一種基于雙向等溫延伸的核酸合成方法

一種基于雙向等溫延伸的核酸合成方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種雙向等溫延伸的核酸拼接方法。該方法是設立一個延伸體系，延伸體系由一個起始雙鏈，一組相互不同并能有序拼接的寡核苷酸，一個含有連接，聚合和限制性內(nèi)切酶活性的混合酶，以及與混合酶配套的反應緩沖液組成；在多種酶的協(xié)作下，這些寡核苷酸以起始鏈為起始進行等溫拼接，合成目標DNA長鏈。本發(fā)明具有成功率高、設計簡單和操作簡單、自動化高等特點，因而具有潛在的低成本優(yōu)勢，對于基因合成的推廣，生物工程，生物醫(yī)學和生物信息學等領域的發(fā)展存在潛在的應用價值。
【專利說明】-種基于雙向等溫延伸的核酸合成方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及的是一種核酸合成領域的方法，特別是一種雙向等溫延伸的核酸拼 接方法。

【背景技術】
[0002] 隨著生物技術和生物醫(yī)藥的發(fā)展，對核酸特別是DNA序列的設計和修改正越來越 獲得重視。傳統(tǒng)的基因擴增，克隆，重組和突變方法只能獲得自然界已有或接近自然界已 有的DNA序列，而DNA的化學合成技術可以合成用戶指定的寡核苷酸序列，但由于化學反 應的效率和出錯率問題，這些寡核苷酸序列通常長度小于120-200個堿基.要獲得幾百個 甚至幾百萬個堿基長度的DNA序列，就需要將這些寡核苷酸拼接起來。常見的拼接方法 有：1)基于連接酶的方法（下面稱為連接酶法），2)基于聚合酶的方法（聚合酶法）以及 基于DNA重組的方法（重組法）。
[0003] 連接酶法是最早出現(xiàn)的DNA拼接技術（Khorana et ah (1979) Science.203:614-25 ; Smith et al. (1982)Nucleic Acids Res. 10:4467-82;Edge et al. (1983)Nucleic Acids Res. 11:6419-35)。在這個方法中，目標DNA序列被分解成寡核 苷酸片段，相鄰的片段之間存在重疊，這些片段被化學合成并磷酸化后，就可以自組裝成 更長的存在缺刻的序列，在連接酶（比如，T4DNA連接酶，Taq DNA連接酶，Pfu DNA連接酶 等）的作用下，這些缺口被修復，從而獲得目標DNA序列?；谀０宓倪B接酶法（U.S. Pat. No. 6110668)和固相法（U. S. Pat. App. Pub. Nos. 2005/0106606A1, 2011/0124055A1)是連接 酶法的衍生方法。
[0004] 在上世紀90年代，出現(xiàn)了聚合酶法DNA拼接技術（Stemmer et al. (1995) Genel64:49-53;Hoover et al. (2002)Nucleic Acids Res. 30:e43;Cherry et al. (2008) J. Biochem. Biophys. Methods. 70:820-22)。由于這個方法的簡單和快速，使之迅速在DNA 合成領域占據(jù)了非常重要的位置。在這個方法中，寡核苷酸的設計與連接酶法非常相似， 而拼接的過程則非常類似于聚合酶鏈式反應（PCR)，在聚合酶（如Taq DNA聚合酶，PfuDNA 聚合酶等）的作用下，相互雜交的寡核苷酸被聚合延長，在每個溫度循環(huán)中，寡核苷酸或 中間產(chǎn)物都會經(jīng)歷一次變性，退火和延伸的過程，而其長度也會逐漸增加，直至獲得全長 的序列。這些全長序列可以作為模板用于后續(xù)擴增。
