厭氧產(chǎn)電菌分離及電化學活性鑒定方法
【專利摘要】一種厭氧產(chǎn)電菌的分離及電化學活性鑒定方法，它涉及微生物分離及檢驗方法。它解決了產(chǎn)電菌分離中整套滾管設備購置困難、培養(yǎng)基營養(yǎng)成分高溫滅菌時失活、厭氧滾管操作稀釋倍數(shù)選擇不當、分離時嚴格厭氧條件較難達到及純菌的電化學活性的檢驗周期長等問題。本發(fā)明分離方法：亨蓋特滾管替代裝置廉價易得，操作簡單；培養(yǎng)基配制方法可有效避免營養(yǎng)成分失活，營養(yǎng)豐富，產(chǎn)電菌活性強；選擇的滾管稀釋倍數(shù)能高效獲得單一菌落，縮短了分離周期；采用直接在厭氧瓶中煮沸和抽真空的方法除氧，避免了傳統(tǒng)除氧方法對培養(yǎng)基體系平衡的影響；產(chǎn)電菌電化學活性采用循環(huán)伏安法進行檢驗，減少了雜菌污染的影響，檢驗周期短。
【專利說明】厭氧產(chǎn)電菌分離及電化學活性鑒定方法
【技術領域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及厭氧產(chǎn)電菌分離及電化學活性檢驗方法。
【背景技術】
[0002]微生物燃料電池(MFC)是一種利用具有產(chǎn)電活性的微生物將有機質中的化學能轉化成電能的裝置。產(chǎn)電菌分解有機底物，釋放出電子和質子，傳輸?shù)疥帢O從而形成電流和水。目前對MFC的研究重點集中在以下四個方面:反應器的設計；底物的選擇；電極材料的優(yōu)化；微生物的分離。MFC掛膜啟動的本質為產(chǎn)電菌和其他種群微生物競爭，在電極表面附著形成生物膜的過程。微生物在降解有機物和轉移電子方面發(fā)揮重要作用，電活性高的菌株，轉化有機底物速率快，能量轉化效率高，輸出功率密度也較高。因此，產(chǎn)電菌的種類及能否形成優(yōu)勢種群是MFC成功啟動的關鍵因素，高效產(chǎn)電菌的獲得及對其產(chǎn)電機理的研究將推動MFC的研究進展。
[0003]目前，已經(jīng)從MFC中分離出的產(chǎn)電微生物主要有:地桿菌(Geobacteracae)、希瓦氏菌(Shewanella)、假單抱菌(Pseudomonas)、梭菌屬(Clostridium)、脫硫單菌(Desulfuromonas)和鐵還原紅育菌(Rhodofoferax ferrireducens)等。雖然產(chǎn)電菌的分離工作在近年得到了較大發(fā)展，但還存在一定的局限性，因為大多數(shù)嚴格厭氧產(chǎn)電菌對氧氣的條件要求苛刻，而保持絕對厭氧條件比較困難，而且不經(jīng)濟。所以，目前在實驗室能純培養(yǎng)出的厭氧產(chǎn)電菌種類非常有限，而即使運用分離培養(yǎng)技術得到的菌種也較難進入培養(yǎng)狀態(tài)，分離純化技術的局限性限制了人們對產(chǎn)電菌的認識與調(diào)控。
[0004]亨蓋特滾管技術是1950年由美國微生物學家亨蓋提出并應用于瘤胃厭氧微生物研究的一種厭氧培養(yǎng)技術。這種厭氧培養(yǎng)技術經(jīng)過不斷改進而日趨完善，多年來的實踐證明，它是目前應用最為廣泛、研究嚴格厭氧菌的一種非常有效的技術。本發(fā)明中將亨蓋特滾管技術應用于產(chǎn)電菌的分離，但是，由于該套技術在操作裝置、操作步驟等方面還存在一定缺陷，還需根據(jù)實際需要進行必要的改良。
[0005]此外，培養(yǎng)基對菌株的選擇起重要作用，其對產(chǎn)電菌的分離有決定性的影響，是產(chǎn)電菌分離的基礎，通過改變培養(yǎng)基的配制方法或添加特定的成分，是實現(xiàn)特異性產(chǎn)電菌分離純化的主要途徑。
