食葡萄糖食甲基菌及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一株食葡萄糖食甲基菌及其應用。該菌株為食葡萄糖食甲基菌（Methylovorusglucosotrophus）M25-40，其保藏登記號為CGMCCNo.7315。食葡萄糖食甲基菌（Methylovorusglucosotrophus）M25-40CGMCCNo.7315能夠利用甲醇進行單細胞蛋白的生產，可用于生產動物飼料添加劑。
【專利說明】食葡萄糖食甲基菌及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一株轉化甲醇生產單細胞蛋白的菌株及其在單細胞蛋白生產中的應用。具體指在利用我國豐富的甲醇資源，形成新的甲醇下游產品生產鏈時，將甲醇轉化生成單細胞蛋白產品，具有生產能耗較低、不受環境和氣候影響、勿需依賴耕地、可連續生產、易于控制和污染小等優點。解決傳統單細胞蛋白生產受原料來源限制，不能大規模生產的缺點，從而實現普通蛋白飼料新的替代源。
【背景技術】
[0002]以甲醇為原料，應用適宜的微生物為菌種繁殖生產的新型單細胞蛋白營養豐富， 含有豐富的蛋白質、氨基酸和多種維生素，用作飼料，能夠促進畜禽生產和提高飼料利用率，具有較高的附加值，可以代替魚粉、大豆、骨粉、肉類和脫脂奶粉等蛋白補充飼料。該單細胞蛋白安全無毒，已被英國、德國、比利時、荷蘭、丹麥、俄羅斯、墨西哥等國政府批準可作為動物飼料使用，在國外已使用20余年，被證明是一種安全的動物飼料添加劑。
[0003]以甲醇為原料生產的新型單細胞蛋白產品市場及生產過程中對甲醇的消耗量較大。飼料中蛋白含量一般為15%-20%，由細菌以甲醇為原料生產的新型單細胞蛋白的蛋白含量一般高于70%，若按I噸配制10噸飼料，可使其中蛋白含量達到7%以上。國內每年飼料的產量約為2億噸，若其中7%的蛋白由該新型單細胞蛋白提供，則該產品的需求量為2千萬噸；如果按生產I噸蛋白產品需要消耗2噸甲醇計算，可以消耗甲醇約4千萬噸。因此，以甲醇為原料生產的新型單細胞蛋白產品市場前景較好，同時能將部分生產過剩的甲醇轉化為附加值更高的產品形式。
【發明內容】
[0004]本發明的一個目的是提供一株食葡萄糖食甲基菌，是應用甲醇無機鹽培養基馴化濮陽中原大化廠區污泥樣品，將分離純化得到的菌株，通過真空誘變和IXlO16N+/ cm2注入誘變選育得到，該菌為食葡萄糖食甲基菌M25-40，拉丁文學名-.Methy1vorus glucosotrophus。保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位簡稱:CGMCC，保藏單位地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏日期:2013年3月15 日，保藏編號CGMCC N0.7315。
[0005]食葡萄糖食甲基菌M25-40的菌落呈現淺粉色，邊緣整齊；細胞形態和理化實驗結果如表I所示；16S rRNA基因序列如SEQ ID N0.1所 示。
[0006]本發明所提供的食葡萄糖食甲基菌M25-40可用于單細胞蛋白的生產。
[0007]本發明的另一個目的是提供一種生產新型單細胞蛋白的生產方法，包括如下步驟:用所述食葡萄糖食甲基菌M25-40轉化甲醇，得到單細胞蛋白。
[0008]在上述新型單細胞蛋白的生產方法中，所述含有甲醇的培養基中接種5%?50%所述食葡萄糖食甲基菌M25-40進行。
[0009]在上述單細胞蛋白的生產方法中，所述生產按照包括如下步驟的方法進行:在無機鹽發酵基中，加入0.2%玉米漿，1211:滅菌20111，加入經過0.22 μ m孔徑的微孔濾膜過濾除菌的甲醇，混合均勻后接種所述食葡萄糖食甲基菌M25-40。