[0005] 近幾年，基于重組和等溫的DNA拼接技術正越來越受到歡迎，因為它們操 作更加簡單。一種基于酵母體內(nèi)重組的技術（Gibson et al. (2009)Nucleic Acids Res. 37(20) :6984-90)利用酵母細胞內(nèi)強大的重組系統(tǒng)來在一步之內(nèi)拼接寡核苷酸和載 體，而另一種基于體外重組的技術被稱為吉布森拼接（Gibson assembly) (Gibson et al. (2010) Nature Methods. 7:901-3)，它利用 3 種酶（即 T5 外切酶，Phusion 聚合酶和 Taq 連接酶）的相互協(xié)作，在一步之內(nèi)將寡核苷酸和載體拼接起來，雖然這種方法嚴格來說并 不是重組，但其能組裝DNA末端之間存在幾十個堿基重疊的序列，這一點與重組非常相 似。上述兩種方法與連接酶法或聚合酶法比較起來，省略了溫度循環(huán)，PCR擴增，割膠純 化，限制性內(nèi)切酶酶切和連接等操作，使得DNA合成變得更加容易自動化。
[0006] 以上所有方法都需要用到相互重疊的寡核苷酸，因此都存在一個內(nèi)生問題，即錯 誤雜交，尤其是當序列中存在重復序列或反向重復序列的時候，這些序列會導致錯誤連接 或錯誤延伸，甚至完全無法拼接，連接酶法和聚合酶法在拼接時都只用到一種酶（連接酶 或聚合酶），但在轉(zhuǎn)化細胞之前，需要更多的步驟（即PCR擴增，割膠純化，限制性內(nèi)切 酶酶切和連接），因而很難用于高通量的合成。而重組法需要用到多種酶的協(xié)作（如在體 外重組中用到了 3種酶，而在體內(nèi)拼接中則利用了細胞內(nèi)精巧的重組系統(tǒng)），但操作起來 更加簡單，并且利于自動化。
[0007] 本發(fā)明提供了一種與重組法一樣簡單（即只要一步拼接即可轉(zhuǎn)化細胞）的方法， 但并不使用重疊的寡核苷酸，因此可以用于合成幾乎任何DNA，包括高GC，低GC和含有重 復序列的DNA。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中的不足，提供一種等溫雙向生長的基因合成 方法。使其方法統(tǒng)一、設計和操作簡單，將有利于降低成本和合成周期。
[0009] 本發(fā)明是通過以下技術方案來實現(xiàn)的，本發(fā)明通過特殊的寡核苷酸序列設計方 法，得到一系列用于延伸的包含發(fā)夾結構和酶切位點的寡核苷酸鏈，這些寡核苷酸鏈在多 種酶的協(xié)同作用下進行等溫生長，合成目標DNA長鏈。
[0010] 本發(fā)明的方法，是設立一個延伸體系，延伸體系由一個起始雙鏈，一組相互不同 并能有序拼接的寡核苷酸，一個含有連接，聚合和限制性內(nèi)切酶活性的混合酶，以及與混 合酶配套的反應緩沖液組成；在多種酶的協(xié)作下，這些寡核苷酸以起始鏈為起始進行等溫 拼接，合成目標DNA長鏈；所述的寡核苷酸組中的每個寡核苷酸都是帶有2-10個堿基懸掛 的發(fā)夾結構，發(fā)夾結構內(nèi)部含有一個內(nèi)切酶識別序列，寡核苷酸的5'端沒有磷酸化； [0011] 所述的拼接過程如下 ：
[0012] 連接酶將起始雙鏈與體系中存在的某個發(fā)夾結構進行連接，聚合酶延伸使得發(fā)夾 結構打開，限制性內(nèi)切酶位點成為雙鏈；限制性內(nèi)切酶對已經(jīng)成為雙鏈的位點進行切割； 然后延伸按下面3個步驟循環(huán)進行，直至合成目標目標DNA長鏈：
[0013] (1)連接酶將切割產(chǎn)生的末端與體系中存在的某個發(fā)夾結構進行連接；
[0014] (2)聚合酶延伸使得發(fā)夾結構打開，限制性內(nèi)切酶位點成為雙鏈；
[0015] (3)限制性內(nèi)切酶對已經(jīng)成為雙鏈的位點進行切割。
