十字花科黑腐病菌致病相關的基因的用途【專利摘要】本發明提供了一種與十字花科黑腐病病菌致病相關的基因在防治植物十字花科黑腐病病害中的用途，該基因是編碼序列表中序列2所示蛋白質的DNA序列；具體地，是序列表中序列1所示的DNA序列。本發明鑒定了十字花科黑腐病菌致病相關的基因XC2038，能夠為防治十字花科植物黑腐病病害提供藥物靶標。【專利說明】十字花科黑腐病菌致病相關的基因的用途【
技術領域：
】[0001]本發明涉及植物病原細菌的致病相關基因及其用途，尤其涉及十字花科黑腐病病菌致病相關的基因及其用途。【
背景技術：
】[0002]植物病害一直是農作物減產、品質降低的主要因素之一。隨著病原菌對藥物抗性的增強，農藥用量在不斷增加，這不僅加劇了環境污染、藥物殘留，也大大增加了農業成本，因此，亟待研發新的防病治病策略和新型的無公害藥物。弄清植物病原菌侵染寄主的遺傳機制是開發新型藥物和防病策略的關鍵。[0003]十字花科黑腐病菌(Xcc,Xanthomonascampestrispv.campestris)是一種能在全球范圍內引起所有十字花科植物黑腐病的革蘭氏陰性細菌。該菌能在寄主的任何生長期通過水孔、氣孔或傷口侵入植物體內，引起十字花科黑腐病病害，寄主包括甘藍、花椰菜、大白菜、蘿卜以及油菜等。典型的黑腐病癥狀是在葉緣上形成V字形病斑。隨著病斑的擴大，葉脈變黑，因而被稱為黑腐病。黑腐病被認為是對十字花科植物危害最為嚴重的病害，尤其在熱帶和亞熱帶地區，溫度和濕度都適宜于該菌的生長繁殖，因此發病更加嚴重。由于遺傳穩定性和遺傳可操作性，十字花科黑腐病菌一直被用作研究微生物與植物相互作用分子機理的模式細菌。因此，鑒定與十字花科黑腐病菌致病相關的基因，對防治植物病害具有顯著的意義。[0004]目前，，在十字花科黑腐病菌致病變種Xcc8004的基因組中，發現編號為XC2038的基因的開放閱讀框(ORF,OpenReadingFrame)所編碼的蛋白注釋為假定蛋白(HypotheticalProtein)。假定蛋白是指因功能未知而未被鑒定的新基因編碼的蛋白。在Xcc8004的基因組中發現注釋為假定蛋白的ORF較多。目前，已鑒定到被注釋為假定蛋白且與十字花科黑腐病菌致病相關的新基因，如XC0241基因，即被鑒定為致病相關的III型效應物基因。對于XC2038基因的功能目前卻鮮有報道。[0005]參考文獻[0006]KBeringer,J.，Beynon，J.,Buchanan-Wollaston,A.，Johnston，A.Transferofthedrug-resistancetransposonTn5toRhizobium.Nature.1978.276:633-634.[0007]2、Jiang,B.L，He，Y.Q.，Cen，W.J.，Wei，H.Y.，Jiang,G.F.，Jiang,W.，Hang，X.H.，Feng,J.X.，Lu，G.T.，Tang,D.J.ThetypeIIIsecretioneffectorXopXceNofXanthomonascampestrispv.campestrisisrequiredforfullvirulence.ResearchinMicrobiology.2008.159(3):216-220.[0008]3、Jiang,G.F.，Jiang,B.L，Chen,LG.，Liu,S.，Wei，H.Y.，Cen,W.J.，Hang，X.H:，Wen,Z.Z.，Tang,D.J.，Lu，G.T.，He，Y.Q.，Yu,D.Q.，Tang,J.LTheT3SeffectorXopXccNofXanthomonascampestrispv.campestrisisinvolvedinplantdefensethroughinterferencewithphotosystems,reactiveoxygenspeeies(ROS)generation，andcallosedeposition.AfficanJournalofMicrobiologyResearch.2012.6(15):3673-3683.[0009]4>Liu,Y.G.,Whittier,R.F.ThermalasymmetricinterlacedPCR!automatableamplificationandsequencingofinsertendfragmentsfromPlandYACclonesforchromosomewalking.Genomics.1995.25(3):674-681.[0010]5、Qian,ff.，Jia,Y.，Ren,S.X.,He,Y.Q.，Feng,J.X.，Lu,L.F.，Sun,Q.，Ying,G.，Tang,D.J.,Tang,H.,ffu,ff.,Hao,P.,Wang,L.,Jiang,B.L.,Zeng,S.,Gu,ff.Y.,Lu,G.,Rong,L.,Tian,Y.,Yao,Z.,Fu,G.,Chen,B.,Fang,R.,Qiang,B.,Chen,Z.,Zhao,G.P.,Tang,J.L.,He,C.ComparativeandfunctionalgenomicanalysesofthepathogenicityofphytopathogenXanthomonascampestrispv.campestris.GenomeResearch.2005.15(6):757-767.