用于長期造血種群恢復的方法和組合物的制作方法

用于長期造血種群恢復的方法和組合物的制作方法
【專利摘要】一種用于長期造血種群恢復的方法和組合物。公開了分離臍帶血細胞的CD133+/CD45-/GlyA-亞群的方法。在一個實施方案中，該方法包括提供臍帶血細胞的初始群；使該初始細胞群與對CD133特異的第一抗體、對CD45特異的第二抗體以及對血型糖蛋白A(GlyA)特異的第三抗體，在足以允許每一抗體與初始細胞群每一細胞上的其靶標(如果存在的話)結合的條件下接觸；以及分離CD133+、CD45-且GlyA-的細胞亞群。還提供了從臍帶血分離的CD133+/GlyA-/CD45-干細胞分離群，在受試者中種群恢復細胞類型的方法，骨髓移植的方法，在CD133+/GlyA-/CD45-干細胞中誘導造血能力的方法，以及包括CD133+/GlyA-/CD45-干細胞的細胞培養系統。
【專利說明】用于長期造血種群恢復的方法和組合物
[0001]本申請是國際申請日為2009年11月16日、國際申請號為PCT/US2009/064614、進入國家階段的申請號為200980154497.X、發明名稱為“用于長期造血種群恢復的方法和組合物”的PCT申請的分案申請。
[0002]與相關申請的交叉引用
現在公開的主題要求2008年11月14日提交的美國臨時專利申請系列號61/199，356的優先權權益；其公開內容在此通過引用全文并入本文。
[0003]資助聲明
該成果得到了美利堅合眾國國立衛生研究所資助ROl CA106281-01和ROl DK074720的支持；因此，美國政府對本文公開的主題擁有某些權利。
發明領域
[0004]當前公開的主題在一些實施方案中涉及用于在受試者中種群恢復細胞類型的方法。在一些實施方案中，當前公開的主題涉及給有需要的受試者以一定的量及通過一定的途徑施與包含多個分離的臍帶血衍生的⑶133+/GlyA_/⑶45_干細胞的組合物，所述量和途徑足以允許用于在受試者中種群恢復細胞類型的臍帶血衍生的至少一部分移入受試者的靶部位并在其中分化，由此在受試者中種 群恢復細胞類型。
[0005]背景
血液移植術的發展增加了對分離自組織可相容供體的造血干細胞(HSC)的需求。公知合適的骨髓(BM)供體通常是短缺的。不幸的是，臍帶血(CB)含有的HSC絕對數量比BM低得多，使得CB在成人患者的治療用途中不那么優選。此外，當前極難以可靠地擴增分離自BM和CB-HSC的長期種群恢復(LT)的HSC，使得加重了對新的LT-HSC供應的需求。
[0006]因此，假設胚胎干細胞衍生的HSC可能比分離自諸如BM和CB的常規來源的HSC具有許多優勢。然而，這已被證明難以應用，因為難以應用和優化使胚胎干細胞(ESC)沿著造血譜系分化的策略。此外，人類ESC是各種限制的對象，這限制了它們的可利用性和有用性，即使對于實驗研究也如此。
[0007]發明概述
本概述列出了當前公開的主題的數個實施方案，以及在許多情況下列出了這些實施方案的變形和互換。這一概述僅是許多且不同的實施方案的示例。給定實施方案的一個或更多個代表性特征的提及同樣是示例性的。此類實施方案可在有或無該提及的特征的情況下一般地存在；同樣地，這些特征可應用于當前公開的主題的其他實施方案，而無論在這一概述中列出與否。為避免過多的重復，這一概述沒有列出或提示此類特征的所有可能組合。
[0008]當前公開的主題提供了分離臍帶血細胞的⑶133+/⑶45_/GlyA_亞群的方法。在一些實施方案中，該方法包括(a)提供臍帶血細胞的初始群；(b)使該初始細胞群與對CD133特異的第一抗體、對CD45特異的第二抗體以及對血型糖蛋白A(GlyA)特異的第三抗體，在足以允許每一抗體與初始細胞群每一細胞上的其靶標(如果存在的話)結合的條件下接觸；以及(c)分離⑶133+、⑶45_且617么_的細胞亞群。在一些實施方案中，該接觸步驟包括使臍帶血細胞與特異性結合⑶133、GlyA和⑶45的多個抗體同時地或反復地接觸。在一些實施方案中，該方法還包括從CD133+/GlyA7CD45_細胞中分離ALDHs細胞，從CD133+/GlyA_/⑶45_細胞中分離ALDHffi細胞，或分別從⑶133+/GlyA_/⑶45_細胞中分離ALDHs細胞和ALDH低細胞。
[0009]當前公開的主題還提供了包含基本上純化的分離自臍帶血(CB)的⑶133+/GlyA_/⑶45_細胞的分離的干細胞群。在一些實施方案中，該⑶133+/GlyA_/⑶45_細胞是八0)!^細胞。在一些實施方案中，該CD133+/GlyA_/CD45_細胞是ALDHffi細胞。
[0010]當前公開的主題還提供了包含當前公開的分離的干細胞群的組合物。在一些實施方案中，該組合物還包含一種或更多種可藥用載體和/或賦形劑。在一些實施方案中，該可藥用載體和/或賦形劑對于在人類中的應用是可藥用的。
[0011]當前公開的主題還提供了用于在受試者中種群恢復細胞類型的方法。在一些實施方案中，該方法包括以一定的量和通過一定的途徑給受試者施與在可藥用載體中包含多個分離的⑶133+/GlyA_/⑶45_干細胞的組合物，所述量和途徑足以允許⑶133+/GlyA_/CD45—干細胞的至少一部分移入靶部位并在其中分化，由此在受試者中種群恢復細胞類型。在一些實施方案中，該細胞類型是造血細胞。在一些實施方案中，該靶部位包括骨髓。在一些實施方案中，受試者是哺乳動物。在一些實施方案中，哺乳動物是人。在一些實施方案中，該多個分離的CD1337GlyA7CD45_干細胞包含分離自臍帶血的CD1337GlyA7CD45_干細胞。在一些實施方案中，該可藥用載體對于對于在人類中的應用是可藥用的。
