大鼠毛囊干細胞的分離培養方法
【專利摘要】本發明涉及大鼠毛囊干細胞的分離培養方法，該方法包括以下步驟：1）選用一周齡SD大鼠觸須部皮膚；用鑷子和一次性注射器針頭從皮下組織端拉出毛囊，收集形態完好且處于生長期的毛囊，顯微鏡下將毛囊切成三等份，取中間部分，PBS漂洗后放入50mL培養瓶中，加入DMEM/F12補充培養基，1周后毛囊隆突部有細胞爬出，形成克隆；2）培養條件為37℃、5%CO2培養箱中，每2-3d換液一次；3）毛囊干細胞的傳代消化條件為：TrypLETMExpress(1X)，no?Phenol?Red，37℃消化8-10min；4)毛囊干細胞的純化。本發明由于采用了上述的技術方案，得到了理想的毛囊干細胞。
【專利說明】大鼠毛囊干細胞的分離培養方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及干細胞、皮膚組織工程學領域，尤其涉及一種大鼠毛囊干細胞的分離、培養、純化、鑒定方法。
[0002]【技術領域】
[0003]皮膚作為人體最大的器官，具有感覺、調節體溫、分泌與排泄、防止水分蒸發等多種作用，其中最主要的功能是作為人體與外界環境的屏障以維持內環境的穩定，同時其也是免疫系統的重要組成部分。隨著社會經濟的發展，特別是作為“世界工廠”的我國制造業和手工業的繁榮發展，各種涉及皮膚缺損的外傷特別是燒傷、壓軋傷、切割傷等也越來越多。其中，外傷導致的皮膚大面積缺損常常導致非常嚴重的肢體殘疾，甚至死亡。目前臨床上治療皮膚缺損的標準治療方法是自體皮膚移植，由于具有無免疫排斥反應，成活率高等特點，其在臨床上應用極為廣泛，并取得了很好的療效。但自體皮膚移植的缺點也非常明顯，由于是自體取材，其本身就是對患者的再次損傷,極大增加了患者痛苦,而且有發生供皮區感染，不愈合等并發癥的風險。更為嚴重的是，對于上述的大面積皮膚缺損，常由于缺乏足夠可供移植的自體皮膚而導致創面修復困難，嚴重影響了治療進程，甚至導致死亡。
[0004]正因如此，科學家們一直試圖尋找一種外源性的皮膚替代物。早在公元前1500年，異種皮膚移植就被用于臨時覆蓋皮膚缺損創面。而隨著組織工程學的創立和發展，皮膚組織工程學迅速興起，并成為近十年來研究的熱點。組織工程學是應用工程學及生命科學的原理與方法，研究生物替代物，以用于重建、保持或提高組織功能的一門學科。目前，國外應用皮膚組織 工程學構建人工皮膚的研究已取得了實質性進展，Apligraf, OrCel,Suprathel> Biobrane、OASIS、Integra、Lyphoder等產品已先后被美國藥品與食品管理局(FDA)批準上市并已應用于臨床皮膚缺損的治療中。
[0005]然而，雖然目前已有以上數種人工皮膚產品可供臨床選擇，也確實促進了對大面積皮膚缺損患者的臨床治療。但是，根據我們多年臨床應用過程中遇到的問題，結合文獻報道，我們認為目前人工皮膚移植還存在著許多問題，其中甚至包括可能導致治療最終失敗的“硬傷”:①由于以上人工皮膚產品都沒有血管生成能力，導致移植的人工皮膚沒有血管系統供給營養，從而使人工皮膚容易發生壞死，使移植失敗。②人工皮膚產品中所含的各種異體細胞容易引起免疫排斥反應，臨床上常出現移植的皮膚壞死、脫落，嚴重的甚至出現全身免疫反應等嚴重并發癥，并且有可能傳播疾病。③目前所有的人工皮膚產品都只能恢復正常皮膚的部分解剖結構和生理功能，而無法再生具有重要功能的皮膚附屬器結構，例如:血管、毛發、汗腺等。