[0016] 所述寡核苷酸依次由3部分組成，分別為：1)DNA短片段，這是目標DNA序列的一 部分，會被拼接到最終產(chǎn)物中；2) -個內(nèi)切酶識別序列，以及3) -個互補片段，互補片段 與DNA短片端的3'端互補，互補片段的5'端第一個堿基與DNA短片段3'端的第n+1個 堿基對齊，η為2-10的整數(shù)，這η個堿基被稱為這個寡核苷酸的懸掛；在這個寡核苷酸被 拼接后，會產(chǎn)生一個新的懸掛，被稱為這個寡核苷酸的新懸掛；在一個延伸體系的一組寡 核苷酸中，任意兩個寡核苷酸的懸掛都是不同的；而每個寡核苷酸的新懸掛則與體系中的 其中某一個寡核苷酸的懸掛或新懸掛相互匹配；從而實現(xiàn)一組寡核苷酸的有序拼接。圖1 顯示了一個典型的等法寡核苷酸，這個寡核苷酸的開放端有一個由'CT'組成的3'懸掛， 其i內(nèi)切酶是BtsI (GCAGTG)，互補片段是8堿基序列（GTGAAGTC)，與DNA短片段的近3' 部分互補，使整個寡核苷酸閉合成一個穩(wěn)定的發(fā)夾，另外，這個DNA短片端還有一個內(nèi)生 的發(fā)夾，其莖部由5對堿基組成，使得整個發(fā)夾更加穩(wěn)定。
[0017] 本發(fā)明一個具體的方案，包括以下步驟：
[0018] 1)根據(jù)目標DNA序列設計并合成起始雙鏈和一組寡核苷酸；
[0019] 2)建立延伸體系，所述延伸體系由一個起始雙鏈，一組寡核苷酸，一個含有連 接，聚合和限制性內(nèi)切酶活性的混合酶，以及與混合酶配套的反應緩沖液組成；在多種酶 的協(xié)作下，這些寡核苷酸進行等溫拼接，合成目標DNA長鏈；
[0020] 所述寡核苷酸的設計方法如下：
[0021] (1)將目標DNA雙鏈的其中一條連續(xù)單鏈記為正鏈，另一條連續(xù)單鏈記為負鏈，方 向皆為5' 一 3' ；
[0022] (2)設定設計的寡核苷酸發(fā)夾結構3'端懸掛堿基數(shù)為N，N為不小于2的整數(shù)，將 目標DNA雙鏈分段成多個首尾相接的短片段，所述每個短片段3'端的N個堿基序列是唯一 的；這些短片段由正鏈部分和負鏈部分組成；
[0023] (3)在上述短片段中選取一段作為起始雙鏈；將位于起始雙鏈與正鏈5'端之間的 短片段記為左向延伸短片段，將位于起始雙鏈與正鏈3'端之間的短片段記為右向延伸短片 段；
[0024] (4)以左向延伸短片段正鏈部分和右向延伸短片段負鏈部分為基礎構建一組寡核 苷酸；寡核苷酸的5'端不能磷酸化；每個寡核苷酸3' -5'依次由下述3部分組成：1)延伸 短片段，2) -個i內(nèi)切酶識別序列，3) -個互補片段，這個互補片段的5'端第一個堿基 與延伸短片段3'端的第N+1個堿基對齊并互補，形成發(fā)夾結構，該發(fā)夾結構3'端有N個 堿基懸掛。
[0025] 本發(fā)明的另一種具體的方案，具體步驟是：
[0026] 1)根據(jù)目標DNA序列設計一組寡核苷酸；
[0027] 2)建立延伸體系，所述延伸體系由一個起始雙鏈，一組寡核苷酸，一個含有連 接，聚合和限制性內(nèi)切酶活性的混合酶，以及與混合酶配套的反應緩沖液組成；在多種酶 的協(xié)作下，這些寡核苷酸進行等溫拼接，合成目標DNA長鏈；
[0028] 所述寡核苷酸的設計方法如下：
[0029] ( 1)將目標DNA雙鏈的其中一條連續(xù)單鏈記為正鏈，另一條連續(xù)單鏈記為負鏈，方 向皆為5' 一 3' ；
[0030] (2)設定設計的寡核苷酸發(fā)夾結構3'端懸掛堿基數(shù)為N，N為2-10的整數(shù)，將目標 DNA雙鏈分段成多個首尾相接的短片段，所述每個短片段3'端的N個堿基序列是唯一的； 這些短片段由正鏈部分和負鏈部分組成；
[0031] (3)選取兩個相鄰短片斷之間的分段點作為中心，中心與正鏈5 '端之間的短片段 記為右向延伸短片段，中心與正鏈3'端之間的短片段記為左向延伸片段。