[0011]6>Sharma,S.,Signer,E.TemporalandspatialregulationofthesymbioticgenesofRhizobiummelilotiinplantarevealedbytransposonTn5-gusA.Genes&Development.1990.4(3):344-356.[0012]7、Staskawicz,B.,Dahlbeck,D.,Keen,N.,Napoli,C.MolecularcharacterizationofclonedavirulencegenesfromraceOandracelofPseudomnonassyringaepv.glycinea.JournalofBacteriology.1987.169(12):5789-5794.【
發明內容】[0013]本發明所要解決的技術問題是提供一種十字花科黑腐病菌致病相關的基因的用途，通過鑒定該基因為防治十字花科植物黑腐病病害提供藥物靶標。[0014]為了解決上述技術問題，本發明提供了一種與十字花科黑腐病病菌致病相關的基因在防治植物十字花科黑腐病病害中的用途，該基因是編碼序列表中序列2所示蛋白質的DNA序列。[0015]優選地，該基因是序列表中序列I所不的DNA序列。[0016]本發明鑒定了十字花科黑腐病菌致病相關的基因XC2038，能夠為防治十字花科植物黑腐病病害提供藥物靶標。【專利附圖】【附圖說明】[0017]圖1為本發明鑒定的XC2038基因克隆的酶切電泳圖譜；[0018]圖2為在本發明鑒定的XC2038基因插入突變體164H09的PCR驗證凝膠圖；[0019]圖3為在本發明鑒定的XC2038基因插入突變體164H09的胞外多糖、泳動性及生物聚膜表型檢測；[0020]圖4為本發明鑒定的XC2038基因插入突變體164H09的致病性試驗。【具體實施方式】[0021]以下結合附圖和優選實施例對本發明的技術方案進行詳細地闡述。應該理解，以下列舉的實施例僅用于說明和解釋本發明，而不構成對本發明技術方案的限制。[0022]本發明旨在提供與十字花科黑腐病菌致病相關的基因XC2038。首先確定XC2038基因與十字花科黑腐病致病性的關系，并由此得到該基因在防治植物十字花科黑腐病方面的用途。[0023]本發明所提供的與十字花科黑腐病菌致病相關的基因XC2038，是編碼序列表中序列2所不蛋白質的DNA序列。[0024]并且，該基因是序列表中序列I所不的DNA序列。[0025]目前，該與十字花科黑腐病菌致病相關的基因XC2038(以下簡稱XC2038基因)的序列已在美國國家生物技術信息中心(NCBI,NationalCenterofBiotechnologyInformation)公布，其基因組序列號為NC_007086，該基因編碼蛋白序列號YP_243119;攜帶該基因的質粒PCXC2038已在廣西大學亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室保存。[0026]序列表中序列I的DNA是十字花科黑腐病菌8004菌株的基因，由960個堿基組成，含完整的XC2038基因，自5’端的第498至875位核苷酸為該基因的0RF，自5’端的第498至500位核苷酸為該基因的起始密碼子ATG，自5’端的第876至878位核苷酸為終止密碼子TGA。[0027]序列表中序列2的蛋白質是XC2038基因編碼的產物，由126個氨基酸組成。該蛋白質預測分子量為13926.73道爾頓，等電點為6.41。[0028]本發明通過以下方法步驟鑒定XC2038基因與十字花科黑腐病致病相關:[0029](一)十字花科黑腐病菌突變體庫的構建[0030]以大腸桿菌和Xcc之間的穿梭質粒pLAFRl為載體將Tn5gusA5引入Xcc野生型菌株8004，然后通過引入不相容質粒pPHlJI驅趕pLAFRl，通過卡那霉素作為抗生素，抗性標記篩選Xcc::Tn5gusA5插入突變體，結合Xcc全基因組序列和TAIL-PCR(ThermalAsymetrixInterlaced-PCR)技術,確定Tn5gusA5在基因組上的插入位置，并對插入位置進行PCR驗證。[0031]通過考察突變體的致病性、胞外酶活性、胞外多糖合成等表型的變化，篩選致病相關基因，本發明涉及其中一個新的致病相關基因，即XC2038基因(編碼假定蛋白)，其插入突變體編號為164H09(該編號為自命名編號，即十字花科黑腐病菌突變體庫的XC2038基因的插入突變體的編號)。[0032](二)XC2038基因的克隆及序列測定[0033]根據XC2038的基因序列，設計引物(XC2038F:GGGGAATTCGCGCCAAGCAACGGACAGACG和XC2038R:GGGGGATCCAACACGACGCCGACCAGCACG)，以十字花科黑腐病菌8004菌株總DNA為模板，用PCR法擴增該基因全長序列，并將其克隆至克隆載體pGEM3Zf(+)中，用雙脫氧核苷酸法在ABI377DNA自動測序儀上測定DNA核苷酸序列。