[0012]當前公開的主題還提供了用于骨髓移植的方法。在一些實施方案中，該方法包括給至少部分地缺乏骨髓的受試者施與包含有效量的分離自臍帶血的⑶133+/GlyA_/⑶45_干細胞的藥物制備物，其中該有效量包含分離的⑶133+/GlyA_/⑶45_干細胞足以移入受試者骨髓的量。在一些實施方案中，該至少部分地缺乏骨髓的受試者經歷了至少部分地減少該受試者骨髓的預治療。在一些實施方案中，該預治療包括脊髓減少或脊髓抑制治療。在一些實施方案中，該預治療包括給該受試者施與免疫治療、化療、放射治療或其組合。在一些實施方案中，放射治療包括全身放射。在一些實施方案中，該施與包括靜脈內施與該藥物制備物。在一些實施方案中，該⑶133+/GlyA7⑶45-干細胞是⑶133+/GlyA7⑶457ALDH高干細胞。在一些實施方案中，該方法還包括在施與步驟前在0P9細胞飼養層的存在下共培養CD133+/GlyA7CD45-干細胞至少 5 天。
[0013]當前公開的主題還提供了用于誘導⑶133+/GlyA_/⑶45_干細胞的造血能力的方法。在一些實施方案中，該方法包括(a)提供⑶133+/GlyA_/⑶45_干細胞；和(b)在0P9飼養層的存在下共培養CD133+/GlyA_/CD45_干細胞足以誘導該CD133+/GlyA_/CD45_干細胞的造血能力的時間。在一些實施方案中，該⑶133+/GlyA_/⑶45_干細胞是骨髓衍生的⑶133+/GlyA7⑶45—干細胞、臍帶血衍生的⑶133+/GlyA7⑶45—干細胞、或其組合。在一些實施方案中，該⑶133+/GlyA7⑶45-干細胞是⑶133+/GlyA7⑶457ALDH低干細胞。在一些實施方案中，該⑶133+/GlyA7⑶45-干細胞是⑶133+/GlyA7⑶457ALDH高干細胞。在一些實施方案中，該造血能力包括當將該⑶133+/GlyA_/⑶45_干細胞施與受試者時將骨髓移入受試者的能力。在一些實施方案中 ，該造血能力包括在受試者中提供骨髓長期移入的能力。在一些實施方案中，足以誘導造血能力的時間包括共培養至少5天。在一些實施方案中，當前公開的方法進一步包括從人臍帶血分離⑶133+/GlyA_/⑶45_干細胞。[0014]當前公開的主題還提供了包含⑶133+/GlyA_/⑶45_干細胞的細胞培養系統。在一些實施方案中，該細胞培養系統還包含0P9細胞飼養層。在一些實施方案中，⑶133+/GlyA_/CD45-干細胞是人臍帶血CD133+/GlyA7CD45-干細胞、人骨髓CD133+/GlyA7CD45-干細胞或其組合。在一些實施方案中，CD133+/GlyA7CD45-干細胞是CD133+/GlyA7CD457ALDH*干細胞。
[0015]因此，當前公開的主題的一個目的是提供用于分離臍帶血細胞⑶1337⑶457GlyA^亞群的方法。
[0016]上文已指出了當前公開的主題的一個目標，并且其全部或部分由當前公開的主題實現，當聯系作為后文中最佳描述的附圖時，其他目標也會隨著描述的進行而變得明顯。
[0017]附圖簡述
圖1A和IB是分別是通過應用磁性細胞分選(MACS)以及隨后的熒光激活細胞分選(FACS)分離的聯合策略分離ALDHffi和ALDHsCB_VSEL的示意方法，以及基于ALDH活性的FACS分離CB-VSEL亞群的代表性選通策略。
[0018]圖2是體外擴增ALDHffi和ALDH*CB_VSEL亞群的技術的示意圖。將新鮮分離的細胞亞群培養在甲基纖維素克隆形成測試中(頂圖)，或在0P9細胞飼養層上擴增5天(底圖)并隨后在甲基纖維素克隆測試中測試克隆形成祖細胞的數量。丨
[0019]圖3是柱狀圖，其顯示了在來自CB-VSEL的ALDHffi和ALDHs亞群的克隆形成培養物中獲得的造血集落(CFU)總數。計算每一群的每I X IO3個分選細胞的集落數量。展示的值是平均值土 SEM; *: /7〈 0.05 ；N = 5。
[0020]圖4 是由與 0P9 細胞共培養的 CD133+/GlyA7CD45- CB-VSEI^AALDHffi 和 ALDH高亞群形成的“鵝卵石”區域的兩張顯微照片的組。兩張顯微照片都是亮視野圖。每一顯微照片左下角的線條表示10 Um0顯示了紡錘樣形狀的0P9細胞在培養板中形成飼養層。
[0021]圖5是來自在0P9飼養細胞上擴增的CD133+/GlyA7CD45- CB-VSEL的ALDH低和ALDHs亞群的克隆形成甲基纖維素測試中獲得的集落的兩張顯微照片的組。兩張照片均展示亮視野圖。每一顯微照片左下角的線條表示10 μπι。
[0022]圖6Α和6Β分別是柱狀圖和顯微照片，其顯示了從由ALDHffi和ALDH*CB_VSEL開始的克隆形成培養物獲得的細胞的CD45表達。
[0023]圖6A顯示了通過流式細胞術分析的從由ALDH低和ALDH*CB_VSEL開始的克隆形成培養物獲得的細胞的CD45抗原表達。圖6B顯示了下述細胞的代表性圖片:所述細胞從克隆形成培養物中的ALDHffi CB-VSEL獲得，并隨后再鋪板至單細胞培養物，針對CD45染色(TRITC)，并通過表面熒光顯微鏡術分析。左圖和右圖的比較顯示了左圖中由黑色箭頭指示的CD45_細胞，以及在右圖中由白色箭頭指示的幾個CD45+細胞。左圖中顯示的比例線條表示10 μ m,并且該比例尺對兩個圖是相同的。
[0024]圖7是針對血型糖蛋白A(上圖)或⑶45 (下圖)染色的衍生自⑶133+/GlyA_/CD457ALDH%P CD133+/GlyA7CD457ALDH* CB-VSEL的集落的一系列代表性表面熒光圖片。以相同的放大倍數顯示所有圖片，以及比例線條表示10 μπι。 ^