[0010]上述無機鹽發酵基為在IL 水中加入 1.5g Κ2ΗΡ04、0.5g ΚΗ2Ρ04、0.2g MgSO4 7Η20、Ig NaCl 和 Ig (NH4) 2S04，pH 自然。
[0011]在上述單細胞蛋白的生產方法中，所述發酵的溫度為25V?37°C，所述發酵的時間為2?24h，起始甲醇濃度為0.2?1%，接種量為4?50%，裝液量為66?75%，進氣量為1: 0.3 ?1:1.6。
[0012]上述所述方法制備得到的所述新型單細胞蛋白屬于本發明的保護范圍。
[0013]應用上述方法制備得到的單細胞蛋白產品蛋白含量為71.53%?77.92%，甲醇殘留未檢出。產品動物毒性試驗結果為實際無毒級。Ames試驗、骨髓細胞微核試驗及小鼠精子畸形試驗結果為陰性。微生物檢測結果表明，產品不含沙門氏菌等致病菌。
[0014]使用本發明所提供的食葡萄糖食甲基菌glucosotrophus)M25-40轉化甲醇生產單細胞蛋白具有成本低廉、易于控制、可規模化生產等優點，可用于動物飼料添加劑的生產。
[0015]保藏說明
菌種名稱:食葡萄糖食甲基菌 拉丁名-Methylovorus glucoso trophus 菌株編號:M25-40
保藏機構:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心
保藏機構簡稱=CGMCC
地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號
保藏日期:2013年3月15日
保藏中心登記入冊編號:CGMCC N0.7315。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016]圖1 為食葡萄糖食甲基舊(Methylovorus glucosotrophus) M25-40 CGMCCN0.7315在50L發酵罐中不同濃度甲醇條件下發酵的菌體密度。
[0017]圖2 為食葡萄糖食甲基舊(Methylovorus glucosotrophus M25-40 CGMCCN0.7315在50L發酵罐中不同空氣流量條件下菌體生長與發酵液溶氧變化，
圖中I為進氣量1:0.3，2為進氣量1:1。
[0018]圖3 為食葡萄糖食甲基舊(Methylovorus glucosotrophus M25-40 CGMCCN0.7315在IOL發酵罐與50L發酵罐中不同空氣流量條件下菌體生長與發酵液溶氧變化。
【具體實施方式】
[0019]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0020]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0021]無機鹽液體發酵基:溶劑為水，溶質為K2HPO4L 5g/L，KH2PO40.5g/L，MgSO4 7H200.2g/L，NaCl Ig /L, (NH4) 2S04 lg/L，pH 自然。
[0022]固體培養基:每升上述無機鹽液體培養基添加15g瓊脂制備得到的培養基。[0023]實施例1、食葡萄糖食甲基菌(Methylovorus glucosotrophus) M25-40 CGMCC N0.7315的誘變選育及鑒定。
[0024]分別將5g濮陽中原大化廠區污泥樣品接種于裝有IOOmL含有5%甲醇的無機鹽培養基的250mL三角瓶中，180rpm，30°C馴化培養15d，間隔5d補加培養基。馴化后的液體經過固體平板分離純化得到單菌落，其中菌株M在含有5%甲醇的無機鹽液體培養基中生長性能最好。以菌株M為出發菌株，用無菌棉簽將固體培養基上劃線擴大培養生長出的菌株M加入到5mL水或5%海藻糖溶液中，振蕩，取0.1mL涂60mm平皿，干燥后分別進行劑量為IXlO15 NVcm2,5 X IO15 NVcm2和IXlO16 N+/cm2的離子注入，同時設置不同劑量下的真空處理組，誘變后用3mL水洗下，加入到IOOmL含有5%甲醇的無機鹽培養基中搖床培養24h，分別于固體培養基上分離純化。將分離得到的單菌落在固體培養基上擴大培養，用無菌棉簽擦下長出的菌落，洗溶于無菌水中。將上述菌液按1%的接種量分別接種于裝有IOOmL含有5%或
