利用MicroRNA156及其靶基因調控植物揮發油含量的方法

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利用MicroRNA156及其靶基因調控植物揮發油含量的方法
【專利摘要】本發明涉及利用MicroRNA156及其靶基因調控植物揮發油或其中倍半萜含量的方法。首次揭示一種調控植物揮發油或其中倍半萜類物質合成的關鍵基因——Squamosa啟動子結合蛋白基因(SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE genes，SPLs)，該基因是miR156的靶基因。SPLs通過直接與倍半萜合酶啟動子結合激活其轉錄；并通過轉基因技術，證實該機制在多種植物中發揮作用，可基于此獲得高產植物揮發油的植物。
【專利說明】利用Micr〇RNA156及其靶基因調控植物揮發油含量的方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術和植物學領域；更具體地，本發明涉及利用MicroRNA156及其靶基因調控植物揮發油或其中倍半萜含量的方法。

【背景技術】
[0002] 植物揮發油（精油）是具有一定揮發性的油狀液體的統稱，是植物芳香物質的提取物。含揮發油的中草藥非常多，亦多具芳香氣味，尤以唇形科（薄荷、紫蘇、藿香等）、傘形科（茴香、當歸、芫荽、白芷、川芎等）、菊科（艾葉、茵陳篙、蒼術、白術、木香等）、蕓香科 (橙、桔、花椒等）、樟科（樟、肉桂等）、姜科（生姜、姜黃、郁金等）等科更為豐富。植物揮發油成分復雜，主要由萜類化合物構成，芳香族化合物次之，還包含少量的脂肪酸衍生物。其中萜類化合物又分為單萜、倍半萜以及少量的二萜，常見的如薄荷中的薄荷酮、廣藿香中的廣藿香醇等。揮發油大多具有抑菌殺毒、凝神靜氣、解熱鎮痛、矯味定香等作用，在醫藥、食品、日化用品等方面應用廣泛。目前植物揮發油的研究主要集中在提取工藝優化、化學成分分析以及精油成分的生物活性研究等方面，揮發油合成途徑的轉錄調控研究很少。
[0003] 模式植物擬南芥開花后，花序會釋放以單萜和倍半萜為主的揮發性成分，其中大部分倍半萜由TPS21和TPS11兩個倍半萜合酶催化合成，其中TPS21主要催化法尼基焦磷酸合成石竹烯，它們在擬南芥花器官特異表達，而在葉片中幾乎不表達（Chen，F.等 (2003).The Plant celll5,481-494 ;Tholl,D.等（2005).The Plant journal:for cell and molecular biology42, 757-771)。推測植物發育因子在調控植物廠類合成的時空特異性方面發揮重要作用。擬南芥中最近的研究表明SPL9通過破壞花青素合成的轉錄激活復合體MYB-bHLH-WD40抑制了擬南芥中花青素的積累。
[0004] 廣藿香（Pogostemon cablin)是唇形科多年生草本植物，所產生的廣藿香精油被廣泛應用于香料及醫療行業。與其它唇形科植物產生的混合型精油不同，廣藿香精油主要是由倍半廠構成（Deguerry，F.等（2006) .Archives of biochemistry and biophysics454,123-136)。廣藿香精油包含約 24 種倍半廠（Bur6，C.M.等（2004). Journal of Essential Oil Researchl6，17_19)，其中廣藿香醇（(-)-patchoulol)約占 35%，是其重要組分。廣藿香醇香味持久、獨特宜人是良好的定香劑，目前作為天然香料被廣泛用于日化產品中。此外，廣藿香醇還具有抑制真菌繁殖，驅除和毒殺白蟻的作用。廣藿香醇合酶 (patchoulol synthase，PTS)是一個多功能酶，負責合成廣藿香葉片提取物中廣藿香醇以及其它13種倍半廠產物（Deguerry et al. ,2006)。
[0005] 本領域有必要對植物揮發油在植物中等產生機制進行有效研究，并基于此改進植物中植物揮發油有效成分的含量。

【發明內容】

[0006] 本發明的目的在于提供利用Micr〇RNA156及其靶基因調控植物揮發油或其中倍半萜含量的方法。
[0007] 在本發明的第一方面，提供一種調節植物（如芳香植物）揮發油或其中的倍半萜含量的方法，所述方法包括：調節植物中Squamosa啟動子結合蛋白基因的表達。
[0008] 在一個優選例中，所述的調節植物中Squamosa啟動子結合蛋白基因的表達是：上調植物中Squamosa啟動子結合蛋白基因的表達，從而提高植物揮發油或其中的倍半萜含量。