[0025]圖8Α和8Β是柱狀圖，其顯示了 CB-VSEL的ALDHffi和ALDH*級份中與多能性狀態和造血定型相關的基因的表達。
[0026]圖8Α顯示了緊接著分離后CB-VSEL的ALDHffi和ALDHs級份中與多能性狀態和造血定型相關的基因的表達L以及圖8B顯示了與0P9細胞共培養及隨后的克隆形成培養后CB-VSEL的ALDHffi和ALDHs級份中與多能性狀態和造血定型相關的基因的表達。Y軸上的倍差數表示平均值(平均值土 SEM)。與總具核細胞(TNC)相比/7 < 0.05。
[0027]圖9A是柱狀圖，其顯示了可從TNC (裂解RBC后分離)和單核細胞(MNC ;Ficoll-Paque分離后)級份中分離的CB-VSEL和HSC的絕對數量。以每I ml經處理的CB表達數據。
[0028]圖9B是柱狀圖，其顯示了與HSC相比的CB-VSEL的大小和細胞核比細胞質之比(N/C 比)。數值表示平均值土 SEM.*: /7〈 0.05 ;N = 5。
[0029]圖1OA和 IOB 是柱狀圖，其顯示了 CB 衍生的 CD457CD133+/ALDH高和 CD457CD133+/ALDH? VSEL在移植至經致死放射的N0D/SCID小鼠后體內測試的造血潛能，在移植4_6周后測試。
[0030]圖1OA 是柱狀圖，其顯示了 CB 衍生的 CD457CD133+/ALDH高和 CD457CD133+/ALDH低VSEL對移植小鼠的周圍血(PB)、脾(SP)和骨髓(BM)中的造血細胞的貢獻。從鼠PB、BM和SP中CB衍生的VSEL亞群衍生得到的人造血⑶45+水平在兩個移植CB-VSEL級份之間是相當的:7.1 ± 2.9% (PB) ,23.2 ± 0.2% (SP)和 25.2 ± 1.0% (BM)。
[0031]圖1OB是柱狀圖，其顯示了在N0D/SCID小鼠周圍血中造血譜系重建的程度。⑶3是T細胞標記物，⑶19是B細胞標記物(盡管其還在濾泡樹突狀細胞上表達)、⑶66b是粒細胞標記物，以及GlyA是紅細胞譜系標記物。
[0032]圖11是上胚層衍生的胚胎干細胞在成人組織中發育沉積(developmentaldeposition)的可能機制的示意圖。VSEL在胎肝、BM和其他組織中的存在可由CXCR4+上胚層衍生的VSEL隨SDF-1梯度的 發育沉積來解釋。胎肝可作為這些細胞遷移途徑的重要交叉點。
[0033]圖12顯示了 FL中各群體含量的流式細胞分析結果，顯示了分析VSEL含量(50&-1+/1^1170)45_細胞)的選通策略。
[0034]圖13A和13B是柱狀圖，其分別顯示了多能干細胞和組織定型干細胞的標記物表達，以及胎肝細胞在各個發育階段的VSEL含量和VSEL-DS形成能力。SCa-l+LinXD45- FL衍生的細胞表達PSC的幾種標記物，并且在與C2C12肌原細胞共培養時長成球形。數值表示從三個獨立實驗獲得的平均值(平均值土SEM)。在每一實驗中合并了來自15-20個胚胎的胎肝。
[0035]圖13A是柱狀圖，其顯示了與胎肝細胞單核細胞相比較時，分選的Sca-1+/Lin7CD45_ FL衍生的細胞級份中表征多能干細胞(PSC)和組織定型干細胞(TCSC)的幾個基因的mRNA的表達分析。在受精后不同的時間點進行分析。
[0036]圖13B是柱狀圖，其顯示了 SCa-l+/Lin7⑶45_ FL-衍生的細胞百分比含量與從分選的Sca-r/Lin7CD45_體外培養的VSEL衍生的球體(VSEL-DS)絕對數量的關于總FL細胞的關系。
[0037]圖14是FL衍生的VSEL含量和形態的一系列IMAGESTREAM? System (ISS)分析。用Sca-1特異的抗體(與FITC綴合)、Lin標記物特異的抗體(每一個與PE綴合)、以及⑶45特異的抗體(與PE-Cy5)染色FL衍生的細胞，用多聚甲醛溶液(2%)固定，用TRITON X(0.01%)透化，并通過ISS分析。圖14顯示了在15.5 dpc的FL中基于它們的大小和抗原性模式鑒定Sca-r/Lin7⑶45_細胞。左上圖根據它們的形態學參數顯示了所有經分析的對象，所述參數包括在亮視野中的細胞核面積和長寬比。基于亮視野細胞圖，作為細胞短軸(寬)對長軸(高)之比計算長寬比(圓的，非伸長的細胞擁有接近1.0的長寬比，而伸長的細胞或團塊具有更低的長寬比)。使具有DNA內容物的圓的單細胞包括在區Rl中，并進一步分析⑶45表達。對來自區R2的⑶45—細胞分析Lin標記物表達，并將LirT/⑶45—細胞封入區R3中。然后基于Sca-1表達顯現來自這一區域的細胞，并使Sca-r/Lin7⑶45_包括在區R4中。
[0038]圖15是兩張照片，其概述了胎肝中Sca-r/Lin7⑶45_細胞(黑菱形)和Oct-4+/Sca-l+/Lin7CD45- VSEL (灰圓圈；左圖)以及 Sca-l+/Lin7CD45+ HSC (右圖)在 dpc12.5、15.5和17.5天絕對數量的改變。
[0039]發明詳述
當移植至合適的受體時，原始LT-HSC可保持長期的造血作用。盡管已經實驗地證實了這些細胞的存在，但此類細胞的表型以及因此的特定分離仍然是有爭議的。
