一種蜂球囊菌發酵生產脂肪酶的培養基及方法
【專利摘要】本發明涉及真菌的發酵培養基及工藝。更具體地，本發明涉及一種蜂球囊菌發酵生產脂肪酶的培養基及方法。所述培養基的原料含有乳化橄欖油5%（w/v），果糖0.25--2%（w/v），酵母浸粉0.05--0.4%（w/v），Na+0.015-0.12mol/L，VB20.005-0.04%（w/v），pH7.4-7.7，將發酵種子液接種于該培養基，250mL的三角瓶裝液量為75mL，接種量5%，于25℃，轉速120r/min下培養。本發明的發酵方法有發酵周期短；條件溫和，易于控制；提供的用于蜂球囊菌發酵生產脂肪酶的培養基，具有脂肪酶產率高，脂肪酶活力高等優點。
【專利說明】一種蜂球囊菌發酵生產脂肪酶的培養基及方法【技術領域】
[0001]本發明涉及真菌的發酵培養基及工藝。更具體地，本發明涉及一種蜂球囊菌發酵生產脂肪酶的培養基及方法。
【背景技術】
[0002]蜜蜂球囊菌是寄生于蜜蜂幼蟲的一種真菌,可以引起蜜蜂白堊病。蜜蜂白堊病不僅使蜜蜂數量減少，而且蜂蜜產量也下降，近幾年，有證據表明這種病的發生概率有增加的趨勢。蜜蜂球囊菌也是影響我國養蜂業發展的潛在病害之一，對我國養蜂業的發展影響巨大。本發明就是希望從脂肪酶上分析蜜蜂球囊菌，提高脂肪酶的產量，對推動蜜蜂白堊病的防治研究具有指導性意義，為以后蜜蜂球囊菌的致病機理的研究奠定了基礎。
[0003]脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3)是廣泛存在于各類動物、植物和微生物中的一種酶，在脂質代謝中發揮重要的作用，具有顯著的生理意義和生產應用的潛能。微生物來源的脂肪酶含量最為豐富。由于微生物種類多、繁殖快，易發生遺傳變異，產生的脂肪酶具有比動植物脂肪酶作用更廣的PH值、反應溫度范圍以及底物專一性；而且微生物來源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，適合于工業化大生產和樣品提純，因此，微生物脂肪酶是工業用脂肪酶的重要來源，是生物技術和有機化學應用中使用最為廣泛的酶類之一。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于提供一種蜂球囊菌發酵生產脂肪酶的培養基及方法。
[0005]本發明首先提供了一種蜂球囊菌發酵生產脂肪酶的培養基，培養基的原料含有乳化橄欖油5% (w/v)，果糖0.25—2% (w/v)，酵母浸粉0.05— 0.4% (w/v), Na+0.015-0.12 mol/L, VB2 0.005-0.04 % (w/v)，pH7.4—7.7。
[0006]本發明優選的一種蜂球囊菌發酵生產脂肪酶的培養基含有乳化橄欖油5% (w/v),果糖 2% (w/v)，酵母浸粉 0.4% (w/v), NaCl 0.015mol/L, VB2 0.02 % (w/v)，pH7.4。
[0007]其次，本發明還提供了一種蜂球囊菌發酵產脂肪酶的方法，所述方法包含以下步驟:
(a)將蜂球囊菌(鄭志陽，李江紅，梁勤，陳大福.蜜蜂球囊菌分泌多種胞外酶侵染蜜蜂幼蟲.福建農林大學學報，2011，40(3)，9月30日)接種于種子培養基，制得發酵種子液；
(b)將步驟(a)中制得的發酵種子液接種于上述發酵生產脂肪酶的培養基中，250mL的三角瓶裝液量為75mL，接種量5%，于25°C，轉速120 r/min下培養。
[0008]所述種子培養基PDA的原料含有:按培養基重量計，馬鈴薯20%，蔗糖2%。
[0009]采用本發明優化后的培養基，菌齡3d，發酵周期96h，發酵產生結果蜂球囊菌產脂肪酶為14U/mL以上。
[0010]本發明的發酵方法有發酵周期短；條件溫和，易于控制；提供的用于蜂球囊菌發酵生產脂肪酶的培養基，具有脂肪酶產率高，脂肪酶活力高，脂肪酶活性穩定以及重復性好等優點。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011]圖1為對硝基苯酚標準曲線。
