC349R22的特異性檢測結果。其中，泳道M為DNA相對分子量標準(DNA Marker II);其他泳道信息為1:開普扁谷盜(捷克布拉格);2:土耳其扁谷盜(捷克布拉格);3:土耳其扁谷盜(河南商丘);4:銹赤扁谷盜(捷克布拉格)； 5:銹赤扁谷盜(美國堪薩斯州)6:銹赤扁谷盜(山東濟寧)；7:銹赤扁谷盜(廣東湛江);8，9:微扁谷盜(云南瀘西)；10:長角扁谷盜(捷克布拉格)；11:長角扁谷盜(美國堪薩斯州)；12，13:長角扁谷盜(湖北武漢)；14，15:長角扁谷盜(海南海口)；16:陰性對照(ddH20)。
[0045]圖6為用于鑒定銹赤扁谷盜的引物對CF84F21/CF222R20的靈敏度檢測結果。其中，泳道M為DNA相對分子量標準(DNA Marker I);其他泳道信息為1:DNA模板用量IOng ；2 =DNA模板用量5ng ；3 =DNA模板用量Ing ；4 =DNA模板用量0.5ng ；5 =DNA模板用量0.1ng ；6 =DNA模板用量0.05ng ;7，8:陰性對照(ddH20)。
[0046]圖7為用于鑒定長角扁谷盜的引物對CP53F21/CP401R23的靈敏度檢測結果。其中，泳道M為DNA相對分子量標準(DNA Marker I);其他泳道信息為1:DNA模板用量IOng ；2 =DNA模板用量5ng ；3 =DNA模板用量Ing ；4 =DNA模板用量0.5ng ；5 =DNA模板用量0.1ng ；6 =DNA模板用量0.05ng ;7，8:陰性對照(ddH20)。
[0047]圖8為用于鑒定微扁谷盜的引物對C038F22/C0601R22的靈敏度檢測結果。其中，泳道M為DNA相對分子量標準(DNA Marker I);其他泳道信息為1:DNA模板用量IOng ；2:DNA模板用量5ng ；3:DNA模板用量Ing ；4:DNA模板用量0.5ng ；5:DNA模板用量0.1ng ；6:DNA模板用量0.05ng ;7，8:陰性對照(ddH20)。
[0048]圖9為用于鑒定土耳其扁谷盜的引物對CT81F21/CT414R22的靈敏度檢測結果。其中，泳道M為DNA相對分子量標準(DNA Marker I);其他泳道信息為1:DNA模板用量IOng ；2 =DNA模板用量5ng ；3 =DNA模板用量Ing ；4 =DNA模板用量0.5ng ；5 =DNA模板用量0.1ng ；6:DNA模板用量0.05ng ;7，8:陰性對照(ddH20)。
[0049]圖10為用于鑒定開普扁谷盜的引物對CC82F19/CC349R22的靈敏度檢測結果。其中，泳道M為DNA相對分子量標準(DNA Marker I);其他泳道信息為1:DNA模板用量IOng ；2 =DNA模板用量5ng ；3 =DNA模板用量Ing ；4 =DNA模板用量0.5ng ；5 =DNA模板用量0.1ng ；6 =DNA模板用量0.05ng ;7，8:陰性對照(ddH20)。
【具體實施方式】
[0050]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0051]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0052]5種儲糧扁谷盜:銹赤扁谷盜、長角扁谷盜、微扁谷盜、土耳其扁谷盜和開普扁谷盜。其中，銹赤扁谷盜涉及如下地理種群:捷克布拉格種群、美國堪薩斯州種群、山東濟寧種群、廣東湛江種群；長角扁谷盜涉及如下地理種群:捷克布拉格種群、美國堪薩斯州種群、湖北武漢種群、海南海口種群；微扁谷盜涉及如下地理種群:云南瀘西種群；土耳其扁谷盜涉及如下地理種群:捷克布拉格種群、河南商丘種群；開普扁谷盜涉及如下地理種群:捷克布拉格種群。以上5種儲糧扁谷盜記載在“謝更祥，唐易，張連中等.海南地區扁谷盜抗藥性和實倉防治研究.糧食儲藏 ，2013 (I):9-12”、“祝長清等.河南昆蟲志鞘翅目(一).河南科學技術出版社，1999-12出版”、“蔣慶慈，黃輔元，姜武峰等.幾種主要儲糧害蟲對磷化氫的抗性抽測報告.