[0009] 在另一優選例中，所述的上調植物中Squamosa啟動子結合蛋白基因的表達包括：將Squamosa啟動子結合蛋白基因轉化植物，獲得過表達Squamosa啟動子結合蛋白基因的轉基因植物，所述的轉基因植物的揮發油或其中倍半萜含量提高。
[0010] 在另一優選例中，所述的將Squamosa啟動子結合蛋白基因轉化植物包括：
[0011] (a)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述表達載體中含有構建物，所述的構建物含有 Squamosa啟動子結合蛋白基因的表達盒；
[0012] (b)將植物細胞、組織或器官與步驟（a)中的農桿菌接觸，從而使所述的構建物轉入植物。
[0013] 在另一優選例中，所述方法還包括：
[0014] (c)選擇出轉入了所述構建物的植物細胞、組織或器官；以及
[0015] (d)將步驟（c)中的植物細胞、組織或器官再生成植物。
[0016] 在另一優選例中，所述的Squamosa啟動子結合蛋白基因（SPL)是miR156祀向的 Squamosa 啟動子結合蛋白基因；更佳地，選自：SPL3，SPL4，SPL5，SPL9，SPL15，SPL2，SPL10， SPL11, SPL6, SPL13A, SPL13B。
[0017] 在另一優選例中，所述的SPL9基因選自：(a)At2g42200所示核苷酸序列的多核苷酸；或（b)核苷酸序列在嚴格條件下能夠與（a)限定的多核苷酸序列雜交且編碼的蛋白具有At2g42200編碼的蛋白同樣功能的多核苷酸；（c)核苷酸序列與（a)限定的多核苷酸序列有70%以上（較佳地80%以上；更佳地90%以上；更佳地95%以上；更佳地99%以上）相同性且編碼的蛋白具有At2g42200編碼的蛋白同樣功能的多核苷酸。
[0018] 在另一優選例中，所述的SPL10基因選自：（a'）ATlG27370所示核苷酸序列的多核苷酸；或（b'）核苷酸序列在嚴格條件下能夠與（a'）限定的多核苷酸序列雜交且編碼的蛋白具有AT1G27370編碼的蛋白同樣功能的多核苷酸；(c'）核苷酸序列與（a'）限定的多核苷酸序列有70%以上（較佳地80%以上；更佳地90%以上；更佳地95%以上；更佳地99%以上）相同性且編碼的蛋白具有AT1G27370編碼的蛋白同樣功能的多核苷酸。
[0019] 在另一優選例中，所述的上調植物中Squamosa啟動子結合蛋白基因的表達包括：將下調miR156表達的抑制分子轉化植物，通過下調miR156來上調Squamosa啟動子結合蛋白基因的表達，獲得的轉基因植物的揮發油或其中倍半萜含量提高。
[0020] 在另一優選例中，所述的下調miR156表達的抑制分子是MM156或其活性片段 (發揮抑制作用的關鍵位點片段）；較佳地，所述的Μ頂156的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示，所述的MM156的活性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2中第237-256位所示。
[0021] 在另一優選例中，所述的調節植物中Squamosa啟動子結合蛋白基因的表達是：下調植物中Squamosa啟動子結合蛋白基因的表達，從而降低植物揮發油或其中倍半萜含量。
[0022] 在另一優選例中，所述的下調植物中Squamosa啟動子結合蛋白基因的表達包括：將Squamosa啟動子結合蛋白基因的表達抑制分子轉化植物，獲得Squamosa啟動子結合蛋白基因表達受抑制的轉基因植物，所述的轉基因植物的揮發油或其中倍半萜含量降低。
[0023] 在另一優選例中，所述的Squamosa啟動子結合蛋白基因的表達抑制分子是 miR156f ;較佳地，所述的miR156f具有SEQ ID NO: 1中第82-101位所示核苷酸序列；所述的miR156f前體具有SEQ ID NO: 1或其中第82-171位所示核苷酸序列。
[0024] 在另一優選例中，所述的植物包括（但不限于）：十字花科植物（如擬南芥），唇形科植物（如廣藿香，薄荷，羅勒），傘形科植物，菊科植物，蕓香科植物，樟科植物，姜科植物，禾本科植物，茄科植物。
[0025] 在另一優選例中，所述的倍半萜包括（但不限于）：石竹烯，廣藿香醇，廣藿香烯，廣藿香烯，α-廣藿香烯，β-欖香烯，α-愈創木烯，4, 11-愈創木二烯，α-布藜烯。
[0026] 在本發明的另一方面，提供Squamosa啟動子結合蛋白的用途，用于提高植物揮發油或其中倍半萜含量。