[0006]現(xiàn)有厭氧產(chǎn)電菌的分離和電化學活性的鑒定方法，主要還存在以下幾個問題:
(I)亨蓋特滾管分離整套裝置中的滾管機和定量加樣器價格昂貴，實際試驗中難以獲得實用易操作的的成套設備。
[0007](2)現(xiàn)有產(chǎn)電菌分離所采用的培養(yǎng)基，雖然基本組成營養(yǎng)豐富，但由于配制步驟不正確或配比不合理，不能充分發(fā)揮每種營養(yǎng)成分的功能，而不利于產(chǎn)電菌生長，同時獲得的菌株電活性不強。
[0008](3)滾管操作的稀釋倍數(shù)選擇時，由于不同菌落大小不同，生長速率也不同，若滾管采用的稀釋倍數(shù)太小，則形成菌落密而小，不易挑出單菌落；若采用的稀釋倍數(shù)太大，則很可能難找到生長完整的菌落。
[0009]( 4 ) 一般分離出的產(chǎn)電菌為好氧或者兼性厭氧，而嚴格厭氧產(chǎn)電菌分離成功較少，一方面由于嚴格厭氧菌生長周期較長，長期的嚴格厭氧條件難以達到；另一方面由于在采用煮沸法或加入還原劑的方法去除氧氣的過程中，由于水分蒸發(fā)和還原劑酸性問題，導致培養(yǎng)基PH條件難以控制。
[0010](5)由于滾管操作和擴大培養(yǎng)需反復進行多次才能分離出純菌株，純化過程中容易染上雜菌，獲得單菌落的成功率低；
(6)分離出電化學活性菌株后，采用回投至滅菌反應器的方法進行電化學活性的檢驗，操作繁瑣且周期長。也有采用重新回投到MFC反應器中進行電化學活性鑒定，但操作周期長，且純菌MFC啟動較為困難，也容易染上雜菌而影響實驗結果。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0011]本發(fā)明公開了一種厭氧產(chǎn)電菌的分離及電化學活性鑒定方法，解決了產(chǎn)電菌分離中滾管整套設備購置困難、培養(yǎng)基配制方法和厭氧滾管操作稀釋倍數(shù)選擇不合理、分離時嚴格厭氧條件較難達到、反復操作步驟和較長的篩選周期容易染上雜菌和純菌的電化學活性的檢驗周期長等問題。
[0012]本發(fā)明所采用普通托盤和注射器代替滾管機和定量加樣器，廉價易得且操作方便。本發(fā)明在培養(yǎng)基中加入維生素液、微量元素液和檸檬酸鐵，且與培養(yǎng)基其他成分分開配制，其他成分采用高溫高壓法滅菌，此三種營養(yǎng)采用0.22μπι濾膜過濾除菌，可以有效避免V液、M液的營養(yǎng)作用在高溫高壓條件下失活和檸檬酸鐵電子受體與碳源電子供體相互反應而被還原。本發(fā)明滾管操作時所選擇的稀釋倍數(shù)合理，獲得微生物菌株數(shù)量多且菌落分散，分離純化過程不易染雜菌，減少了滾管分離次數(shù)，提高了分離效率。發(fā)明中采用的直接在厭氧瓶中煮沸和注射器抽真空同時進行的方法除氧與傳統(tǒng)的通氮氣和煮沸除氧后再分裝于厭氧培養(yǎng)瓶中的方法相比較，除氧效果更可靠和便捷，且對維持培養(yǎng)基體系的PH穩(wěn)定效果明顯。本發(fā)明產(chǎn)電菌的檢驗方法采用循環(huán)伏安法，操作簡單，篩選周期短。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013]圖1為厭氧管中菌落附著圖；圖2為在Zl菌株的循環(huán)伏安曲線；圖3為在Ζ2菌株的循環(huán)伏安曲線；圖4為在Ζ3菌株的循環(huán)伏安曲線。
【具體實施方式】