糧油倉儲科技通訊，1992 (6):46-52”、uZuzana Kucerova, Vaclav Stejskal.Comparative egg morphology of silvanid andalaemophloeid beetles (Coleptera)pccurring in stored products.Journal of StoredProducts Research，2002(38):219-227”、“RENNIE ROESLI, BHADRIRAJU SUBRAMANYAM, etal.Stored-Product Insects Associated with a Retail Pet Store Chain in Kansas.JOURNAL OF E⑶NOMIC ENTOMOLOGY, 1958-1966”、“David W.Hagstrum.1mmigration ofinsects into bins storing newly harvested wheat onl2Kansas farms.Journal ofStored Products Research, 2001 (37): 221-229”、“張永富.防治銹赤扁谷盜值得關注的問題.糧油倉儲科技通訊，2002 (1):33-40”、“劉永平，張生芳.我國微扁谷盜的發現及初步調查研究.植物檢疫，1984 (3):1-4”、“商永輝，杜明華.探索書虱、銹赤扁谷盜綜合防治的措施.137-143” 中。
[0053]實施例1、針對5種世界常見儲糧扁谷盜的特異引物的設計與合成
[0054]一、5種世界常見儲糧扁谷盜mtDNA COI序列的獲得
[0055]實驗材料:涉及5種儲糧扁谷盜，具體為銹赤扁谷盜、長角扁谷盜、微扁谷盜、土耳其扁谷盜和開普扁谷盜。其中，銹赤扁谷盜涉及如下地理種群:捷克布拉格種群、美國堪薩斯州種群、山東濟寧種群、廣東湛江種群；長角扁谷盜涉及如下地理種群:捷克布拉格種群、美國堪薩斯州種群、湖北武漢種群、海南海口種群；微扁谷盜涉及如下地理種群:云南瀘西種群；土耳其扁谷盜涉及如下地理種群:捷克布拉格種群、河南商丘種群；開普扁谷盜涉及如下地理種群:捷克布拉格種群。
[0056](I)扁谷盜基因組DNA的提取
[0057]采用天根生化科技(北京)有限公司的血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒，按照試劑盒說明書操作，提取單頭扁谷盜成蟲去除腹部后蟲體或單頭非成蟲態整個蟲體的總DNA，根據提取效果做適當的調整，保證提取DNA質量良好，可用于下一步實驗。具體提取程序如下:
[0058]①取待測的成蟲樣品在雙目解剖鏡下去除其腹部，將無腹部的扁谷盜成蟲樣品或整頭非成蟲樣品用雙蒸水清洗1-3次，然后置于濾紙上自然干燥。
[0059]②取上述干燥后的單頭扁谷盜于1.5ml體積離心管中，加入液氮，迅速用燒溶封口后的槍頭將樣品徹底研磨碎。
[0060]③加入200 μ L緩沖液GA，震蕩至徹底懸浮。
[0061]④加入10 μ L蛋白酶K混勻，在56°C水浴條件下放置至少3小時，直至組織溶解，每小時顛倒混勻樣品2-3次。離心30秒以去除管蓋內壁的水珠，再進行下一步驟。
[0062]⑤加入200 μ L緩沖液GB，充分顛倒混勻，70°C放置10分鐘，溶液應變清亮，離心30秒以去除管蓋內壁的水珠。
[0063]⑥加入200 μ L無水乙醇，充分振蕩混勻15秒，此時可能出現絮狀沉淀，簡短離心以去除管蓋內壁的水珠。
[0064]⑦將上一步所得溶液加入一個吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將CB3吸附柱放回收集管中。
[0065]⑧向吸附柱CB3中加入500 μ L緩沖液⑶，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
[0066]⑨向吸附柱CB3中加入700 μ L緩沖液PW，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
[0067]⑩向吸附柱CB3中加入500ul緩沖液PW，12000rpm離心30秒，倒掉廢液。
[0068](11)將吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm離心2分鐘，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置15分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。
[0069](12)將吸附柱CB3轉入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加20ul洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5分鐘，12000rpm離心2分鐘，將溶液收集到離心管中。