[0027] 在本發明的另一方面，提供下調miR156表達的抑制分子的用途，用于提高植物揮發油或其中倍半萜含量。
[0028] 在一個優選例中，所述的下調miR156表達的抑制分子是MM156或其活性片段；較佳地，所述的MM156的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示，所述的MM156的活性片段的核苷酸序列如SEQ ID N0: 2中第237-256位所示。
[0029] 在本發明的另一方面，提供Squamosa啟動子結合蛋白基因的表達抑制分子的用途，用于降低植物揮發油或其中倍半萜含量。
[0030] 在一個優選例中，所述的Squamosa啟動子結合蛋白基因的表達抑制分子是 miR156f ;較佳地，所述的miR156f具有SEQ ID NO: 1中第82-101位所示核苷酸序列；所述的miR156f前體具有SEQ ID NO: 1或其中第82-171位所示核苷酸序列。
[0031] 本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0032] 圖l、miR156f、rSPLs (以SPL10為例）的雙元植物表達載體構建示意圖。
[0033] A、截取miR156f基因組中包含前體序列（下劃線標出）共計276bp長的片段構建 Pro35S:MIR156f 雙元載體。
[0034] B、將SPL10基因 cDNA中miR156靶位點的核苷酸序列進行同義突變。單下劃線： SPL10基因中原始miR156靶位點的核苷酸序列；方框：靶位點的核苷酸序列對應的氨基酸序列；黑色：SPL10基因中miR156靶位點突變后的核苷酸序列。
[0035] C、PCR突變SPL10中miR156靶位點的核苷酸序列示意圖。P1(S)和P2(AS)為片段全長序列。P3(AS)為突變位點上游反向引物。P4引物5'端15-20bp與引物P3互補，3' 端20bp左右與突變位點下游序列互補，中部為突變后序列。
[0036] 圖 2、TPS21 受 miR156 調控。其中，thujopsene :羅漢柏烯； trans-β -Caryophyllene (Caryophyllene):石竹烯；n-Nonyl acetate :乙酸壬酉旨。
[0037] A 和 B、GC-MS 檢測 Pro35S:MIR156 和 Pro35S:MIM156 植物花序中倍半萜含量。** 代表P〈0. 01，*代表P〈0. 05,即與野生型擬南芥相比具有顯著差異。
[0038] C、Pro35S:MIR156 和 Pro35S:MIM156 植物花序中 TPS21、TPS11 表達水平 qRT-PCR 檢測。
[0039] 圖3、miR156靶基因 SPLs激活TPS21表達。
[0040] A、qRT-PCR 檢測 TPS21 在 Pro35S:rSPL3、ProSPL9:rSPL9、Pro35S:rSPL10 花序中表達。
[0041] B、qRT-PCR 檢測 TPS21 在誘導體系 ProAlcA:MIR156f 和 ProSPL9:rSPL9-GR 植物中的瞬時表達水平。
[0042] C-E、ProTPS21:⑶S 在野生型（C)、Pro35S:MIR156(D)、Pro35S:MIM156(E)背景下花序的⑶S染色結果。Bar=lcm。
[0043] 圖4、SPL9直接結合TPS21啟動子。
[0044] A、TPS21上游1376bp片段包含SPL蛋白結合位點GTAC(以黑色三角標注）示意圖。 cisl、cis2、cis3代表用于EMSA實驗的3個片段；I、II、III、IV代表ChIP實驗中Real-time 擴增片段位置。
[0045] B、體外EMSA驗證SPL9與TPS21啟動子結合。上行是不同濃度HIS - SPL9融合蛋白（0、30、90ng)分別與Cy5標記的cisl、cis2、cis3以及負對照kasO啟動子片段結合實驗；下行是cisl、cis3分別與各自未標記的冷探針的競爭實驗。
[0046] C、體內ChIP富集實驗證明GFP-rSPL9蛋白結合TPS21啟動子。收集生長4周的 Pr〇SPL9:GFP-rSPL9和野生型對照的花序作為ChIP實驗材料。TPS21啟動子不同區域富集倍數計算：首先以GFP抗體沉淀得到DNA中基因豐度比加 HA抗體沉淀得到DNA中基因豐度，再以ProSPL9: GFP-rSPL9植物中該比值比野生型植物中該比值。
[0047] 圖5、轉基因廣藿香陽性植株篩選。
