一種用lamp-lfd芯片高通量檢測微囊藻毒素的方法
【專利摘要】本發明的目的是提供一種用LAMP-LFD芯片高通量檢測微囊藻毒素的方法，以實現對微囊藻毒素基因進行快速、安全、特異、靈敏、簡便的現場檢測，克服已有用實驗室都采用細胞毒性實驗法、化學分析法、ELISA及PPIA方法來檢測微囊藻毒素不能在現場應用的問題，從而彌補現有技術的不足。反應結果可以直接肉眼判定等優點適合各類試劑檢測反應，特別適合現場以及野外的檢測需要。本發明結合微囊藻毒素合成基因簇中，負責合成微囊藻毒素生物活性表達所必需的D-Glu的mcyE基因的種間同源區域設計用于LMAP擴增的引物。并利用研發的LAMP-LFD芯片集成裝置進行微囊藻毒素基因的檢測。
【專利說明】-種用LAMP-LFD芯片局通量檢測微囊藻毒素的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于自然水體毒素快速檢測【技術領域】，具體涉及一種用LAMP-LFD芯片高 通量檢測微囊藻毒素的方法
【背景技術】
[0002] 微囊藻毒素（Microcystins)是一類具有生物活性的環七肽化合物，這類毒素主 要由淡水銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa)產生。此外其它種類的微囊藻，如綠 色微囊藻（M.viridis)、惠氏微囊藻（M.wesenbergii)以及魚腥藻（Anabaena)、念珠藻 (Nostoc)、顫藻（Oscillatoria)的一些種或株系也能產生這類毒素。微囊藻毒素是自然水 體藍藻水華發生后最容易出現、產生量最大、造成危害最嚴重的藍藻毒素，常引起人畜的急 性肝中毒事故的發生。因此，研究快速、簡便、靈敏的高通量微囊藻毒素快速檢測方法實現 對水體中微囊藻毒素的時時監控，對于保障自然水體尤其是飲用水體的安全性有著重要的 意義。
[0003] 目前對于微囊藻毒素的檢測方法也層出不窮，大多數實驗室都采用細胞毒性實驗 法、化學分析法、ELISA及PPIA方法來檢測微囊藻毒素。這些方法只能檢測水體中己產生 并累計到一定程度的微囊藻毒素，無法對微囊藻毒素的產生進行預判。同時由于細胞毒性 實驗涉及一系列倫理問題遭到越來越多人的抗議，而化學分析法所需要的分析儀器及標準 品昂貴，且該方法對樣品的前處理要求較高，且對檢測環境由很高的要求，很難被廣泛運用 于基層的環境監測部門，實現毒素的現場分析檢測。
[0004] 隨著微囊藻毒素生物合成基因的發現，使得我們可以從毒素合成基因的角度入 手，采用一種同以往毒素檢測完全不同的思路對自然水體中微囊藻毒素的進行檢測。即通 過對水體中是否存在微囊藻毒素合成基因進行檢測，間接的判斷水體中是否存在微囊藻毒 素，同時，由于基因從表達到轉錄再到翻譯成可行使功能的蛋白質進而合成微囊藻毒素需 要一定時間和過程。這也使得這種檢測對于水體中微囊藻毒素的產生具有一定的超前性。 將微囊藻毒素的檢測從發生期前移到累積期，從而大大提高水體中微囊藻毒素的預防能 力。
[0005] 環介導等溫擴增（Loop-Mediated Isothermal Amplification Method，LAMP)方 法，最初由Notomi等人設計并應用于病原微生物的檢測。該方法通過針對靶基因的6個區 域而設計4種特異性引物，利用具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，在恒溫條件下￠0-650 高效（0. 5-lh)擴增目標DNA。該方法僅需要簡單的水浴鍋或者加熱器，在靈敏度、特異性和 檢測范圍等指標上能媲美甚至優于PCR技術。目前，國內外已有較多文獻報道了該技術的 應用，但是其大多數只應用于病原微生物檢測方面，在微囊藻毒素檢測方面的應用還未有 先例。因此，該技術在微囊藻毒素檢測中的運用必將給目前藍藻毒素檢測尤其是微囊藻毒 素檢測帶來一場新的革命。
[0006] 橫向流動試紙條（lateral flow dipstick, LFD)是一種新的對擴增產物的檢測 方法，反應中FITC標記的探針與生物素標記的LAMP擴增產物特異性雜交，避免了瓊脂糖 凝膠電泳或熒光染料染色肉眼觀察由非特異性擴增造成的假陽性，進一步提高了反應的特 異性和靈敏度。LFD檢測無需特殊的設備，操作者只需將產物和試紙條浸入緩沖液，并且不 需EB等有毒試劑，操作簡便且更安全。LAMP-LFD結合技術的檢測結果可以直接肉眼觀察。 LFD試紙條上具有控制帶和檢測帶，兩條帶均顯色表示檢測結果為陽性，只有控制帶顯色檢 測帶不顯色表明檢測結果為陰性。LAMP-LFD結合方法安全、快捷、搞笑、高靈敏度且無設備 及技術限制，具有其他技術無法替代的優勢。
【發明內容】