[0014]1、在無菌無氧條件下，剪下微生物燃料電池大小為4mm2的正方形電極膜，投入含滅菌除氧的液體培養(yǎng)基的厭氧瓶中，置于培養(yǎng)箱中30°C條件下培養(yǎng)5天。
[0015]2、取步驟I中Iml菌液進行稀釋倍數(shù)為1(Γ?07的倍比稀釋，選擇104、105、106和17四個稀釋梯度的菌液注入有瓊脂粉培養(yǎng)基的厭氧管中，平放在加有1/2托盤體積冷水的托盤(長X寬X高=27cmX17 cmX5cm)中快速滾動，待培養(yǎng)基在厭氧管內(nèi)管壁冷凝形成均勻的薄層，再用封口膜密封厭氧管管蓋的外側，垂直放置于培養(yǎng)箱中35°C培養(yǎng)5天。
[0016]3、挑取步驟2中厭氧管中的單一菌落于無菌無氧培養(yǎng)基的厭氧瓶中擴大培養(yǎng)。
[0017]4、重復步驟2和步驟3共四次，直至厭氧管中形成形態(tài)大小一致的單菌落。
[0018]5、取生長旺盛的菌液10 mL,經(jīng)離心和清洗操作4次后重懸于含10 mmol的磷酸鹽緩沖溶液中，然后采用電化學工作站在高純N2保護下，以Ag/AgCl為參比電極，玻碳電極為工作電極，在掃描速率50.0 mV/s,掃描范圍_600mV飛OOmV之間循環(huán)測試菌懸液的氧化還原特性，繪制循環(huán)伏安曲線。
[0019]其中試驗過程中培養(yǎng)基由基礎培養(yǎng)基A和培養(yǎng)基B組合而成，培養(yǎng)基A的配比為:胰蛋白胨 4.0 8/1、牛肉浸膏4.0 8/1、酵母1.0 g/UCaCL2 0.2 g/1、NaCL 5.0 g/1、乙酸鈉 16.0 g/1,FeSO4.7H20 0.2 g/1,MgCL2 0.2 g/1,K2HPO4 1.2 g/1、半胱氨酸 1.0 g/l、0.1%(w/v)的刃天青0.4 mL/L ;培養(yǎng)基B的配比為:檸檬酸鐵5.0 mmol/L、M液和V液各5 mL/L。步驟2中厭氧管的培養(yǎng)基除A和B后外加1.5 %?2.0 %的瓊脂粉。步驟3中培養(yǎng)基A導入?yún)捬跗亢螅饧尤?0%的蒸餾水，補充蒸發(fā)減少的水分體積，煮沸除氧的同時，用注射器抽真空，除氧氣操作的條件為105°C持續(xù)10分鐘。去除氧氣后，放置于121°C高溫高壓滅菌30min，滅菌時將厭氧反應瓶蓋子先順時針擰至最緊，后逆時針擰松90°。培養(yǎng)基B采用0.22 um濾膜過濾除菌后與已經(jīng)高溫高壓滅菌的培養(yǎng)基A混合成完整培養(yǎng)基。
[0020]在此操作方法、培養(yǎng)條件下，共分離出三株產(chǎn)電菌Zl、Z2和Z3。Zl為革蘭氏染色陰性，Z2和Z3為革蘭氏染色陽性。厭氧性測定結果為Zl為兼性厭氧菌，Z2和Z3為嚴格厭氧菌。Hungate厭氧管中三種菌的菌落形態(tài)都接近圓形，直徑約0.5cm左右，表面光滑，菌落邊緣整齊，中間顏色較深，邊緣顏色較淺。Zl有帶絲狀，為微黃色，Z2和Z3菌落為乳白色。3株菌株在-290mv時有明顯的還原峰，還原勢強，在0.0OV左右有氧化峰，但不明顯。表明分離出的3株菌株具有相似的產(chǎn)電活性，還原能力較強，適用于MFC的陰極。
[0021]綜上所述，本發(fā)明的優(yōu)勢是:亨蓋特滾管裝置廉價易得，操作簡單；培養(yǎng)基配制方法可有效避免V液、M液和電子受體檸檬酸鐵的失活，培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，產(chǎn)電菌活性強；所選擇的厭氧滾管稀釋倍數(shù)能高效獲得單一菌落，提高了產(chǎn)電菌分離效率；采用的直接在厭氧瓶中煮沸和抽真空的方法去除氧氣，避免了傳統(tǒng)除氧方法對培養(yǎng)基體系平衡的影響；產(chǎn)電菌電化學活性采用循環(huán)伏安法進行檢驗，減少了雜菌污染的影響，周期短且結果準確。