[0070](13)扁谷盜的基因組DNA被洗脫到離心管中，_20°C保存備用。
[0071 ] (2) mtDNA COI 序列 PCR 擴增
[0072]以步驟(1)提取得到的扁谷盜基因組DNA為模板，利用通用引物對:LC01490和HC02198擴增扁谷盜的mtDNA COI序列，不同種擴增產物長度約為700bp。反應體系:PCR反應總體積為50yL，其中2XTaq PCR MasterMix25 μ L (上海生工生物工程有限公司)，ddH2021 μ L,模板2μ L,上游引物IyL,下游引物IyL,引物濃度均為10 μ Μ。熱循環程序為:94°C預變性 3min，接著進行 35 個循環(94°C lmin,50°C lmin，72°C lmin)，最后在 72°C反應10min后結束。
[0073]LC01490:5， -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3，；
[0074]HC02198: 5，-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3，。
[0075](3) mtDNA COI 序列的獲得
[0076]采用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的質量，將擴增條帶明亮且背景干凈的樣品委托北京奧科生物技術公司進行純化并雙向測序，測序采用以上通用引物對(LC01490/HC02198)。測序反應均在AB1-3730測序儀上進行。將測得序列用DNAMAN6.0軟件進行比對拼接，切除引物段后獲得最終長為658bp的序列片段。[0077]二、針對5種儲糧扁谷盜特異引物的設計
[0078](I)引物設計
[0079]將步驟一獲得的5種扁谷盜(每種包含I至多個地理種群)的mtDNA COI序列進行DNAMAN比對分析后，采用Primer Premier5.0軟件分別設計針對5種扁谷盜的特異引物。
[0080](2)引物評估
[0081]采用01igo7軟件對引物對各項指標進行評估，評估內容及評估標準如下:
[0082]上下游引物的Delta G值絕對值不超過9 ;可形成引物二聚體或發夾結構的結合堿基對不要超過3個；GC%含量控制在30%-60%之間，且上下游之間不要相差太大；錯誤引發效率不超過100 ;最后，結合01 igo7軟件給出不同引物對最適退火溫度，將退火溫度統一設定為50°C。
[0083]根據以上所述，設計并合成得到針對5種儲糧扁谷盜的特異引物如下(表1):
[0084]表1世界常見5種儲糧扁谷盜的特異引物一覽表
[0085]
【權利要求】
1.一種用于鑒定或輔助鑒定儲糧扁谷盜的試劑盒，包括如下5個引物對中的至少一對: (O由序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的引物對I ; (2)由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的引物對2； (3)由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的引物對3； (4)由序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的引物對4； (5)由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的引物對5。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒中組成每個引物對的兩條單鏈DNA的摩爾數相等。
3.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于:所述儲糧扁谷盜為如下中的至少一種:銹赤扁谷盜、長角扁谷盜、微扁谷盜、土耳其扁谷盜和開普扁谷盜。
4.權利要求1-3中任一所述試劑盒的制備方法，包括如下步驟:將組成所述試劑盒中各引物對的各單鏈DNA分別單獨包裝后，與下述物質中的至少一種包裝在同一試劑盒內:PCR反應緩沖液、DNA 聚合酶和4種dNTP。