[0007] 針對上述領域，本發明的目的是提供一種用LAMP-LFD芯片高通量檢測微囊藻毒 素的方法，以實現對微囊藻毒素基因進行快速、安全、特異、靈敏、簡便的現場檢測，克服已 有用實驗室都采用細胞毒性實驗法、化學分析法、ELISA及PPIA方法來檢測微囊藻毒素不 能在現場應用的問題，從而彌補現有技術的不足。反應結果可以直接肉眼判定等優點適合 各類試劑檢測反應，特別適合現場以及野外的檢測需要。
[0008] 本發明結合微囊藻毒素合成基因簇中，負責合成微囊藻毒素生物活性表達所必需 的D-Glu的mcyE基因的種間同源區域設計用于LMP擴增的引物。并利用研發的LAMP-LFD 芯片集成裝置進行微囊藻毒素基因的檢測，技術方案具體步驟如下：
[0009] 設計LAMP的引物和探針：根據GcneBank中微囊藻毒素合成簇中的負責合成微 囊藻毒素生物活性表達所必須的D-Glu的mcyE基因的己知序列（AAF00958、CC117562、 AA062582)，利用ClustalW比對軟件尋找其保守區域，并按環介導等溫擴增技術引物設 計原則，針對mcyE基因的保守區域分別設計MCYE-F3、MCYE-B3、MCYE-FIP、MCYE-BIP、 MCYE-LF、MCYE-LB -組共6條環介導等溫擴增技術擴增特異引物和一條探針序列。引物信 息詳見下表：
【權利要求】
1. 一種用LAMP-LFD芯片高通量檢測微囊藻毒素的方法，其特征在于結合微囊藻毒素 合成基因簇中，負責合成微囊藻毒素生物活性表達所必需的D-Glu的mcyE基因的種間同源 區域設計用于LMAP擴增的引物。并利用研發的LAMP-LFD芯片集成裝置進行微囊藻毒素基 因的檢測。
2. -種用LAMP-LFD芯片高通量檢測微囊藻毒素的方法的技術方案，其特征的具體 步驟如下：設計LAMP的引物和探針：根據GeneBank中微囊藻毒素合成簇中的負責合成微 囊藻毒素生物活性表達所必須的D-Glu的mcyE基因的己知序列（AAF00958、CCI17562、 AA062582)，利用ClustalW比對軟件尋找其保守區域，并按環介導等溫擴增技術引物設 計原則，針對mcyE基因的保守區域分別設計MCYE-F3、MCYE-B3、MCYE-FIP、MCYE-BIP、 MCYE-LF、MCYE-LB -組共6條環介導等溫擴增技術擴增特異引物和一條探針序列。
3. 引物信息詳見下表：
4. 其中FIP為5'端BIPO生物素標記引物，FITC-Probe為5'端FITC標記探針：引物 序列和控針序列分別與微囊藻生物合成mcyE基因上相應位置核苷酸序列相同或者互補。
5. -種用LAMP-LFD芯片高通量檢測微囊藻毒素的方法，其特征在于利用己制備高 通量LAMP-LFD芯片系統。在高通量LAMP-LFD芯片檢驗檢測系統通道的擴增池內中第1， 2, 3,4, 5,6, 7,8,9,10擴增池中包被上微囊藻毒素基因 mcyE核酸LAMP引物組，特異性探 針，第11擴增池中包被其他核酸探針第12擴增池中不包被核酸探針。在12個擴增池分 別加入樣品（10個樣品核酸提取物，2個陰性對照樣品），在再加入LAMP反應液，反應體 系的終濃度分別為：外引物F3和B3各0. 2Umol/L，內引物FIP和BIP各1. 6Umol/L，環引 物 LF 和 LB 各 0.4Umol/L， dNTPS0.96mmol/L， Tris-HCI(pH8.8)20mmol/L， KCI10mmol/L， Mg S04,6.5mmol/L，（NH4)S0410mmol/L，0.1%Triton x-100,8U Bst DNA 聚合酶大片段 (New EnglandBIPolabs)和liiL樣品模板，加雙蒸水使反應體系總體積為25iiL。將高通 量LAMP-LFD微囊藻毒素檢測裝置放置在恒溫下進行LAMP反應應體系擴增，擴增反應溫度 為60°C，擴增反應時間為30min。反應結束后，通過導流槽將反應產物導入雜交池與5'端 FITC標記的雜交探針進行雜交，時間5min。 6. LFD檢測。其特征在于將LFD試劑條插入LFD卡槽里面，將雜交反應液導入LFD試紙 條進行顯色檢測，判斷橫向側析試紙條檢測LAMP的結果。在包被有目標物探針的擴增池中 反應物與LFD作用反應；LFD檢測線上出現特征性反應帶。而在陰性樣品的擴增池對應的 LFD沒有出現反應帶。
【文檔編號】C12M1/00GK104278081SQ201310297797
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2013年7月3日 優先權日:2013年7月3日
【發明者】朱鵬, 嚴小軍, 陳炯, 張煜, 夏小磊, 范建忠, 黃海龍, 姚香菊 申請人:寧波大學, 寧波博奧生物工程有限公司