[0006]毛囊干細胞是一類存在于毛囊外根鞘隆突部的干細胞，具有未分化性、自我更新和體外增殖能力強等特點。體外培養研究中的毛囊干細胞表現出了高克隆形成能力，具有很高的再生潛能。由于毛囊干細胞來源于毛發，可以直接從患者自身取得，數量極其豐富，且沒有任何并發癥，對患者完全無創，現已成為皮膚組織工程學研究的焦點。Taylor等(Taylor G，Lehrer MS, Jensen PJ，et al.1nvolvement of follicular stem cells informing not only the follicle but also the epidermis.Cell, 2000, 102(4):451-461.)研究發現毛囊干細胞不僅能夠分化形成毛囊，而且還參與了表皮組織的形成過程。Stelios等發表的最新研究結果證明，頭發毛囊中含有大量的干細胞，是最容易獲得的干細胞來源之一，并已成功將毛囊干細胞分化發育生成新的脈管系統。血管內皮細胞生長因子165 (VEGF165)是血管內皮細胞生長因子5種亞型之一，其活性最強，分布范圍最廣，是VEGF體內發揮作用的主要亞型。近年來圍繞VEGF165為中心的血管再生性基因治療研究成為國內外研究熱點。
[0007]為此 申請人:申請了一種VEGF165基因修飾毛囊干細胞的方法，該方法以毛囊干細胞為種子細胞，具有體外培養時能快速大量擴增，來源非常豐富，減小免疫排斥反應；同時利用VEGF165基因轉染修飾毛囊干細胞，能夠形成具有擴張和收縮功能的新的工程血管系統，將很好的解決移植人工皮膚容易壞死，成活率低的問題。
【發明內容】
[0008]為了解決目前毛囊干細胞的來源問題，本發明的目的是提供大鼠毛囊干細胞的分離培養方法。本發明的毛囊干細胞具有體外培養時能快速大量擴增，來源非常豐富，減小免疫排斥反應的特點，能夠很好的解決移植人工皮膚容易壞死，成活率低的問題。
[0009]為了實現上述的第一個目的，本發明采用了以下的技術方案:
[0010]I)選用一周齡SD大鼠觸須部皮膚，置入0.25%Dispase酶37°C消化2h ;用鑷子和一次性注射器針頭從皮下組織端拉出毛囊，收集形態完好且處于生長期的毛囊，顯微鏡下將毛囊切成三等份，取中間部分，PBS漂洗后放入50mL培養瓶中，加入DMEM/F12補充培養基，I周后毛囊隆突部 有細胞爬出，形成克隆；所述的DMEM/F12補充培養基成分為:44mlDMEM/F12培養液、5mlKSR血清替代物、500 μ I青鏈霉素混合液、500 μ I L-谷氨酰胺、500 μ I非必需氨基酸、20ng/ml重組人表皮細胞生長因子、10ng/ml重組人堿性成纖維細胞生長因子、50 μ I羥基乙醇、10ng/ml氫化可的松；
[0011]2)培養條件為37°C、5%C02培養箱中，每2_3d換液一次；
[0012]3)毛囊干細胞的傳代消化條件為:TrypLE?Express (IX), no Phenol Red,37°C消化8-10min ；
[0013]4)毛囊干細胞的純化:將100 μ g/ml的IV型膠原按照3ml/100mm dish的量包被在培養皿中，室溫靜置Ih ;將IOOmm培養皿的原代細胞用胰蛋白酶消化，離心收集細胞后，吹打成單細胞懸液接種于培養皿中，20min后，將未貼壁的細胞連同培養液一起吸出；貼壁的細胞用完全培養基培養，每3天換液；P2代再純化一次。
[0014]本發明由于采用了上述的技術方案，得到了理想的毛囊干細胞，可以對該毛囊干細胞進行基因修飾，然后以此為種子細胞，種植于三維明膠海綿組織支架，構成成具有新的血管系統的新型復合人工皮膚模型。該模型具有以下獨特的優點:
[0015]①作為干細胞，毛囊干細胞具有體外培養時能快速大量擴增，長期體外傳代培養，細胞功能旺盛等特點，并且具有很高的再生和分化能力，這將極大縮短體外培養擴增時間，提聞臨床治療效率；
[0016]②由于能夠形成具有擴張和收縮功能的新的工程血管系統，將很好的解決移植人工皮膚容易壞死，成活率低的問題；