[0032] (4)以左向延伸短片段正鏈部分和右向延伸短片段負鏈部分為基礎構建一組寡核 苷酸；寡核苷酸的5'端不能磷酸化；每個寡核苷酸3' -5'依次由下述3部分組成：1)延伸 短片段，2) -個i內(nèi)切酶識別序列，3) -個互補片段，這個互補片段的5'端第一個堿基 與延伸短片段3'端的第N+1個堿基對齊并互補，形成發(fā)夾結構，該發(fā)夾結構3'端有N個 堿基懸掛。
[0033] 本發(fā)明中由起始雙鏈構建得到的序列記為核心引物，由延伸序列構建得到的序列 記為延伸引物；
[0034] 核心引物可由兩段部分匹配的單鏈互為模版延伸后經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割得到；
[0035] 所述的分段所得的短序列其長度在5個堿基以上。
[0036] 所述的發(fā)夾結構是指在一條DNA線性單鏈中存在自身相互匹配，而在局部形成雙 鏈的一種結構，這種結構的雙鏈部分稱為發(fā)夾莖部，雙鏈的兩側(cè)部分稱為環(huán)部，閉合的環(huán)部 稱為閉環(huán)部分，開放的環(huán)部稱為開環(huán)部分。
[0037] 所述的引物是指寡核苷酸鏈。
[0038] 如上所述的寡核苷酸鏈設計好后，可利用普通的寡核苷酸鏈自動合成儀合成。
[0039] 所述的純化是指中性聚丙烯酰胺凝膠電泳（中性PAGE)純化。
[0040] 所述的等溫生長，包括以下步驟：
[0041] 將所有寡核苷酸鏈混合在反應體系中，并加入具有聚合酶、連接酶和限制性內(nèi)切 酶三種活性的混合酶；
[0042] 所述的反應體系是指可以有效發(fā)揮上述三種酶相應活性的體系，通過調(diào)節(jié)陽離 子的濃度和種類，調(diào)節(jié)體系的PH值等得到。
[0043] 所述的聚合酶可以是DNA聚合酶，也可以是RNA聚合酶；可以是耐熱的，也可以 是不耐熱的；優(yōu)選無3 '一 5'外切酶活性的聚合酶，如Klenow exo-，反轉(zhuǎn)錄酶等。
[0044] 所述的限制性內(nèi)切酶是指type II型的，優(yōu)選切割后的序列是3'懸掛的限制性 內(nèi)切酶，比如BtsI，Mval269I等。
[0045] 所述的連接酶是指能將兩段DNA連接成為一段DNA的酶，優(yōu)選T4DNA連接酶。
[0046] 所述的延伸，在3個步驟的循環(huán)間進行：
[0047] (1)聚合酶延伸使得發(fā)夾結構打開，限制性內(nèi)切酶位點成為雙鏈；
[0048] (2)限制性內(nèi)切酶對已經(jīng)成為雙鏈的位點進行切割；
[0049] (3)連接酶將切割產(chǎn)生的末端與體系中存在的某個發(fā)夾結構進行連接；
[0050] 這三個步驟都在同一個溫度下進行，溫浴時間越長，序列的平均長度越長，直到 目標DNA序列產(chǎn)生。
[0051] 本發(fā)明中，在多種酶的協(xié)作下，對這些寡核苷酸進行等溫拼接，這些酶包括一種 連接酶，一種聚合酶（以下記為i聚合酶）和一種限制性內(nèi)切酶（以下記為i內(nèi)切酶）；每 一個寡核苷酸都被設計成一個帶有2個或多個堿基懸掛的發(fā)夾結構，需要注意的是，這個 寡核苷酸的5'端不能磷酸化，因此，當這個寡核苷酸被連接到一個與之匹配的磷酸化粘 端（比如一個限制性內(nèi)切酶消化產(chǎn)生的粘端）時，在結合處會形成一個缺刻，這個缺刻在 i聚合酶的作用下被補平，使發(fā)夾變成雙鏈，從而使得之前設計在寡核苷酸上的i內(nèi)切酶 位點由單鏈變成雙鏈，成為i內(nèi)切酶的識別底物，i內(nèi)切酶在雙鏈上酶切產(chǎn)生一個新的磷 酸化粘端，以開始新的一輪拼接；經(jīng)過多輪的拼接，DNA分子被串行延伸，之間并不需要人 為或儀器的干預，這個特點并不見于上述提及的方法中。