5.鑒定或輔助鑒定儲糧扁谷盜的方法，為如下(a)- (e)中的任一種: (a)鑒定或輔助鑒定待測儲糧扁谷盜是否為銹赤扁谷盜的方法，包括如下(al)和(a2)的步驟: (al)以所述待測儲糧扁谷盜的基因組DNA為模板，用由序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的引物對I進行PCR擴增； (a2)檢測步驟(al)得到的PCR產物的大小，按照如下方法根據PCR產物確定所述待測儲糧扁谷盜是否為銹赤扁谷盜:若所述PCR產物中含有158bp的DNA片段，則所述待測儲糧扁谷盜為或候選為銹赤扁谷盜；反之，則所述待測儲糧扁谷盜不為或候選不為銹赤扁谷盜； (b)鑒定或輔助鑒定待測儲糧扁谷盜是否為長角扁谷盜的方法，包括如下(bl)和(b2)的步驟: (bl)以所述待測儲糧扁谷盜的基因組DNA為模板，用由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的引物對2進行PCR擴增； (b2)檢測步驟(bl)得到的PCR產物的大小，按照如下方法根據PCR產物確定所述待測儲糧扁谷盜是否為長角扁谷盜:若所述PCR產物中含有371bp的DNA片段，則所述待測儲糧扁谷盜為或候選為長角扁谷盜；反之，則所述待測儲糧扁谷盜不為或候選不為長角扁谷盜； (c)鑒定或輔助鑒定待測儲糧扁谷盜是否為微扁谷盜的方法，包括如下(Cl)和(c2)的步驟: (Cl)以所述待測儲糧扁谷盜的基因組DNA為模板，用由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的引物對3進行PCR擴增； (c2)檢測步驟(Cl)得到的PCR產物的大小，按照如下方法根據PCR產物確定所述待測儲糧扁谷盜是否為微扁谷盜:若所述PCR產物中含有585bp的DNA片段，則所述待測儲糧扁谷盜為或候選為微扁谷盜；反之，則所述待測儲糧扁谷盜不為或候選不為微扁谷盜； (d)鑒定或輔助鑒定待測儲糧扁谷盜是否為土耳其扁谷盜的方法，包括如下(dl)和(d2)的步驟: (dl)以所述待測儲糧扁谷盜的基因組DNA為模板，用由序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的引物對4進行PCR擴增； (d2)檢測步驟(dl)得到的PCR產物的大小，按照如下方法根據PCR產物確定所述待測儲糧扁谷盜是否為土耳其扁谷盜:若所述PCR產物中含有355bp的DNA片段，則所述待測儲糧扁谷盜為或候選為土耳其扁谷盜；反 之，則所述待測儲糧扁谷盜不為或候選不為土耳其扁谷盜； (e)鑒定或輔助鑒定待測儲糧扁谷盜是否為開普扁谷盜的方法，包括如下(el)和(e2)的步驟: (el)以所述待測儲糧扁谷盜的基因組DNA為模板，用由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的引物對5進行PCR擴增； (e2)檢測步驟(el)得到的PCR產物的大小，按照如下方法根據PCR產物確定所述待測儲糧扁谷盜是否為開普扁谷盜:若所述PCR產物中含有289bp的DNA片段，則所述待測儲糧扁谷盜為或候選為開普扁谷盜；反之，則所述待測儲糧扁谷盜不為或候選不為開普扁谷盜。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于:步驟(a)_步驟(e)中，所有的所述進行PCR擴增的退火溫度均為50°C。
7.根據權利要求5或6所述的方法，其特征在于:所述引物對1、所述引物對2、所述引物對3、所述引物對4和所述引物對5，組成每個引物對的兩條單鏈DNA在各自的PCR反應體系中的摩爾比均為1:1。
8.根據權利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于:步驟(a)中，所述158bp的DNA片段的核苷酸序列為序列表中序列11 ;步驟(b)中，所述371bp的DNA片段的核苷酸序列為序列表中序列12 ;步驟(c)中，所述585bp的DNA片段的核苷酸序列為序列表中序列13 ;步驟(d)中，所述355bp的DNA片段的核苷酸序列為序列表中序列14 ;步驟(e)中，所述289bp的DNA片段的核苷酸序列為序列表中序列15。
【文檔編號】C12Q1/68GK103952463SQ201310298148
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2013年7月16日 優先權日:2013年7月16日
【發明者】李志紅, 王一椒 申請人:中國農業大學