[0048] A、qRT_PCR檢測SPL10在Pro35S:rSPL10葉片中表達。以空質粒轉基因廣藿香為對照組，以廣藿香Patl8S(EF529587)作為內標基因。"L+數字"表示相應轉基因株系中不同植株編號，后續同。
[0049] B、qRT-PCR檢測Pro35S:MIR156轉基因廣藿香葉片中成熟miR156水平。以空質粒轉基因廣藿香為對照組，以廣藿香Patl8S(EF529587)作為內標基因。
[0050] 圖6、轉基因廣藿香陽性植株中PTS表達水平檢測。
[0051] A、qRT_PCR檢測PTS在Pro35S:rSPL10葉片中表達。以空質粒轉基因廣藿香為對照組，以廣藿香Patl8S(EF529587)作為內標基因。
[0052] B、qRT_PCR檢測Pro35S:MIR156轉基因廣藿香葉片中PTS水平。以空質粒轉基因廣藿香為對照組，以廣藿香Patl8S(EF529587)作為內標基因。
[0053] 圖7A-B、miR156靶向的SPL基因調控廣藿香精油成分的合成。n-Nonyl acetate :乙酸壬酯；β -patchoulene : β -廣藿香烯；β -elemene : β -欖香烯； trans-β -caryophyllene ：石竹烯；a -guaiene : α -愈創木烯；a -patchoulene : α -廣藿香烯；γ -patchoulene : γ -廣藿香烯；guai-4, 11-diene :4, 11-愈創木二烯； a-bulnesene : α -布藜烯；（-)-patchoulol :廣藿香醇；pogostone :廣藿香酮。
[0054] 圖8、一月大T1代轉基因廣藿香葉片中PTS表達水平和廣藿香醇含量檢測。
[0055] A、qRT-PCR 檢測 PTS 在 Pro35S:rSPL10 和 Pro35S:MIR156f 轉基因植物葉片中表達。空質粒轉基因廣藿香為對照組，廣藿香Patl8S(EF529587)作為內標基因。
[0056] B、Pro35S:rSPL10、空質粒、Pro35S:MIR156f葉片中廣藿香醇含量檢測。首先與內標相比，然后除以樣品鮮重，得出百分比。#代表P〈0. 01/代表P〈0. 05,即與空質粒轉基因廣藿香相比具有顯著差異。
[0057] 圖9、掃描電鏡檢測廣藿香葉片表皮毛。
[0058] A、廣藿香葉片三種表皮毛：非腺毛（左）、頭狀腺毛（中）、盾狀腺毛（右）掃描電鏡圖。
[0059] B-C、廣藿香近軸面B和遠軸面C葉片表皮毛掃描電鏡圖。
[0060] D、廣藿香近軸面和遠軸面葉片表皮毛密度統計結果。**代表P〈0. 01，*代表 P〈0. 05,即與空質粒轉基因廣藿香相比具有顯著差異。

【具體實施方式】
[0061] 本發明人經過深入的研究，首次揭示一種調控植物揮發油或其中倍半萜類物質合成的關鍵基因-Squamosa啟動子結合蛋白基因（SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE genes，SPL(s))，該基因是miR156的靶基因。SPL通過直接與倍半萜合酶啟動子結合激活其轉錄；并通過轉基因技術，證實該機制在多種植物（包括香料植物）中發揮作用，可基于此獲得高產植物揮發油的植物。
[0062] 如本文所用，所述的"植物"包括但不限于：十字花科植物、唇形科植物等。比如，所述的"植物"包括但不限于：十字花科鼠耳芥屬植物如擬南芥（Arabidopsis thaliana)，唇形科廣霍香屬植物如廣藿香（Pogostemoncablin)。較佳地，所述的"植物"為香料植物，例如但不限于唇形科薄荷和羅勒、禾本科的檸檬香茅、茄科的番茄等。所述的植物適合進行基因的轉化操作。
[0063] 本發明人以擬南芥為模式植物，發現擬南芥miR156靶基因 SPL9直接結合TPS21 啟動子，并激活TPS21轉錄，從而使TPS21催化產物石竹烯成為擬南芥花序的主要揮發成分，含量翻倍。廣藿香（學名Pogostemon cablin)是唇形科植物，多年生草本直立植物，有香氣；擬南芥miR156靶基因 SPL10能夠提高廣藿香中PTS轉錄水平，從而提高了廣藿香精油重要組分廣藿香醇及大部分倍半萜成分的含量（如廣藿香醇及其他8種PTS催化的倍半萜產物）。本發明的研究結果提示，miR156靶基因 SPLs同樣調控了十字花科（擬南芥）和唇形科（廣藿香）的其他香料作物，甚至傘形科、菊科、蕓香科、樟科、姜科等的作物中植物揮發油含量，提供了通過基因工程改進作物中植物揮發油含量的方法。