[0052] -個線性雙鏈DNA的末端可以是粘端或平末端，在連接酶的作用下，一個平末端 可以與其它平末端相互連接，只要這兩個平末端中至少有一個末端是磷酸化的。而粘端之 間的連接是有選擇性的，只有符合以下條件，兩個粘端才能被連接。1)兩個粘端的懸掛部 分是按照堿基配對原則（即A與T配對，G與C配對）互補的。2)兩個粘端中至少有一個 粘端是5'磷酸化的.3)兩個粘端的懸掛是同類型的，即同為3'懸掛或5'懸掛。
[0053] DNA聚合酶對不同的末端會有不同的作用，5'懸掛末端或平末端在聚合酶的作用 下會被補平或添加一個堿基，這是由于聚合酶的5'-3'聚合活性和末端轉(zhuǎn)移酶活性導致 的。因此這種末端不適合用于本技術。相反，一個3'懸掛的末端可以在聚合酶作用下保持 不變，只要這個聚合酶沒有3'-5'外切酶活性，比如1(16110￥610-聚合酶，？11丨29610-聚 合酶，以及各種反轉(zhuǎn)錄聚合酶等.在本技術中，發(fā)夾必須保持不被修改，直至體系中出現(xiàn) 一個匹配的末端。
[0054] 在同一個拼接體系的發(fā)夾之間，其粘端是不相同的，因此拼接是有序的。對于2 堿基懸掛，有16種不同的組合，而3堿基懸掛有64種，因此一個拼接體系中，發(fā)夾的數(shù) 量上限是一定的，如果寡核苷酸的長度是限制的，那么一次拼接所能獲得的DNA長度也是 一定的。比如對于2堿基懸掛的發(fā)夾，如果限定DNA短片端的長度為40個堿基，那么可 以拼接得到的最長DNA序列為640喊基。
[0055] 對寡核苷酸二級結構的預測在本發(fā)明中非常重要。在大多數(shù)情況下，一個7-12 個堿基的互補片段可以保證一個寡核苷酸的正確折疊。有些情況下，DNA短片段中存在一 個與互補片段相沖突的內(nèi)生發(fā)夾，或者互補片段與DNA短片段中除指定序列外的其它部 分也能很好匹配，那么寡核苷酸可能會錯誤折疊，從而導致延伸產(chǎn)物不足，甚至延伸失 敗。為了使寡核苷酸能夠正確折疊，二級結構的正確預測是必不可少的，這需要對DNA 各種二級結構（如雙螺旋配對，堿基錯配，末端堿基懸掛，發(fā)夾環(huán)部長度，環(huán)部類型 等）的熱動力學參數(shù)有一個系統(tǒng)的研究（John et al. (2004) · Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 33:415-40)。此外，還需要一個有效的搜尋算法，能夠快速地計算出最穩(wěn)定結 構（即含有最低自由能的結構），次穩(wěn)定結構等，以確保絕大部分分子都能正確折疊.由 Zuker 等人開發(fā)的基于上述設想的軟件 Mfold(Michael Zuker. (2003).Nucleic Acids Res. 31:3406-15)已能很好地預測DNA的二級結構.通常情況下，在正確折疊與錯誤折疊 之間保持至少1. 5千焦/摩爾（1M氯化鈉存在的情況下）的自由能差，才能保證大部分寡 核苷酸分子的正確折疊。
[0056] 在室溫下，一個穩(wěn)定的發(fā)夾將很難與另一個單鏈DNA分子雜交，因為在雜交之 前，需要先打開發(fā)夾，所以這種雜交反應一般需要幾分鐘甚至幾個小時才能完成（Andrew et al. (2003). Nucleic Acids Res. 31:1319-30).因此，不難斷定，發(fā)生在兩個穩(wěn)定發(fā)夾 之間的雜交將更加難以發(fā)生.在本技術中，一組發(fā)夾在反應體系中可以共存很長時間，而 不發(fā)生顯著的雜交，這意味著目標序列被隱藏在穩(wěn)定的結構中，從而使本技術對DNA序列 內(nèi)容不敏感，可以用于各種復雜序列（如含有重復結構，內(nèi)生發(fā)夾的序列，GC含量極端的 序列等）的合成.在其它技術中經(jīng)常出現(xiàn)的錯誤連接或錯誤延伸也被極大地降低了，使得 本技術成為一個高統(tǒng)一性和成功率的DNA合成技術。