【具體實施方式】
[0012]本發明用下列實施例來進一步說明本發明，但本發明的保護范圍并不限于下列實施例。
[0013]實施例1
單因素實驗確定培養基最優成分
(I)種子培養基配制:馬鈴薯去皮，切塊，稱取200g，沸水煮30min，6層紗布過濾，稱取20g葡萄糖,加蒸懼水定容至1000mL, pH自然。高壓滅菌121。。，20min。
[0014](2)發酵種子液的制備:將蜂球囊菌接種于馬鈴薯瓊脂培養基上，于30°C下培養3d，待其產孢子，即活化；將活化后的菌株用接種針將蜂球囊菌菌塊(0.5X0.5cm)接種至種子培養基，25°C，轉速120 r/min下培養48h即為發酵種子液。
[0015](3)酶液的制備:取步驟(2)中的發酵種子液接種發酵培養基，25°C，轉速120 r/min下培養72h，所得發酵液在4°C下，8000 r/min離心，lOmin，得上清液即為粗酶液，4°C
保存，待用。
[0016](4)脂肪酶酶活測定:酶活測定方法采用對硝基苯酚法。酶活定義為:在PH
8.0、50 °C條下,每分鐘水解p-NPP釋放I ii mo I對硝基苯酹(p-nitrophenol)所需的酶量為I個脂肪酶活力單位(U)。
[0017]方法:溶液A: 150 mg p-NPP溶于50 mL異丙醇；溶液B:500 mL pH 8.0的Tris-HCl緩沖液中加入2.22 g Triton X-100和0.56 g阿拉伯膠。
[0018]取2個試管(分別是對照管和樣品管)，各加溶液B 2.85 mL和底物溶液A 0.1 mL(緩慢混合，該溶液至少可穩定2 h)。50 °C水浴中預熱5 min，然后在對照管中加入已滅活的酶液0.05 mL，樣品管中加入酶液0.05 mL，立即混勻計時。在水浴中準確反應10 min時馬上測定410 nm下酶水解產生的p-nitrophenol的吸光度值(OD41t!值)。酶活計算公式:A= CtA1 - A0] XK + C0) XV1XN / (V2Xt)
A——樣品酶活(u/mL) A1——樣品的吸光度值(OD410值)A0——空白對照的吸光度值
(OD410值校準為0) K-p-nitrophenol標準曲線的斜率
C0-p-nitrophenol標準曲線的截距N-稀釋倍數V1-反應液的體積(3 mL)
V2——酶液的體積(0.05 mL) t——反應時間(10 min)
(5)標準曲線的制作:
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[0019](6)不同碳源、氮源、金屬離子、維生素對產脂肪酶的影響
(a)碳源對酶產量的影響，在含有乳化橄欖油50.0 g / L，K2 HPO4 1.0 g / L，CaCl20.lg/ L, NaCl 0.5 g / L，Mg2SO4 ? 7H20 0.1 g / L, (NH4)2SO4 l.0g/ L，的培養基中分別添加10.0 g / L葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、海藻糖、木糖醇、甘露醇、a-乳糖、可溶性淀粉、D-山梨醇、甲殼素、糊精、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、檸檬酸，以不加任何碳源為對照。0.1MPa，滅菌20min (下同)。各接入10%的種子發酵液，在25°C、120r/min的搖床中培養4d測酶活，結果見表1。
[0020](b)氮源對酶產量的影響，在含有乳化橄欖油50.0 g / L，K2 HPO4 1.0 g / L，CaCl2 0.1 g / L, NaCl 0.5 g / L, Mg2SO4 ? 7H20 0.1 g / L，，葡萄糖 10.0 g / L 的培養基中分別添加1.0 g / L的胰蛋白胨、酵母浸粉、甘氨酸、過硫酸銨、蛋白胨、尿素、酸水解酪蛋白、NH4N03、NaN03、(NH4) 2S04、KN03、(NH4) 2HP04,以不加任何氮源為對照。滅菌，各接入10%的種子發酵液，在25°C、120r/min的搖床中培養4d檢測酶活性，結果見表2。