[0064] 在本發明中，"Squamosa啟動子結合蛋白（SPL) "指具有提高植物揮發油或其中倍半萜含量功能的多肽。較佳地，所述的SPL是編碼基因受到miR156調控的一類SPL。例如，擬南芥中，miR156可調控11個SPL靶基因，進一步分為SPL3/4/5，SPL9/15，SPL2/10/ll和 SPL6/13A/B共4個分枝。作為本發明的優選方式，所述的SPL是SPL9或SPL10 ;所述的SPL9 可以具有At2g42200所示核苷酸序列或其同源序列、衍生物或變異體；所述的SPL10可以具有AT1G27370所示核苷酸序列或其同源序列、衍生物或變異體。
[0065] 本發明還包括具有與SPL蛋白相同功能的、SPL蛋白的變異形式。這些變異形式包括（但并不限于）：若干個（通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10 個，還更佳如1-8個、1-5個）氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一個或數個（通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內）氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括SPL蛋白的活性片段和活性衍生物。
[0066] 本發明還包括SPL蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語"片段"、"衍生物"和"類似物"是指基本上保持本發明的SPL蛋白相同的生物學功能或活性的多肽。本發明的多肽片段、衍生物或類似物可以是（i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基（優選保守性氨基酸殘基）被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或（ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽。根據本文的定義這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。
[0067] 任何一種SPL蛋白的生物活性片段都可以應用到本發明中。在這里，SPL蛋白的生物活性片段的含義是指作為一種多肽，其仍然能保持全長的SPL蛋白的全部或部分功能。通常情況下，所述的生物活性片段至少保持50%的全長SPL蛋白的活性。在更優選的條件下，所述活性片段能夠保持全長SPL蛋白的60%、70%、80%、90%、95%、99%、或100%的活性。 [0068] 多肽的變異形式包括：同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與SPL蛋白DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗 SPL蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含SPL蛋白或其片段的融合蛋白。
[0069] 任何與所述的SPL蛋白同源性高（比如與SEQ ID N0:2所示的序列的同源性為 70%或更高；優選的，同源性為80%或更高；更優選的，同源性為90%或更高，如同源性95%， 98%或99%)的、且具有SPL蛋白相同功能的蛋白也包括在本發明內。
[0070] 本發明還涉及編碼本發明SPL蛋白或其保守性變異多肽的多核苷酸序列。所述的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。 DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。術語"編碼多肽的多核苷酸 (編碼基因）"可以是包括編碼所述多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
[0071] 本發明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發生的等位變異體或非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。
[0072] 本發明還包括與本發明的核苷酸序列具有70%以上，更優選80%以上，更優選90% 以上，最優選95%以上相同性的核酸，所述核酸也具有SEQ ID NO: 1所示序列相同的調控作用。"相同性"是指按照位置相同的百分比，兩條或多條核酸之間的相似水平（即序列同源性、相似性或同一'I"生）。