[0040]越來越多的證據表明BM含有多能(P) SC群，其可產生LT-HSC (Kucia等，(2006)Leukemia 20:857-869)。最近，在分析鼠BM期間，發現了稀有(BM單核細胞(MNC)的-0.01%)且極小(約2-4 ym)的Sca-l7lin7⑶45—細胞同質群，所述細胞表達PSC標記物諸如SSEA-1、0ct_4、Nanog和Rex-Ι,以及高表達Rif-1端粒酶蛋白(Kucia等，(2006)Leukemia 20:857-869)。直接電子顯微鏡分析揭示這些細胞表現出初級上胚層衍生的ESC典型的幾種特征，諸如由一窄環細胞質包圍的大細胞核，以及開放型染色質(常染色質)。在與C2C12鼠肉瘤支持飼養層共培養時，這些細胞長成由具有含常染色質的大細胞核的未成熟CXCR47SSEA-l70ct-4+細 胞組成的球體。當鋪板至促進組織分化的培養物時，這些細胞顯示出多能性并擴增為來自所有三個胚細胞層的細胞。基于這點，將這些細胞稱為極小胚胎樣(VSEL) SC (也參見PCT國際專利申請公開WO 2007/067280和2009/059032號)。
[0041]本文公開的是集中在這些細胞的造血分化上的研究。據信VSEL可能是BM中最原始的PSC群，以及它們能夠沿著造血譜系分化并產生LT-HSC。如本文所提出的那樣，從BM中新鮮分離的VSEL不擁有即刻的造血活性；它們不會長成造血集落，也不能輻射防護經致死輻射的受體。然而，若將⑶45— VSEL鋪在支持0P9細胞系上，它們產生⑶45+/⑶41+/Grl7TerllQ+細胞集落。這些細胞的表型類似于從建立的胚胎細胞系體外衍生的最早造血細胞的那些。VSEL的這一造血分化伴隨著幾種調節造血作用的基因(例如，PU-U c-myb、LM02和Ikaros)mRNA的上調。更重要的是，當移植至野生型(WT)動物時，⑶45+/⑶41_/Gr-r/Terlir細胞擴增自從GFP+小鼠分離的VSEL。這些保護WT免受致死輻射，并在體內分化為所有主要的造血譜系(例如，Gr-1+、B220+和⑶3+細胞)。在移植至第二受體后，這一造血活性得以保持。基于這點，似乎VSEL是能產生LT-HSC的PSC，并且⑶45+細胞可衍生自CD45-群。
[0042]1.定義
盡管相信以下術語對本領域技術人員人員而言能很好的理解，但提出了以下的定義以幫助當前公開的主題的解釋。
[0043]除非下面另外定義，本文所用的所有技術和科學術語，意圖具有與本領域普通技術人員所通常理解的相同的含義。本文所用的技術參考文獻意圖指本領域通常理解的技術，包括對于本領域技術人員顯而易見的那些技術的變體或等效技術的替換。盡管相信以下術語對本領域技術人員人員而言能很好的理解，但提出了以下的定義以幫助當前公開的主題的解釋。[0044]根據長期存在的專利法慣例，術語“一”、“一個”及“該(這)”用在這個申請(包括權利要求書)中時是指“一個或更多個”。例如，短語“一個細胞”指的是一個或更多個細胞，包括但不限于多個相同的細胞類型或多個不同的細胞類型。類似地，當在本文中用于指示實體時，短語“至少一個”例如是指 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100或更多個該實體，包括但不限于I至100以及超過100的整數值。
[0045]除非以其他方式指出，在說明書和權利要求中使用的表達組分量、反應條件等的所有數值均理解為在所有情況下均由術語“約”修飾。當提及可測量值諸如質量、重量、時間、體積、濃度或百分比的量時，本文使用的術語“約”意味著包括在某些實施方案中從該特定量±20%、在某些實施方案中±10%、在某些實施方案中±5%、在某些實施方案中±1%、在某些實施方案中±0.5%以及在某些實施方案中±0.1%的變化量，因為此類變化量適于實現本發明的方法。因此，除非相反的指出，否則在這一說明書和所附權利要求中提出的數值參數是可根據尋求由當前公開的主題獲得的期望性質而不同的近似值。
[0046]當在一列實體的上下文中使用時，本文所使用的術語“和/或”是指單個或組合存在的實體。因此，例如，短語“A、B、C和/或D”包括單個的A、B、C和D，但還包括A、B、C和D的任意和所有組合。
[0047]術語“包括”與“包含”、“含有”、“其特征在于”同義，為包括在內的或開放式的，并且不排除其他的、未列出的元件和/或方法步驟。“包括”是領域術語，其意味著存在所列舉的元件和/或步驟，但可添加其他元件和/或步驟，并且仍然落入相關主題的范圍之內。
[0048]本文所使用的短語“由……組成”排除沒有具體列出的任何元件、步驟或組分。例如，當在權利要求文本中的分句中出現，而非緊接前序部分時，短語“由……組成”僅限于該分句中闡述的元件；其他元件不從作為一個整體的該權利要求中排除。
[0049]本文所使用的短語“基本上由……組成”將相關公開內容或權利要求的范圍限制在具體指定的材料和/或步驟，加上不會實質上地影響該公開的和/或要求保護的主題基礎和新穎特征的那些。例如，藥物組合物“可基本上由”藥物活性劑或多個藥物活性劑“組成”，其意味著所列出的藥物活性劑是在該藥物組合物中存在的唯一的藥物活性劑。然而，應當注意，載體、賦形劑和其他非活性劑可以并很可能存在于該藥物組合物中。
[0050]就術語“包含”、“基本上由……組成”和“由……組成”而言，當在本文中使用這三個術語之一時，當前公開的和要求保護的主題可包括使用其他兩個術語的任一個。例如，當前公開主題在一些實施方案中涉及包含⑶133+/GlyA_/⑶45_細胞的組合物。應當理解，當前公開的主題因此還包括在一些實施方案方案中基本上由⑶133+/GlyA_/⑶45_細胞組成的組合物，以及在一些實施方案中由⑶133+/GlyA_/⑶45_細胞組成的組合物。類似地，也應當理解，在一些實施方案中，當前公開的主題的方法包括本文公開的和/或權利要求中敘述的步驟，在一些實施方案中，當前公開的主題的方法基本上由本文公開的和/或權利要求中敘述的步驟組成，以及在一些實施方案中，當前公開的主題的方法由本文公開的和/或權利要求中敘述的步驟組成。