0.2%甲醇無機鹽培養基的250mL三角瓶中，180rpm，30°C條件下發酵。與出發菌株M相比， 發酵24h，經過IOmin真空誘變后分離得到的菌株M25發酵液0D_值分別提高了 79.6%和 34.54%。再次以菌株M25為出發菌株進行上述誘變，在海藻糖的保護下經過I X 1016N+/cm2 注入誘變選育得到菌株M25-40。該菌株與出發菌株M25相比，發酵12h發酵液0D_值提高了 37.38%o
[0025]菌株M25-40在固體培養基上的菌落呈現淺粉色，邊緣整齊；細胞形態和理化實驗結果如表I所示；16S rRNA基因序列如SEQ ID N0.1所示。根據細胞顯微形態、理化實驗結果和16S rRNA基因序列數據，將菌株M25-40鑒定為食葡萄糖食甲基菌 Wwco1SotroMM)，并于2013年3月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所)，保藏登記編號為CGMCC N0.7315。
[0026]表I細胞形態 和理化實驗結果
【權利要求】
1.食葡萄糖食甲基菌，其特征在于該菌株為食葡萄糖食甲基菌Ofe級FhwrM A/cosoiroM ）M25-40，其保藏登記號為 CGMCC Na.7315。
2.權利要求1所述的食葡萄糖食甲基菌在單細胞蛋白生產中的應用。
3.根據權利要求2所述的食葡萄糖食甲基菌在單細胞蛋白生產中的應用，其特征在于:所述單細胞蛋白生產的方法，是將食葡萄糖食甲基菌接種到含有甲醇的體系中發酵。
4.根據權利要求3所述的食葡萄糖食甲基菌在單細胞蛋白生產中的應用，其特征在于:所述發酵溫度為25°C?35°C。
5.根據權利要求4所述的食葡萄糖食甲基菌在單細胞蛋白生產中的應用，其特征在于:所述發酵溫度為30°C?35°C。
6.根據權利要求3?5中的任意一項所述的食葡萄糖食甲基菌在單細胞蛋白生產中的應用，其特征在于:所述含甲醇的體系中甲醇的濃度為0.2?1%，優選為0.2%?0.3%。
7.根據權利要求3?6中的任意一項所述的食葡萄糖食甲基菌在單細胞蛋白生產中的應用，其特征在于:在所述含有甲醇的體系中接種食葡萄糖食甲基菌M25-40，接種量為4?50%，優選為4?14.28%ο
8.根據權利要求3?7中任意一項所述的食葡萄糖食甲基菌在單細胞蛋白生產中的應用，其特征在于:在所述含有甲醇的體系中接種食葡萄糖食甲基菌M25-40，每升容積空氣流量為10?80L/h的條件下發酵，每升容積空氣流量優選為60?80 L/h。
9.根據權 利要求3?8所述的食葡萄糖食甲基菌在單細胞蛋白生產中的應用，其特征在于:所述的含有甲醇的體系是指，在無機鹽發酵基中，加入0.2%玉米漿，121 °C滅菌20min，加入經過0.22 μ m孔徑的微孔濾膜過濾除菌的甲醇；上述無機鹽發酵基為在IL水中加入 1.5g K2HP04、0.5g ΚΗ2Ρ04、0.2g MgSO4.7H20、lg NaCl 和 Ig (NH4)2SO4, pH 自然。
【文檔編號】C12R1/01GK103436463SQ201310284187
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年7月8日 優先權日:2013年7月8日
【發明者】王雁萍, 宋燦, 焦湞, 魏靈朝, 李宗偉, 晁一旸, 蘇明杰, 張秀全, 李寧, 蔣元力, 李伍成 申請人:河南煤業化工集團研究院有限責任公司, 鄭州大學