將測序驗證正確的XC2038基因序列克隆至穿梭載體PLAFRJ中，獲得了含該基因的重組質粒PCXC2038。[0034]將該質粒用EcoR1、BamHI酶切，除了一個22kb的載體條帶外，還有一個960bp的外源片段，請參見圖1，其中，Ml:A/HindIII2標準DNA，片段大小從大到小依次為:23.1kb,9.4kb，6.6kb，4.4kb，2.4kb，2.0kb；M2:IOObp標準DNA，片段大小從大到小依次為:3kb,2kb,1.5kb,1.2kb,lkb，0.9kb，0.8kb，07kb等；I為XC2038基因片段(960bp)。[0035](三)在XC2038基因插入突變體164H09的驗證[0036]對插入突變體164H09進行TAIL-PCR測序定位，發現其插在XC2038基因內。[0037]用轉座子Tn5上spI側的一條引物(CCGCCGAAGAGAACACAGAITTA)和下游基因XC2037的一條引物(AGTTCGGAGGAATCACGCGG)配對進行PCR驗證，產物預期大小837bp。請參見圖2，其中，I為IOObp標準DNA；2為XC2038基因插入突變體164H09(837bp)。[0038](四)XC2038基因插入突變體164H09的胞外多糖、泳動性及生物聚膜表型檢測[0039]將野生型菌株8004，XC2038突變體菌株164H09和互補菌株C164H09培養于NYGB培養基(每升含蛋白胨5.0g，酵母粉3.0g，甘油20.0g，pH7.0)中，28°C搖床過夜培養。[0040]對于胞外多糖的檢測用NYGB培養基將培養好的待測菌液的0D_值調為一致，用移液器精確取2iU的培養物，分別接種于含2%葡萄糖的NYGA(NYGB培養基加約3%的瓊脂粉)平板上，在28°C培養箱中培養，3天后再將該平板放置于培養箱外，見光培養2~5天，通過比較菌落的形態大小對EPS的產量進行比較；[0041]對于泳動性的檢測用NYGB培養基將培養好的待測菌液的0D_值調為一致，各菌體取5u1，點在0.3%瓊脂糖的NYGA平板上，28°C靜置培養48小時后觀察并照相記錄；對于生物聚膜的檢測用NYGB培養基將培養好的待測菌液的0D_值調為一致，按照10%的比例轉接至LB液體培養基內，28°C靜置培養5-7天后，觀察并記錄結果。[0042]結果表明，XC2038突變體菌株164H09影響胞外多糖的產量、菌株的泳動性及生物聚膜的形成，而其互補株C164H09能很好的恢復至野生型的水平。由于胞外多糖的產量、菌株的泳動性及生物聚膜的形成都是病原菌重要的致病生化因子，這說明XC2038與致病相關；請參見圖3，其中，對象A為野生型；對象B為XC2038基因插入突變體164H09;對象C為XC2038基因插入突變體的互補株C164H09。[0043](五)XC2038基因插入突變體164H09后的致病性檢測[0044]試驗所用寄主植物為蘿卜苗(種名為RaphanussativusL.var.radiculusPers.)，所用的接種方法為剪葉法。將野生型菌株8004、XC2038基因插入突變體164H09和互補菌株C164H09在28°C下進行液體培養15-18小時。[0045]用NYGB稀釋至OD6tltl=0.001，用滅菌剪刀在菌液中浸泡5秒鐘后，在健康葉片距葉尖l-2cm垂直葉脈的方向剪到中軸處，停留5秒鐘，被接種的植物在25-30°C培養一周后觀察結果，正對照選用十字花科黑腐病菌8004菌株。[0046]上述致病試驗表明，XC2038基因的插入突變體164H09的致病性為零，參見圖4，而突變體的互補株C164H09能將降低的致病性很好的恢復到野生型的水平。這說明XC2038基因是一個重要的致病相關基因。在圖4中，對象A為野生型；對象B為XC2038基因插入突變體164H09;對象C為XC2038基因插入突變體164H09的互補株C164H09。[0047]在本發明的上述方法步驟中所用到的材料包括:[0048]大腸桿菌(Escherichiacoli)株系JM109；[0049]載體PCEM-3Zf(+)購自Promega公司；[0050]pLAFRl、pPHlJ1、pLAFRJ為本研究室保存的(參見參考文獻7)柯斯質粒；[0051]限制性內切酶、修飾酶等試劑購自Promega、Stratagene>QIAGEN公司、日本制藥株式會社。【權利要求】1.一種與十字花科黑腐病病菌致病相關的基因在防治植物十字花科黑腐病病害中的用途，其特征在于，所述基因是編碼序列表中序列2所示蛋白質的DNA序列。2.按照權利要求1所述的用途，其特征在于，所述基因是序列表中序列I所示的DNA序列。【文檔編號】C12R1/64GK103484535SQ201310265130【公開日】2014年1月1日申請日期:2013年6月28日優先權日:2013年6月28日【發明者】蔣國鳳,姜伯樂,唐紀良,何勇強,梁曉夏,杭小紅,韓路芬申請人:廣西大學