[0051]當在骨髓移植的上下文中使用時，本文所使用的短語“長期”是指一段時間，在這段時間中供體細胞或從其中衍生的后代細胞保持在供體中的活力和功能。當衍生自供體細胞的造血細胞施與后在一些實施方案中在受體中存在至少3個月、在一些實施方案中6個月、在一些實施方案中9個月、在一些實施方案中12個月以及在一些實施方案中超過12個月時，認為骨髓移植產生了長期的移植。
[0052]I1.分離臍帶血細胞亞群的方法
在一些實施方案中，當前公開的主題提供了用于分離臍帶血(CB)細胞的CD133+/⑶45_/GlyA_亞群的方法。在一些實施方案中，該方法包括(a)提供初始臍帶血細胞群；(b)使所述初始細胞群與對CD133特異的第一配體(例如抗體)、對CD45特異的第二配體(例如抗體)以及對血型糖蛋白A(GlyA)特異的第三配體(例如抗體)在足以允許每個抗體與其在初始細胞群的每個細胞上的靶標(如果存在)結合的條件下接觸；(c)選擇CD133+、CD45-且GlyA-的細胞。
[0053]因此，在一些實施方案中，當前公開的主題提供了從CB細胞群分離⑶45_干細胞亞群的方法。在一些實施方式中，該方法包括(a)提供懷疑包含0045_干細胞的CB細胞群；(b)將所述CB細胞群與對CD45特異的第一抗體，對CD133特異的第二抗體接觸，接觸條件足以允許每個抗體與其在細胞群的每個細胞上的靶標(如果存在)結合；(c)選擇為⑶133+、并且⑶45_的CB細胞的第一亞群；(d)將所述CB細胞的第一亞群與對于一個或更多個細胞表面標記物特異的一個或更多個抗體在足以允許每個抗體與其在CB細胞群的每個細胞上的靶標(如果存在)結合的條件下接觸，所述標記物選自包括而不限于CD45R/B220、Gr-UTCRaP ,TCRy δ、CDlIb及Ter-119的組；(e)從所述CB細胞的第一亞群去除結合到步驟(d)的抗體的至少一個的那些細胞；以及(f)收集為⑶133+/⑶45_/GlyA_的CB細胞的第二亞群，由此分離⑶45_干細胞的亞群。
[0054]本文所使用的術語“CD45”是指酪氨酸磷酸酶，也稱為白細胞共同抗原(LCA)，并具有基因記號PTPRC。這一基因相應于GENBANK?登記號NP_002829 (人類)、NP_035340 (小鼠)、NP_612516 (大鼠)、XP_002829 (狗)、XP_599431 (牛)及 AAR16420 (豬)。另外的 CD45同源物的氨基酸序列也存在于GENBANK?數據庫中，包括那些來自幾種魚類和幾種非人類靈長類的那些。
[0055]本文所使用的術語“⑶34”指的是存在于一些造血和非造血干細胞上的細胞表面標記物，并具有基因記號⑶34。GENBANK?數據庫披露了來自人類(例如，AAB25223)、小鼠(NP_598415)、大鼠(XP_223083)、貓(ΝΡ_001009318)、豬(MP_999251)、牛(NP_776434)及其它的CD34的氨基酸和核酸序列。
[0056]在小鼠中，一些干細胞還表達干細胞抗原Sca-1 (GENBANK?登記號NP_034868)，也稱為淋巴細胞抗原Ly-6A.2。
[0057]本文所使用的術語“⑶133”是指存在于一些造血干細胞、內皮祖細胞、成膠質細胞瘤、神經元和神經膠質干細胞以及一些其他細胞類型上的細胞表面標記物。其還稱為Prominin I (PROMl)。GENBANK? 數據庫披露了來自人類(例如，NM_006017 和 NP_006008)、小鼠(NM_008935 和 NP_032961)、大鼠(NM_021751 和 NP_068519)和其他的 CD133 核酸及
氨基酸序列。
[0058]本文所使用的術語“GlyA”是指血型糖蛋白A，其為存在于紅細胞上的細胞表面分子。GENBANK?數據庫披露了來自人類(例如，NM_002099和NP_002090)、小鼠(NM_010369和NP_034499)和其他的GlyA核酸和氨基酸序列。
[0059]因此，⑶45_干細胞的亞群表示存在于分離步驟前的細胞群中的⑶45_細胞的亞群。在一些實施方式中，⑶45_干細胞的亞群來自人類，并且是⑶34+/lin_/⑶45_。在一些實施方式中，⑶45_干細胞的亞群來自小鼠，并且是Sca-l7lin7⑶45_。
[0060]所公開的亞群的分離可以利用可以基于CD45、CD133、GlyA、CXCR4、CD34、AC133、Sca-1、CD45R/B220、Gr-l、TCRaP ,TCRy δ、CDllb 及 Ter-119 標記物的一種或多種的表達或表達缺乏來分離細胞的任何方法進行，包括但不限于突光活化的細胞分選(FACS)。
[0061]本文所使用的lin_指的是不表達下列標記物的任何一種的細胞:⑶45R/B220、Gr-U TCRaP , TCRy δ、CDllb及Ter-119。這些標記物存在于下述細胞上:從早期Pro-B到成熟B細胞的B細胞譜系的細胞(CD45R/B220);骨髓譜系的細胞，諸如在骨髓發育期間的單核細胞、骨髓粒細胞及外周中性白細胞(Gr-1);胸腺細胞、外周T細胞及腸上皮內皮淋巴細胞(TCRaP和TCR Y δ);骨髓細胞、NK細胞、一些活化的淋巴細胞、巨噬細胞、粒細胞、BI細胞及樹突細胞的亞類(⑶Ilb);以及成熟的紅細胞和紅細胞系前體細胞(Ter-119)。
[0062]所述分離步驟可以作為一系列步驟以逐步方式或同時進行。例如，每個標記物的存在或缺乏可以單獨地評估，在每個步驟基于是否存在單獨的標記物產生兩個亞群。此后，感興趣的亞群可以被選擇并基于下一標記物的存在或缺乏而被進一步分開。