[0057] 本發(fā)明所述的I內(nèi)切酶需要滿足以下幾個條件，1)其酶切位置位于識別序列的外 邊.這樣當酶切完成后，產(chǎn)生的新的延伸末端不會含有i內(nèi)切酶識別序列上殘余的堿基。 2)酶切產(chǎn)生的末端是3'懸掛，而且懸掛堿基數(shù)不小于兩個堿基。滿足上述條件的部分限 制性內(nèi)切酶見表1。
[0058] 表1.用于本申請的部分限制性內(nèi)切酶

【權利要求】
1. 一種基于雙向等溫延伸的核酸合成方法，包括以下步驟： 設立一個延伸體系，延伸體系由一個起始雙鏈，一組相互不同并能有序拼接的寡核苷 酸，一個含有連接，聚合和限制性內(nèi)切酶活性的混合酶，以及與混合酶配套的反應緩沖液 組成；在多種酶的協(xié)作下，這些寡核苷酸以起始鏈為起始進行等溫拼接，合成目標DNA長 鏈；所述的寡核苷酸組中的每個寡核苷酸都是帶有2-10個堿基懸掛的發(fā)夾結構，發(fā)夾結構 內(nèi)部含有一個內(nèi)切酶識別序列，寡核苷酸的5'端沒有磷酸化； 所述的拼接過程如下： 連接酶將起始雙鏈與體系中存在的某個發(fā)夾結構進行連接，聚合酶延伸使得發(fā)夾結構 打開，限制性內(nèi)切酶位點成為雙鏈；限制性內(nèi)切酶對已經(jīng)成為雙鏈的位點進行切割；然后 延伸按下面3個步驟循環(huán)進行，直至合成目標目標DNA長鏈： (1) 連接酶將切割產(chǎn)生的末端與體系中存在的某個發(fā)夾結構進行連接； (2) 聚合酶延伸使得發(fā)夾結構打開，限制性內(nèi)切酶位點成為雙鏈； (3) 限制性內(nèi)切酶對已經(jīng)成為雙鏈的位點進行切割。
2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述寡核苷酸依次由3部分組成，分別 為：1)DNA短片段，這是目標DNA序列的一部分，會被拼接到最終產(chǎn)物中；2) -個內(nèi)切酶識 別序列，以及3) -個互補片段，互補片段與DNA短片端的3'端互補，互補片段的5'端 第一個堿基與DNA短片段3'端的第n+1個堿基對齊，η為2-10的整數(shù)，這η個堿基被稱 為這個寡核苷酸的懸掛；在這個寡核苷酸被拼接后，會產(chǎn)生一個新的懸掛，被稱為這個寡 核苷酸的新懸掛；在一個延伸體系的一組寡核苷酸中，任意兩個寡核苷酸的懸掛都是不同 的；而每個寡核苷酸的新懸掛則與體系中的其中某一個寡核苷酸的懸掛或新懸掛相互匹 配；從而實現(xiàn)一組寡核苷酸的有序拼接。
3. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述起始雙鏈是一個兩端是粘端的線性 DNA雙鏈，在拼接反應中，充當延伸起始端；起始雙鏈通過下述3種方法之一產(chǎn)生： 1) 在拼接反應體系中直接生成，是由兩條相互雜交的被稱為起始引物對的寡核苷酸 組成，在延伸體系中的聚合酶和限制性內(nèi)切酶的作用下，產(chǎn)生起始雙鏈； 2) 額外添加的DNA雙鏈，在拼接體系中的內(nèi)切酶作用下形成起始雙鏈； 3) 額外添加的DNA雙鏈，兩端已經(jīng)是粘端，可以直接用來起始拼接反應。
4. 如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的聚合酶為沒有3'-5'外切酶活性的聚 合酶。
5. 如權利要求1所述的方法，其特征在于所述互補片段的長度為6-30個堿基。