[0073] 應理解，雖然本發明的SPL基因優選獲自十字花科植物，但是獲自其它植物的與擬南芥SPL基因高度同源（如具有70%以上，如80%，85%、90%、95%、甚至98%序列相同性）的其它SPL基因也在本發明考慮的范圍之內。比對序列相同性的方法和工具也是本領域周知的，例如BLAST。
[0074] 本發明也涉及包含所述的多核苷酸的載體，以及用所述的載體或SPL基因工程產生的宿主細胞。
[0075] SPL基因可插入到重組表達載體中。術語"重組表達載體"指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒或其他載體。總之，只要能在宿主體內復制和穩定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。
[0076] 包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如植物細胞。代表性例子有：大腸桿菌，鏈霉菌屬、農桿菌；真菌細胞如酵母；植物細胞等。
[0077] 所述的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強基因的轉錄。本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當的載體、啟動子、增強子和宿主細胞。
[0078] 用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。轉化植物可使用農桿菌轉化或基因槍轉化等方法，例如噴灑法、葉盤法、水稻幼胚轉化法等。對于轉化的植物組織或器官可以用常規方法再生成植株，從而獲得植物揮發油性狀發生改變的植物。
[0079] 本發明的SPL基因可由組織特異啟動子驅動，特異性表達。所述的特異啟動子可以是外源（異源）的。對所述特異啟動子的核酸序列沒有特別的限制（如一種結構性核酸序列），例如某些在農業或植物改良上具有重要器官特異性的啟動子。
[0080] 用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。轉化植物也可使用農桿菌轉化或基因槍轉化等方法，例如葉盤法、幼胚轉化法、花芽浸泡法等。對于轉化的植物細胞、組織或器官可以用常規方法再生成植株，從而獲得轉基因的植物。
[0081] 作為一種方式，制備轉基因植物的方法是：將攜帶啟動子序列和目的基因（可操作地連接）的表達載體轉入農桿菌，農桿菌再將含啟動子和目的基因的載體片段整合到植物的染色體上。涉及的轉基因受體植物例如是擬南芥，廣藿香。
[0082] 本發明提供了所述的SPL蛋白或SPL基因的用途，用于提高植物揮發油或其中倍半萜含量。
[0083] 本發明還涉及SPL的上調劑或下調劑及其用途。由于SPL的上調劑或下調劑可調節SPL的表達和/或調節SPL的活性等，因此，所述的SPL的上調劑或下調劑也可通過對 SPL的影響來調節植物揮發油或其中倍半萜含量，從而達到改良植物的目的。
[0084] 任何可提高SPL蛋白的活性、提高SPL蛋白的穩定性、促進SPL蛋白的表達、延長 SPL蛋白有效作用時間、或促進SPL的轉錄和翻譯的物質均可用于本發明，用于提高植物揮發油或其中倍半萜含量。任何可降低SPL蛋白的活性、降低SPL蛋白的穩定性、抑制SPL蛋白的表達、減少SPL蛋白有效作用時間、或降低SPL的轉錄和翻譯的物質均可用于本發明，作為SPL的下調劑、拮抗劑或抑制劑（即：下調SPL蛋白表達的物質），如抗所述SPL蛋白的抗體，干擾所述SPL蛋白的編碼基因表達的干擾分子（如可形成microRNA的干擾分子）。所述的下調劑、拮抗劑或抑制劑可用于通過下調SPL的表達，降低植物揮發油或其中倍半萜含量。在得知了靶序列后，制備干擾特定基因表達的干擾分子的方法是本領域人員熟知的。
[0085] 本發明還涉及一種改良植物的方法，該方法包括調節所述植物中SPL基因的表達。
[0086] -方面，本發明還提供了一種提高植物揮發油或其中倍半萜含量的方法，所述的方法包括：上調所述植物中SPL基因的表達（包括使SPL基因過表達）。
[0087] 在得知了所述的SPL蛋白的用途后，可以采用本領域人員熟知的多種方法來調節所述的SPL蛋白的表達。比如可通過本領域人員已知的途徑將攜帶SPL基因的表達單位 (比如表達載體或病毒等）遞送到靶點上，并使之表達活性的SPL蛋白。