[0063]可選地，所述亞群可以通過僅分離出具有特定標記物模式的那些細胞而產生，其中短語“標記物模式(marker profile) ”指的是兩種或更多種標記物的存在或缺乏的總結。例如，混合的細胞群可以含有⑶133+和⑶34 _細胞。類似地，相同的混合細胞群可以含有⑶45+和⑶45—細胞。因此，這些細胞中的一些將是⑶133+/⑶45+，另一些將是⑶133+/⑶45、另一些將是⑶1337⑶45+，其 它將是⑶1337⑶45_。這些標記物的單獨的組合的每種代表不同的標記物模式。隨著另外的標記物被加入，所述模式可以變得更復雜，并且對應最初的混合細胞群中越來越小的百分比。在一些實施方式中，當前公開的主題的細胞具有CD133+/CD457GlyA_的標記物模式。
[0064]在當前公開的主題的一些實施方案中，對由感興趣的細胞類型表達的標記物(諸如，在⑶133+/⑶45_/GlyA_細胞的表面上表達的多肽)特異的抗體用于分離和/或純化具有感興趣的標記物模式的BM細胞的亞群。應當理解基于感興趣的標記物模式，所述抗體可以用于陽性或陰性地選擇群體的級份，其在一些實施方式中隨后被進一步分級分離。
[0065]在一些實施方式中，采用具有不同特異性的多個抗體、抗體衍生物、和/或抗體片段。在一些實施方式中，每個抗體、或其片段或衍生物，對選自包括而不限于⑶133、⑶45、GlyA、Ly-6A/E (Sca-1)、CD34、CXCR4、AC133、CD45、CD45R、B220、Gr-1、TCR α β、TCR Y δ、0)1 lb、Ter-119、c_met、LIF-R、SSEA-U Oct-4> Rev-1 和 Nanog 的組的標記物是特異性的。在一些實施方式中，分離和/或純化表達一個或更多個選自包括但不限于SSEA-1、Oct-4、Rev-1及Nanog的組的基因的細胞。
[0066]當前公開的主題涉及細胞群，其在一些實施方式中表達下述抗原:CXCR4、AC133、CD34、SSEA-1 (小鼠)或SSEA-4 (人類)、胎兒堿性磷酸酶(AP)、c-met及LIF-受體(LIF-R)。在一些實施方式中，當前公開的主題的細胞不表達下述抗原:CD45、譜系標記物(即，細胞為lirT)、GlyA、HLA-DR、I類MHC、⑶90、⑶29及⑶105。因此，在一些實施方式中，當前公開的主題的細胞可以被表征如下:CXCR47CD133+/CD347SSEA-r (小鼠)或SSEA-4+(人類)/AP+/c-met7LIF-R7CD457lin7HLA-DR7 I 類 MHC 7 GlyA_/CD90_/CD29_/CD105_。
[0067]應當理解，為了分離具有期望標記物模式(例如，⑶133+/⑶45_/GlyA_)的細胞亞群，可以任何方便的組合，同時或反復地使用基于相關標記物的表達來用于分離細胞的配體(例如，抗體)。例如，可同時、以任意組合、或以任何順序單獨地使用與⑶133、⑶45和GlyA結合的抗體，以便于分離期望的亞群。
[0068]在一些實施方式中，每個抗體、其片段或衍生物包括可檢測的標簽。結合于不同標記物的不同的抗體、或其片段或衍生物可以包括不同的可檢測標簽或可以采用相同的可檢測標簽。
[0069]各種可檢測標簽對于本領域技術人員是公知的，用于將可檢測標簽結合到生物分子諸如抗體和其片段和/或衍生物的方法也是公知的。本文所使用的短語“可檢測標簽”指的是可以加入到抗體、或其片段或衍生物的任何部分，其允許抗體的檢測。代表性的可檢測部分包括但不限于:共價附著的生色團、熒光部分、酶、抗原、具有特異反應性的基團、化學發光部分及電化學可檢測的部分等。在一些實施方案中，抗體被生物素化。在一些實施方式中，利用第二抗體檢測生物素化的抗體，所述第二抗體包括親和素或鏈霉親和素基團并且還綴合于包括但不限于Cy3、Cy5及Cy7的熒光標簽。在一些實施方式中，抗體、其片段或衍生物用熒光標簽諸如Cy3、Cy5、或Cy7直接標記。在一些實施方式中，所述抗體包括生物素-綴合的大鼠抗-小鼠Ly-6A/E(Sca-l ;克隆E13-161.7)、鏈霉親和素_PE_Cy5綴合物、抗-CD45-APCCy7 (克隆 30-F11)、抗-CD45R/B220-PE (克隆 RA3-6B2)、抗-Gr-1-PE (克隆RB6-8C5)、抗-TCRa β PE (克隆 Η57-597)、抗-TCR Y δ PE (克隆 GL3)、抗-CDllb PE (克隆Μ1/70)及抗-Ter-119 PE (克隆TER-119)。在一些實施方式中，所述抗體、片段、或其衍生物用熒光標簽直接標記，并且通過熒光激活細胞分選術分離結合于抗體的細胞。另外的檢測策略對于本領域技術人員是公知的。
[0070]雖然FACS掃描是用于純化細胞亞群的便利方法，但是應當理解也可以采用其它方法。可以采用的示例性方法是采用特異性結合于CD45、CXCR4、CD34、AC133、Sca-l、CD45R/B220、Gr-U TCRaP , TCRy δ、CDllb和Ter-119的一種或多種的抗體，所述抗體包含這樣的部分(例如生物素)，對于所述部分高親和力結合試劑是可獲得的(例如親和素或鏈霉親和素)。例如，生物素部分可以附著于對于每種標記物的抗體，對于所述標記物，在細胞表面上的存在是所期望的(例如，CD34、Sca-1、CXCR4)，并且具有結合的抗體的細胞群可以與包含親和素或鏈霉親和素部分的親和試劑接觸(例如，包含親和素或鏈霉親和素的柱)。回收結合于柱的那些細胞，并按預期的進一步分級分離。可選地，結合于所述群中要去除的那些細胞上存在的標記物(如，CD45R/B22O、Gr-l、TCRa0、TCRy δ、CDllb 及 Ter-119)的抗體可以用生物素標記，可回收不與親和試劑結合的細胞，并進一步純化。