[0017]③本研究中所用的種子細胞一毛囊干細胞取自自體毛發，來源非常豐富，也非常容易獲得，且不會對患者造成任何損傷和痛苦；
[0018]④由于種子細胞取自自體組織，免疫排斥反應和傳播疾病等問題將迎刃而解；
[0019]⑤相對于目前的人工皮膚產品，此新型人工皮膚將更大程度的恢復和再生正常皮膚組織的解剖結構和生理功能。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020]圖1-圖3為原代毛囊干細胞從毛囊隆突部爬出，呈鳥巢狀、上皮樣細胞，排列緊密40 X。
[0021]圖4為純化前的Pl代毛囊干細胞，以鋪路石狀為主，夾雜多種細胞形態100X。
[0022]圖5為IV型膠原篩選純化后的P3代毛囊干細胞，呈典型的鋪路石狀100X。
[0023]圖6為大鼠毛囊干細胞組樣品RNA抽提電泳圖，泳道1:SD大鼠毛囊干細胞組樣品RNA。
[0024]圖7為6個相關引物和rActb引物在SD大鼠毛囊干細胞cDNA中的擴增條帶；
[0025]泳道I =Marker DL2000 (從上至下分別為 2000，1000，750，500，250，IOObp)；
[0026]泳道2:rActb引物在SD大鼠毛囊干細胞cDNA中的擴增(目的條帶173bp)
[0027]泳道3:r KrtlO引物在SD大鼠毛囊干細胞cDNA中的擴增(目的條帶175bp)，此處為引物二聚體；
[0028]泳道4:rKrtl5弓丨物在SD大鼠毛囊干細胞cDNA中的擴增(目的條帶94bp)；
[0029]泳道5:rKrtl9弓丨物在SD大鼠毛囊干細胞cDNA中的擴增(目的條帶156bp)；
[0030]泳道6:rCD34引物在SD大鼠毛囊干細胞cDNA中的擴增(目的條帶146bp)；
[0031]泳道7:rltgbl引物在SD大鼠毛囊干細胞cDNA中的擴增(目的條帶72bp)；
[0032]泳道8:rltgb6引物在SD大鼠毛囊干細胞cDNA中的擴增(目的條帶188bp)。
[0033]圖8為6個目的基因的基因表達情況評價柱狀圖。
[0034]圖9-圖11為P3代毛囊干細胞的免疫熒光染色，分別為整合素β 1、整合素a6、角蛋白 15，100X。
[0035]圖12為純化后的P3毛囊干細胞的生長曲線圖，n=7。
【具體實施方式】
[0036]實施例1毛囊干細胞的分離、培養
[0037]I)選用一周齡SD大鼠觸須部皮膚，置入0.25%Dispase酶37°C消化2h ;用鑷子和一次性注射器針頭從皮下組織端拉出毛囊，收集形態完好且處于生長期的毛囊，顯微鏡下將毛囊切成三等份，取中間部分，PBS漂洗后放入50mL培養瓶中，加入DMEM/F12補充培養基，I周后毛囊隆突部有細胞爬出，形成克隆。如圖1-圖3。
[0038]2)所述的DMEM/F12補充培養基成分為全新的配方:44mlDMEM/F12培養液、5mlKSR血清替代物、500 μ I青鏈霉素混合液、500 μ I L-谷氨酰胺、500 μ I非必需氨基酸、20ng/ml重組人表皮細胞生長因子、10ng/ml重組人堿性成纖維細胞生長因子、50 μ I羥基乙醇、10ng/ml氫化可的松；
[0039]3)培養條件為37°C、5%C02培養箱中，每2_3d換液一次；
[0040]4)毛囊干細胞的傳代消化條件為:TrypLE?Express (IX) ,no Phenol Red(Gibco 公司 CAT: 12604013)，37°C消化 8-10min ；
[0041]實施例2毛囊干細胞的純化
[0042]I)將100 μ g/ml的IV型膠原按照3ml/100mm dish的量包被在培養皿中，室溫靜置Ih ;將IOOmm培養皿的原代細胞用胰蛋白酶消化，離心收集細胞后，吹打成單細胞懸液接種于培養皿中，20min后，將未貼壁的細胞連同培養液一起吸出；貼壁的細胞用完全培養基培養，每3天換液；P2代再純化一次，如圖4-5。