[0088] 此外，也可以采用本領域人員熟知的多種方法來降低SPL基因的表達或使之缺失表達，比如將靶向SPL基因的miRNA或攜帶反義SPL基因的表達單位（比如表達載體或病毒等）遞送到靶點上，使得細胞或植物組織不表達或降低表達SPL基因。
[0089] 作為本發明的一種實施方式，提供了一種制備轉基因植物的方法，包括：（1)將外源的SPL基因轉入植物組織、器官或組織，獲得轉化入SPL基因的植物細胞、組織、器官或種子；和（2)將步驟（1)獲得的轉入了外源SPL基因的植物組織、器官或種子再生成植物植株。
[0090] 作為一種優選的實例，所述的方法包括步驟：（si)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有SPL基因；（s2)將植物組織、器官與步驟（si)中的農桿菌接觸，從而使SPL基因轉入植物細胞，并且整合到植物細胞的染色體上；（s3)選擇出轉入SPL基因的植物細胞、組織、器官或種子；以及（s4)將步驟（s3)中的植物細胞、組織、器官或種子再生成植物。
[0091] 作為另一種優選方式，鑒于SPL基因是miR156的靶基因，可通過下調miR156來上調SPL基因的表達。可下調miR156的抑制分子例如是MM156。
[0092] 其它增加 SPL基因或其同源基因表達的方法是本領域周知的。例如，可通過用強啟動子驅動從而增強SPL基因或其同源基因的表達。或者通過增強子（如水稻waxy基因第一內含子、Actin基因第一內含子等）來增強該SPL基因的表達。適用于本發明方法的強啟動子包括但不限于：35s啟動子，水稻、玉米的Ubi啟動子等。
[0093] 優選的，還提供了一種降低植物中SPL基因的表達的方法，所述的方法包括：（1) 將SPL基因表達抑制分子轉入植物組織、器官或種子，獲得轉化入所述表達抑制分子的植物組織、器官或種子；（2)將步驟（1)獲得的轉入了所述表達抑制分子的植物組織、器官或種子再生成植物。較佳地，所述的表達抑制分子是miR156f。
[0094] 本發明還包括利用前述任一種方法獲得的植物，所述的植物包括：轉入了 SPL基因或其同源基因的轉基因植物；或者SPL蛋白表達量（包括低表達或不表達）降低的植物等。
[0095] 可采用任何適當的常規手段，包括試劑、溫度、壓力條件等來實施所述的方法。
[0096] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。
[0097] 實施例1、擬南芥miR156和SPL10基因的分離
[0098] 依據擬南芥信息資源網站（The Arabidopsis Information Resource，TAIR)網站上AT5G26147(miR156f)的基因組序列信息，序列是（SEQ ID N0:1) :TGGCTAGGGTTTATAGATG TATGTGATATTAAGAGATATGAAACATATTTGTCGACGGTTTGAGTGGTGAGGAATTGATGGTGACAGAAGAGAGTG AGCACACATGGTGGCTTTCTTGCATATTTGAAGGTTCCATGCTTGAAGCTATGTGTGCTCACTCTCTATCCGTCACC CCCTTCTCTCCCTCTCCCTCTCTCTCTCTCTCTCTACAGCATTTCATTTAGTTTTTAGAGTTAAACATTTTGATTTT GATTTTTACATCCATTCTTTTGGTTT。
[0099] 合成引物 miR156-F-BamHI、miR156-R-SacI，PCR 擴增得到擬南芥 miR156f 基因組部分序列（圖ΙΑ);根據AT1G27370(SPL10)序列信息，合成引物SPL10-F、SPL10-R，PCR擴增得到編碼擬南芥 SQUMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN LIKE 基因 SPL10 序列。將 miR156f 和SPL10的PCR擴增片段ΤΑ克隆到pMD18-T載體中，測序正確后作為模板。
[0100] 表1、載體構建及qRT-PCR引物列表
[0101]

【權利要求】
1. 一種調節植物揮發油或其中的倍半萜含量的方法，其特征在于，所述方法包括：調節植物中Squamosa啟動子結合蛋白基因的表達。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的調節植物中Squamosa啟動子結合蛋白基因的表達是：上調植物中Squamosa啟動子結合蛋白基因的表達，從而提商植物揮發油或其中的倍半萜含量。