[0071]還應理解可在純化過程的一個或更多個步驟中一起采用不同的分離技術(諸如親和純化和FACS)。
[0072]在一些實施方式中，VSEL干細胞或其衍生物還表達選自包括但不限于c-met、c-kit、LIF-R及其組合的組的標記物。在一些實施方式中，所公開的分離方法進一步包括分離為c-met+、c-kit+、和/或LIF-R+的那些細胞。
[0073]在一些實施方案中，VSEL干細胞或其衍生物還表達SSEA-1、Oct-4、Rev-1及Nanog，并且在一些實施方案中，所公開的分離方法進一步包括分離表達這些基因的那些細胞。
[0074]在一些實施方案中，基于醛脫氫酶(ALDH)的表達對當前公開的主題的⑶133+/GlyA7CD45_細胞群進一步進行分離。例如，可應用配體ALDEFLUOR? (STEMCELLTechnologies, Vancouver, British Columbia, Canada)基于 ALDH 染色來分離 CDl33+/GlyA_/⑶45_細胞。如此，當前公開的方法在一些實施方案中還可包括從⑶133+/GlyA_/⑶45_細胞中分離ALDH*細胞，從⑶133+/GlyA7⑶45_細胞中分離ALDHffi細胞，或分別從CD133+/GlyA7CD45—細胞中分離ALDHs細胞和ALDHffi細胞。
[0075]當前公開的主題還提供了分離的干細胞群，其中所述分離的干細胞群包含基本上純化的分離自臍帶血(CB)的⑶133+/GlyA_/⑶45_細胞。該分離的干細胞群可包含⑶133+/Gl yA7CD457ALDH 細胞、CD 133+/G1 yA7CD457ALDH 細胞或其組合。
[0076]含有當前公開的主題的⑶133+/⑶457617八_細胞的細胞群可以從任何受試者或從含有它們的受試者內的任何來源分離。在一些實施方式中，所述細胞群包括骨髓樣品、臍帶血樣品、外周血樣品、或胎肝樣品。在一些實施方案中，在用足以將0045_干細胞從骨髓遷移到受試者的外周血的量的遷移劑處理受試者后，從受試者的骨髓分離所述細胞群。本文所使用的短語“遷移劑”指的是這樣的化合物(例如，肽、多肽、小分子、或其它試劑)，其在給予受試者時導致VSEL干細胞或其衍生物從受試者的骨髓遷移到外周血。換句話說，將遷移劑給予受試者導致受試者外周血中存在比在即將給予遷移劑之前存在于其中的數量增加的VSEL干細胞和/或VSEL干細胞衍生物。然而，應當理解遷移劑的效果不需要是即時的，通常包括延遲時間，在此期間遷移劑作用于受試者中的組織或細胞類型以便產生其效果。在一些實施方案中，所述遷移劑包括粒細胞-集落刺激因子(G-CSF)和CXCR4拮抗劑(例如，T140 妝；Tamamura 等(1998)253 Biochem BiophysRes Comm 877-882)的至少一種。
[0077]當前公開的主題還 提供了通過當前公開的方法分離的⑶45_干細胞群。
[0078]II1.用于施與受試者的方法和組合物 II1.A.方法
當前公開的主題還提供了用于在受試者中種群恢復細胞類型的方法。在一些實施方案中，該方法包括以一定的量和通過一定的途徑給受試者施與在可藥用載體中包含多個分離的CD1337GlyA7CD45_干細胞的組合物，所述量和途徑足以允許CD1337GlyA7CD45_干細胞的至少一部分移入靶部位并在其中分化，由此在受試者中種群恢復細胞類型。在一些實施方案中，該細胞類型是造血細胞。在當前公開的方法的一些實施方案中，該多個分離的⑶133+/GlyA7⑶45-干細胞包含分離自臍帶血的⑶133+/GlyA7⑶45—干細胞。在一些實施方案中，該靶部位包括受試者的骨髓。
[0079]因此，在一些實施方案中，當前公開的主題還提供了用于骨髓移植的方法。在一些實施方案中，該方法包括給至少部分地缺乏骨髓的受試者施與包含有效量的分離自所述細胞來源(例如，臍帶血、骨髓、外周血和/或胎肝)的CD133+/GlyA_/CD45_干細胞的藥物制備物，其中該有效量包含分離的⑶133+/GlyA_/⑶45_干細胞足以移入受試者骨髓的量。
[0080]在閱讀了當前公開內容后，骨髓移植將是本領域普通技術人員一般公知的技術。幾個已經公開美國和其他專利及專利申請描述了標準技術的變化。簡而言之，將接受骨髓移植(BMT)的受試者一般進行一系列的預治療，所述預治療經設計以準備接受所施與的細胞的骨髓空間。這些預治療可包括但不限于，經設計以抑制受試者免疫系統從而使得供體和受體不是組織可相容時移植物不會受到排斥，以及在骨髓中產生空間以允許施與的細胞移入的治療。示例性的產生空間的預治療包括暴露于破壞所有或部分骨髓的化療，以及全身放射(TBI)。
[0081]如此，在一些實施方案中，當前公開的主題提供了這樣的方法，其中至少部分地缺乏骨髓的受試者經歷了至少部分地減少該受試者骨髓的預治療。本文所使用的短語“至少部分地缺乏骨髓的受試者”是指接受了脊髓抑制治療或脊髓減少治療的受試者，其每一個均消除受試者中至少部分骨髓。脊髓抑制和脊髓減少治療是本領域普通技術人員公知的，并且可包括免疫治療、化療、放療或其組合 。
[0082]II1.B.鉬合物
一旦受試者經歷了合適的預治療(若需要的話)，則施與包含當前公開的主題的⑶133+/GlyA_/⑶45_干細胞分離群的組合物。在一些實施方案中，該組合物在可藥用載體(任選地，對人使用而言是可藥用的載體)中包含⑶133+/GlyA_/⑶45_干細胞。
[0083]在一些實施方案中，施與新鮮分離的當前公開主題的⑶133+/GlyA7⑶45—干細胞，盡管也可使用冷凍細胞。用于冷凍保存用于施與受試者的干細胞的方法是本領域普通技術人員公知的。