[0043]實施例3毛囊干細胞的鑒定
[0044]I) Q-PCR檢測:分選純化后的P3代毛囊干細胞進行Q-PCR檢測。具體方法如下:
[0045]具體方法如下:
[0046]1.1)從干擾質粒轉染的293T細胞中抽提總RNA。如圖6
[0047]1.1.1)將培養液去除后，用PBS潤洗細胞。
[0048]1.1.2)向12孔板中培養的細胞中每孔加入500ul Trizol，在室溫下水平放置5min,使裂解液均勻分布于細胞表面，然后用移液槍吹打細胞使細胞脫落。
[0049]1.1.3)將細胞裂解液轉移至離心管中，并用ImL槍頭反復吹打直至裂解液中無明顯沉淀，在室溫下 放置5min，使得核酸蛋白復合物完全分離。
[0050]1.1.4)每管加入ΙΟΟμ I氯仿，用手上下顛倒印管15s，室溫靜置15min，4°C，12000rpm,離心 15min。
[0051]1.1.5)吸取上清移至新的1.5ml ep管，加入等體積_20°C預冷的異丙醇，混勻后 _20°C沉淀 IOmin。
[0052]1.1.6) 4°C，12000rpm離心IOmin后，去上清，加入lml4°C預冷的75%乙醇，洗滌沉淀，4°C, 1000Orpm離心5min,棄上清。吸水紙吸去殘液,室溫干燥。
[0053]1.1.7)加入 10 μ I RNase-free 水，至完全溶解，NanoDrop 測定 RNA 的濃度。
[0054]1.2) RNA 反轉錄成 cDNA
[0055]根據Fermentas公司的M-MLV操作說明書進行反轉錄，體系如下:
[0056]在RNase-Free的PCR管中加入(總體系2Oul)
[0057]
[0058]
【權利要求】
1.大鼠毛囊干細胞的分離培養方法，其特征在于該方法包括以下的步驟: 1)選用一周齡SD大鼠觸須部皮膚，置入0.25%Dispase酶37°C消化2h ;用鑷子和一次性注射器針頭從皮下組織端拉出毛囊，收集形態完好且處于生長期的毛囊，顯微鏡下將毛囊切成三等份，取中間部分，PBS漂洗后放入50mL培養瓶中，加入DMEM/F12補充培養基，I周后毛囊隆突部有細胞爬出，形成克隆；所述的DMEM/F12補充培養基成分為:44mlDMEM/F12培養液、5mlKSR血清替代物、500 μ I青鏈霉素混合液、500 μ I L-谷氨酰胺、500 μ I非必需氨基酸、20ng/ml重組人表皮細胞生長因子、10ng/ml重組人堿性成纖維細胞生長因子、50 μ I羥基乙醇、10ng/ml氫 化可的松； 2)培養條件為37°C、5%C02培養箱中，每2-3d換液一次； 3)毛囊干細胞的傳代消化條件為:TrypLE?Express(IX), no Phenol Red,37°C消化8-10min ； 4)毛囊干細胞的純化:將ΙΟΟμg/ml的IV型膠原按照3ml/100mm dish的量包被在培養皿中，室溫靜置Ih ;將IOOmm培養皿的原代細胞用胰蛋白酶消化，離心收集細胞后，吹打成單細胞懸液接種于培養皿中，20min后，將未貼壁的細胞連同培養液一起吸出；貼壁的細胞用完全培養基培養，每3天換液；P2代再純化一次。
2.根據權利要求1獲得的毛囊干細胞。
【文檔編號】C12N5/071GK103710297SQ201310290238
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年7月10日 優先權日:2013年7月10日
【發明者】全仁夫, 黃忠名, 鄭宣, 許世超 申請人:杭州市蕭山區中醫院