3. 如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的上調植物中Squamosa啟動子結合蛋白基因的表達包括：將Squamosa啟動子結合蛋白基因轉化植物，獲得過表達Squamosa啟動子結合蛋白基因的轉基因植物，所述的轉基因植物的揮發油或其中倍半萜含量提高。
4. 如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的上調植物中Squamosa啟動子結合蛋白基因的表達包括：將下調miR156表達的抑制分子轉化植物，通過下調miR156來上調 Squamosa啟動子結合蛋白基因的表達，獲得的轉基因植物的揮發油或其中倍半萜含量提商。
5. 如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的下調miR156表達的抑制分子是 MM156或其活性片段；較佳地，所述的MM156的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示，所述的 MM156的活性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2中第237-256位所示。
6. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的調節植物中Squamosa啟動子結合蛋白基因的表達是：下調植物中Squamosa啟動子結合蛋白基因的表達，從而降低植物揮發油或其中倍半萜含量。
7. 如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述的下調植物中Squamosa啟動子結合蛋白基因的表達包括：將Squamosa啟動子結合蛋白基因的表達抑制分子轉化植物，獲得 Squamosa啟動子結合蛋白基因表達受抑制的轉基因植物，所述的轉基因植物的揮發油或其中倍半萜含量降低。
8. 如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述的Squamosa啟動子結合蛋白基因的表達抑制分子是miR156f ;較佳地，所述的miR156f具有SEQ ID NO: 1中第82-101位所示核苷酸序列；所述的miR156f前體具有SEQ ID NO: 1或其中第82-171位所示核苷酸序列。
9. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植物包括：十字花科植物，唇形科植物，傘形科植物，菊科植物，蕓香科植物，樟科植物，姜科植物，禾本科植物，茄科植物。
10. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的倍半萜包括：石竹烯，廣藿香醇， β -廣藿香烯，Y -廣藿香烯，α -廣藿香烯，β -欖香烯，α -愈創木烯，4, 11-愈創木二烯， α -布藜烯。 11. Squamosa啟動子結合蛋白的用途，用于提高植物揮發油或其中倍半萜含量。
12. 下調miR156表達的抑制分子的用途，用于提高植物揮發油或其中倍半萜含量。
13. 如權利要求12所述的用途，其特征在于，所述的下調miR156表達的抑制分子是 MM156或其活性片段；較佳地，所述的MM156的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示，所述的 MM156的活性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2中第237-256位所示。 14. Squamosa啟動子結合蛋白基因的表達抑制分子的用途，用于降低植物揮發油或其中倍半萜含量。
15. 如權利要求14所述的用途，其特征在于，所述的Squamosa啟動子結合蛋白基因的表達抑制分子是miR156f;較佳地，所述的miR156f具有SEQ ID N0:1中第82-101位所示核苷酸序列；所述的miR156f前體具有SEQ ID NO: 1或其中第82-171位所示核苷酸序列。
【文檔編號】C12N15/113GK104232655SQ201310237889
【公開日】2014年12月24日申請日期:2013年6月14日優先權日:2013年6月14日
【發明者】陳曉亞, 于宗霞, 王凌健, 王佳偉申請人:中國科學院上海生命科學研究院

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