[0084]在一些實施方案中，在飼養細胞層的存在下共培養當前公開主題的⑶133+/GlyA_/CD45_干細胞，以提高該細胞移入受試者和/或在受試者中產生血細胞的效率。在一些實施方案中，飼養細胞層包含0P9細胞。
[0085]II1.B.1.制劑
當前公開的主題的組合物在一些實施方案中包括包含載體的組合物，尤其是可藥用載體，諸如但不限于人類中可藥用的載體。任何合適的藥物制劑可以用于制備用于施與受試者的組合物。
[0086]例如，合適的制劑可以包括含水和無水無菌注射溶液，其可以含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑、殺菌抗生素、以及使該制劑與預定的受者的體液等滲的溶質。
[0087]應當理解，除了上面特別提及的成分，當前公開的主題的制劑還可包含本領域中關于討論的制劑類型的常見的其它試劑。例如，可以使用無菌不含致熱原的含水和無水溶液。
[0088]當前公開的主題的治療方法和組合物可以與其他的佐劑或生物反應修飾劑一起使用，所述修飾劑包括但不限于細胞因子和其它免疫調節化合物。
[0089]II1.B.2.施與
用于施與當前公開的主題的組合物的合適的方法包括但不限于靜脈內施與和直接遞送到靶組織或器官。在一些實施方案中，施與方法包括用于細胞在靶部位(例如，骨髓)區域化遞送或聚集的特征。在一些實施方案中，所述細胞被直接遞送入靶部位。在一些實施方案中，通過細胞的靜脈內注射完成當前公開主題的細胞的選擇性遞送，其中它們靶向(hometo)靶部位并移入其中。
[0090]II1.B.3.劑量
有效劑量的當前公開主題的組合物被施與有需要的受試者。“治療有效量”或“治療量”是足以產生可測量的反應(例如，被治療的受試者中的生物或臨床相關反應)的治療組合物的量。可以改變當前公開主題的組合物中的活性成分的實際劑量水平以便施與可以有效實現對于特定受試者的期望治療反應的活性化合物的量。所選的劑量水平將依賴于治療組合物的活性、施與途徑、與其他藥物或治療的組合、要治療的狀況的嚴重性、以及要治療的受試者的狀況和先前醫療史。然而，化合物的開始劑量在低于實現期望的治療效果所需的水平，并逐漸提高劑量直到實現期望的效果，這在本領域的技術范圍內。組合物的效能可以變化，因此“治療有效量”可以變化。然而，利用本文所述的實驗方法，本領域技術人員可以容易地評估當前公開主題的候選化合物的效能和功效并因而調整治療方案。
[0091]在閱覽本文呈現的當前公開主題的公開內容后，考慮特定劑型、所述組合物所用的施與方法及要治療的特定疾病，本領域的普通技術人員可以調整給予個體受試者的劑量。劑量的進一步計算可以考慮受試者的身高和體重、癥狀的嚴重性和階段及另外的有害身體狀況的存在。這樣的調整或改變，以及何時和怎樣進行這樣的調整或改變的評估對于醫藥領域中的普通技術人員是熟知的。
[0092] IV.其他應用
當前公開的主題還提供了用于誘導⑶133+/GlyA_/⑶45_干細胞的造血能力的方法。本文所使用的短語“造血能力”是指⑶133+/GlyA_/⑶45_干細胞(或其后代細胞)分化為造血細胞(例如，終端分化造血細胞)的能力。該短語因此包括單個細胞能夠種群恢復受試者的效率(例如，如由施與受試者以便使該受試者獲得臨床相關益處所需的最小細胞數測得)，以及該細胞在受試者中產生臨床相關益處所需的時間。在一些實施方案中，當前公開主題的細胞的造血能力包括在受試者中提供骨髓長期移入的能力。
[0093]如本文所公開，⑶133+/GlyA_/⑶45_干細胞可顯示出不同的造血能力，在一些實施方案中，其基于分離該CD133+/GlyA7CD45_干細胞的來源，以及該細胞可能接受的任何預處理(例如，與0P9細胞共培養)。因此，在一些實施方案中，當前公開的主題的方法包括(a)提供⑶133+/GlyA_/⑶45_干細胞；以及(b)在飼養層(例如，0P9飼養層)的存在下共培養CD133+/GlyA7CD45-干細胞足以誘導該CD133+/GlyA7CD45-干細胞的造血能力的時間。
[0094]此外，當前公開的方法可采用的⑶133+/GlyA_/⑶45_干細胞是骨髓衍生的⑶133+/GlyA7CD45_干細胞、臍帶血衍生的CD1337GlyA7CD45_干細胞、或其組合。此外，該CD133+/GlyA7CD45-干細胞是 0)1337617470)45740)!^干細胞、CD133+/GlyA7CD457ALDH*干細胞，或其組合。
[0095]V.細胞培養系統
在一些實施方案中，當前公開的主題還提供了包含⑶133+/GlyA_/⑶45_干細胞的細胞培養系統。在一些實施方案中，該細胞培養系統還包含飼養細胞層，任選0P9細胞飼養層。
實施例
[0096]下面的實施例提供了示意性的實施方案。根據本發明披露的內容和本領域的一般技術水平，本領域的技術人員將認識到下面的實施例僅是示例性的并且可以采用各種變化、修改及改變而不偏離當前披露的主題的范圍。
[0097]實施例1-4中使用的材料和方法
最近，在臍帶血(CB)中鑒定了原始的極小胚胎樣干細胞(VSEL)群。這些CB-VSEL干細胞(i)尺寸極小 ? 6 Mm;通常為 2-4 μ m) ；(ii)是 SSEA-4+/0ct-47CD1337CXCR4+/Lin7CD45_的；(iii)對基質衍生的因子l(SDF-l)梯度強烈的反應;以及(iv)擁有相對大的含有原始常染色質的細胞核(Kucia等，(2007) Leukemia 21:297-303; PCT國際專利申請
【發明者】J.拉塔查克, E.K.祖巴-敘爾馬, M.拉塔查克 申請人:路易斯維爾大學研究基金會有限公司