[0021](C)金屬離子對產酶的影響，在含有乳化橄欖油50.0 g / L、(MM)2SO4 1.0 g / L，葡萄糖10.0 g / L的培養基分別添加0.02496mol/L (以6 (a)中含有的金屬離子按其濃度換算得來)KCUMgCl2 ? 6H20、NaCl、ZnCl2、CuCl2 ? 2H20、MnCl2 ? 4H20、CaCl2'FeCl2 ? 4H20、FeCl3 *6H20、BaCl2*2H20、，以不加任何金屬離子為對照。滅菌，各接入10%的種子發酵液，在25°C、120r/min的搖床中培養4d檢測酶活性，結果見表3。
[0022](d)維生素對酶產 量的影響，在含有乳化橄欖油50.0 g / L，K2 HPO4 1.0 g / L,CaCl2 0.1 g / L, NaCl 0.5 g / L, Mg2SO4 ? 7H20 0.1 g / L, (MM)2SO4 1.0 g / L，葡萄糖10.0 g / L的培養基中分別添加0.01%葉酸、煙酸、硫胺素VB1' VB4、核黃素VB2、吡哆醇類VB6、抗壞血酸V。、VE,以不加任何維生素為對照。滅菌，各接入10%的種子發酵液，在25°C、120r/min的搖床中培養4d檢測酶活性，結果見表4。
[0023](e) pH值對酶產量的影響，在含有乳化橄欖油50.0 g / L，K2 HPO4 1.0 g / L，CaCl2 0.1 g / L, NaCl 0.5 g / L, Mg2SO4 ? 7H20 0.1 g / L, (MM)2SO4 1.0 g / L，葡萄糖10.0 g / L 的培養基中分別用 NaOH 或 HCl 調節 pH 值為 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，滅菌。各接入10%的種子發酵液，在25°C、120r/min的搖床中培養4d檢測酶活性，結果見表5。
[0024]表1不同碳源對酶產量的影響
序+?-mm+平均_活 u:/n?L)
ICK丨6.10906
【權利要求】
1.一種蜂球囊菌發酵生產脂肪酶的培養基，其特征在于，所述培養基的原料含有乳化橄欖油 5% (w/v)，果糖 0.25—2% (w/v)，酵母浸粉 0.05— 0.4% (w/v), Na+ 0.015-0.12mol/L, VB2 0.005-0.04 % (w/v)，pH7.4—7.7。
2.一種如權利要求1所述蜂球囊菌發酵生產脂肪酶的培養基，其特征在于，所述培養基含有乳化橄欖油5% (w/v)，果糖2% (w/v)，酵母浸粉0.4% (w/v), NaCl 0.015mol/L,VB2 0.02 % (w/v), pH7.4。
3.—種蜂球囊菌發酵產脂肪酶的方法，其特征在于，所述方法包含以下步驟: (a)將蜂球囊菌接種于種子培養基，制得發酵種子液； (b)將步驟(a)中制得的發酵種子液接種于權利要求1或者2所述的發酵生產脂肪酶的培養基中，250mL的三角瓶裝液量為75mL，接種量為5%，于25°C、轉速120 r/min條件下培養。
4.如權利3所述蜂球囊菌發酵產脂肪酶的方法，其特征在于，所述種子培養基為PDA，其原料含有:按培養基重量計，馬鈴薯20%，蔗糖2%。
【文檔編號】C12R1/645GK103484440SQ201310283999
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年7月8日 優先權日:2013年7月8日
【發明者】邱君志, 李小霞, 郭慶豐, 何肖云, 張以盼, 曹麗萍, 涂潔, 孟麗雪, 董冬, 陳大福 申請人:福建農林大學