【權利要求】
1.一種厭氧產(chǎn)電菌的分離及電化學活性方法，其特征在于產(chǎn)電菌的分離按以下步驟進行:在無菌無氧條件下，剪下微生物電解池陽極膜，投入含滅菌除氧的液體培養(yǎng)基的厭氧瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；取上步驟中Iml菌液進行倍比稀釋，選擇合適的梯度稀釋菌液注入有瓊脂粉培養(yǎng)基的厭氧管中，平放在浸有冷水的滾管機中快速滾動，待培養(yǎng)基在厭氧管內(nèi)管壁冷凝形成均勻的薄層，用封口膜密封厭氧管管蓋的外側，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；挑取上步驟中厭氧管中的單菌落于有培養(yǎng)基的厭氧瓶中擴大培養(yǎng)；重復哼蓋特滾管和擴大培養(yǎng)，直至厭氧管中形成形態(tài)大小一致的單一菌落。
2.根據(jù)權利要求1，培養(yǎng)基A的組成為:胰蛋白胨4.0g/Ι、牛肉浸膏4.0 g/Ι、酵母1.0g/1、CaCL2 0.2 g/1 ,NaCL 5.0 g/Ι、乙酸鈉 16.0 g/1、FeSO4.7H20 0.2 g/1、MgCL2 0.2 g/UK2HPO4 1.2 g/1、半胱氨酸1.0 g/l、0.1% (w/v)的刃天青0.4 mL/L ;培養(yǎng)基B的組成為:檸檬酸鐵5.0 mmol/L.M液和V液各5 mL/L ;厭氧管的培養(yǎng)基除A和B后外加1.5 %?2.0%的瓊脂粉;M液、V液和還原劑檸檬酸鐵采用0.22 μ m濾膜過濾除菌后與高溫高壓滅菌的培養(yǎng)基A混合。
3.根據(jù)權利要求1，剪下的陽極膜為正方形小角，面積為4_2。
4.根據(jù)權利要求1，厭氧瓶的培養(yǎng)條件為30°C，培養(yǎng)時間為5天。
5.根據(jù)權利要求1，厭氧管滾管的滾管機為白瓷托盤，其長X寬X高=27cmX17cm X 5cm,加入冷水的體積為托盤體積的1/2。
6.根據(jù)權利要求1，菌液的稀釋倍數(shù)為1(Γ107，選擇104、105、106和17四個稀釋梯度進行滾管。
7.根據(jù)權利要求1，厭氧管在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)時需要垂直放置，35°C培養(yǎng)5天。
8.根據(jù)權利要求1，哼蓋特滾管分離和擴大培養(yǎng)反復共四次后能成功分離出單菌落。
9.根據(jù)權利要求1，培養(yǎng)基A導入?yún)捬跗亢?，外加?0%的蒸餾水，補充蒸發(fā)減少的水分體積，煮沸除氧的同時，用注射器抽真空，除氧氣操作為105°C條件下10分鐘。
10.根據(jù)權利要求1，基礎培養(yǎng)基通過高溫滅菌，滅菌時將厭氧反應瓶蓋子先順時針擰至最緊，后逆時針擰松90°。
【文檔編號】C12N1/20GK104277991SQ201310284254
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2013年7月8日 優(yōu)先權日:2013年7月8日
【發(fā)明者】朱葛夫, 鄒然, 劉超翔 申請人:中國科學院城市環(huán)境研究所