6. 如權利要求1所述的方法，其特征在于所述限制性內(nèi)切酶是指type II型的，切割 后的序列是3'懸掛的限制性內(nèi)切酶。
7. 如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述限制性內(nèi)切酶是BtsI，BSrDI。
8. 如權利要求1所述的方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 根據(jù)目標DNA序列設計并合成起始雙鏈和一組寡核苷酸； 2) 建立延伸體系，所述延伸體系由一個起始雙鏈，一組寡核苷酸，一個含有連接，聚 合和限制性內(nèi)切酶活性的混合酶，以及與混合酶配套的反應緩沖液組成；在多種酶的協(xié)作 下，這些寡核苷酸進行等溫拼接，合成目標DNA長鏈； 所述寡核苷酸的設計方法如下： (1) 將目標DNA雙鏈的其中一條連續(xù)單鏈記為正鏈，另一條連續(xù)單鏈記為負鏈，方向皆 為 5，一 3，； (2) 設定設計的寡核苷酸發(fā)夾結構3'端懸掛堿基數(shù)為N，N為2-10的整數(shù)，將目標DNA 雙鏈分段成多個首尾相接的短片段，所述每個短片段3'端的N個堿基序列是唯一的；這些 短片段由正鏈部分和負鏈部分組成； (3) 在上述短片段中選取一段作為起始雙鏈；將位于起始雙鏈與正鏈5'端之間的短片 段記為左向延伸短片段，將位于起始雙鏈與正鏈3'端之間的短片段記為右向延伸短片段； (4) 以左向延伸短片段正鏈部分和右向延伸短片段負鏈部分為基礎構建一組寡核苷 酸；寡核苷酸的5'端不能磷酸化；每個寡核苷酸3' -5'依次由下述3部分組成：1)延伸短 片段，2) -個i內(nèi)切酶識別序列，3) -個互補片段，這個互補片段的5'端第一個堿基與 延伸短片段3'端的第N+1個堿基對齊并互補，形成發(fā)夾結構，該發(fā)夾結構3'端有N個堿 基懸掛。
9.如權利要求1所述的方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 根據(jù)目標DNA序列設計一組寡核苷酸； 2) 建立延伸體系，所述延伸體系由一個起始雙鏈，一組寡核苷酸，一個含有連接，聚 合和限制性內(nèi)切酶活性的混合酶，以及與混合酶配套的反應緩沖液組成；在多種酶的協(xié)作 下，這些寡核苷酸進行等溫拼接，合成目標DNA長鏈； 所述寡核苷酸的設計方法如下： (1) 將目標DNA雙鏈的其中一條連續(xù)單鏈記為正鏈，另一條連續(xù)單鏈記為負鏈，方向皆 為 5，一 3，； (2) 設定設計的寡核苷酸發(fā)夾結構3'端懸掛堿基數(shù)為N，N為2-10的整數(shù)，將目標DNA 雙鏈分段成多個首尾相接的短片段，所述每個短片段3'端的N個堿基序列是唯一的；這些 短片段由正鏈部分和負鏈部分組成； (3) 選取兩個相鄰短片斷之間的分段點作為中心，中心與正鏈5 '端之間的短片段記為 右向延伸短片段，中心與正鏈3'端之間的短片段記為左向延伸片段。 (4) 以左向延伸短片段正鏈部分和右向延伸短片段負鏈部分為基礎構建一組寡核苷 酸；寡核苷酸的5'端不能磷酸化；每個寡核苷酸3' -5'依次由下述3部分組成：1)延伸短 片段，2) -個i內(nèi)切酶識別序列，3) -個互補片段，這個互補片段的5'端第一個堿基與 延伸短片段3'端的第N+1個堿基對齊并互補，形成發(fā)夾結構，該發(fā)夾結構3'端有N個堿 基懸掛。
【文檔編號】C12N15/10GK104212791SQ201310219029
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2013年6月3日 優(yōu)先權日:2013年6月3日
【發(fā)明者】林繼偉, 戴俊彪 申請人:無錫青蘭生物科技有限公司