一株厭氧海藻酸分解菌及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一株厭氧海藻酸分解菌Marinicatena?alginatilytica?SH-52，該菌株保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO：M2013073，本發明菌株為能有效降解海藻酸的厭氧微生物，可用于海藻酸裂解酶生產，且時間周期短，酶產量高，收集簡單，操作方便，易于工業產業化實施。
【專利說明】一株厭氧海藻酸分解菌及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一株厭氧以海藻酸分解菌及其應用，屬于海藻化工領域。
【背景技術】
[0002] 隨著對海洋資源的逐步開發，海藻中的多糖類物質尤其是海藻酸被廣泛應用于各種工業生產中。由海藻酸降解得到的海藻酸寡糖，由于分子量不同、Μ/G不同、結構不同，其生物學活性也不同，使其在醫藥、食品、農業等諸多領域都有廣泛應用。在醫藥領域，硫酸寡糖 SPMG (sulfated polymannuroguluronate)能夠抑制 HIV-1 進入細胞【Geng MjLi F，Xin X，et al (2003).The potential molecular targets of marine sulfatedpolymannuroguluronate interfering with HIV—I entry.1nteraction betweenSPMG and HIV-1 rgpl20 and CD4 molecule.Antiviral Res, 59 (2):127-135】。海藻酸寡糖還可以通過提高生物機體對腫瘤細胞的防御能力和增強宿主免疫系統來對抗腫瘤細胞【Yamamoto Y，Kurachi Mj Yamaguchi K，et al (2007).Stimulation ofmultiple cytokine production in mice by alginate oligosaccharides followingintraperitoneal administration.Carbohydr Res, 342 (8): 1133-1137.】。在食品領域，海藻酸寡糖可以在體外促進雙歧桿菌和乳酸菌的生長，同時抑制有害菌的生長，是一種新的益生元，用于保健食品的制作【Wang Y，Han F，Hu B，et al (2006).1n vivoprebiotic properties of alginate oligosaccharides prepared through enzymatichydrolysis of alginate.Nutr.Res.，26 (11): 597-603】。在農業領域，海藻酸寡糖可以促進種子的萌發和根的生長【Yonemoto Y，Tanaka H，Yamashita T，et al (1993).Promotion of germination and shoot elongation of some plants by alginateoligomers prepared with bacterial alginate lyase.J.Ferment.Bioeng.，75(1):68-70]o
[0003]目前，海藻酸降解為寡糖主要有酸水解法和酶解法【Haug A, Larsen B，SmidsrodO (1967).Studies on the sequence of uronic acid residues in alginic acid.Acta Chemica Scandinavicaj 21: 691-04.Park HHj Kam N Lee EYj et al (2011).Saccharification of alginate by using exolytic oligoalginate lyase frommarine bacterium Sphingomonas sp.MJ-3.Journal of Industrial and EngineeringChemistry, 17(5 - 6): 853 - 58】。酸水解法需要消耗大量鹽酸等高濃度酸，水解廢渣對環境污染嚴重，酸水解沒有特異性，不能有效控制寡糖的大小和其中甘露糖醛酸和古洛糖醛酸的組成，這些缺點都限制了海藻酸寡糖的大規模應用。而酶解法以其反應條件溫和，水解效率高，對環境無污染等優點，可以逐步取代酸水解法。同時，現在以發現的海藻酸裂解酶有polyM、polyG和polyMG底物特異性【Rahman MMj Wang Lj Inoue A, et al(2012).cDNAcloning and bacterial expression of a PL-14 alginate lyase from a herbivorousmarine snail Littorina brevicula.Carbohydr Res.360: 69-77】，可以有效的剪切不同G/M組成的海藻酸寡糖，并且海藻酸裂解酶有內切型和外切型【In Lee S，Choi SHj LeeEYj et al.Molecular cloning, purification, and characterization of a novelpolyMG-specific alginate lyase responsible for alginate MG block degradationin Stenotrophomas maltophilia KJ-2.Appl Microbiol Biotechnolj 2012， 95(6):1643-53 Rahman MMj Inoue A，Tanaka H，et al (2011).cDNA cloning of analginate lyase from a marine gastropod Aplysia kurodai and assessment ofcatalytically important residues of this enzyme.Biochimie.93(10): 1720-30】，這兩種酶聯合利用可輕易的獲得目的大小的海藻酸寡糖。所以，開發多種類型的高活性的海藻酸裂解酶前景廣闊，海藻酸裂解酶多來源于海洋細菌，篩選產高活性海藻酸裂解酶的海洋細菌行之有效。
【發明內容】
[0004]本發明針對現有技術的不足，提供一株厭氧海藻酸分解菌Marinicatenaalginatilytica SH-52，其保藏于中國典型培養物保藏中心(地址:中國武漢，武漢大學)，保存日期為2013年3月10日，保藏編號為CCTCC NO:M2013073。
[0005]本發明另一目的是將厭氧海藻酸分解菌應用在生產海藻酸裂解酶中，且是利用海藻酸為碳源生產海藻酸裂解酶。
[0006]本發明中所述的厭氧海藻酸分解菌SH-52具有以下微生物學特征:
本菌株分離及培養的基礎培養基采用改良的海洋培養基，培養基組分如下=NH4SO4 5g，NaCl 25g, KH2PO4 0.75g, K2HPO4 1.5g, MgCl2.H2O 0.4g, CaCl2 0.13g，蛋白胨 0.5g，酵母膏
0.5g,海藻酸IOg,半胱氨酸鹽酸鹽0.75g,刃天青0.5mg,微量元素溶液SL-1O 1ml。各組分分別溶解后定容至1000ml，培養基加熱從藍色變為無色后，采用銅柱除氧系統除氧，分裝到充滿氮氣的亨特試管中，每管裝5ml，121°C滅菌后備用。
`[0007]微量元素溶液SL-1O 的組成成分為=HCl (22%; 7.7M) 10ml,FeCl2.4 H2O 0.200 g,MnCl2.4 H2O 0.100 g, CoCl2.6 H20 0.170 g, CaCl2.2 H2O 0.100 g, ZnCl2 0.100 g, CuCl2
0.020 g, H3BO3 0.010 g Na2MoO4.2 H2O 0.010 g, NiCl2.6 H2O 0.026 g, NaCl 1.000 g,Na2SeO3.5 H2O 0.020 g，首先將FeCl2.4 H2O溶解在HCl中，然后加入蒸餾水，再溶解其他鹽，定容到1000ml備用。
[0008]除溫度、pH實驗外的其他實驗均在30°C，pH值7.5的條件下培養接種量均為2%，所有實驗都設三組平行試驗。
[0009]1、形態學特征
本發明菌株SH-52是從廣東省汕頭市沿海沉積物中分離得到的，用改良的海洋培養基培養，菌落為白色，相差顯微鏡觀察，菌體為長桿狀。
[0010]2、生理生化特征
菌株SH-52為革蘭氏陰性專性厭氧菌，生長溫度范圍為20°C _45°C，最適生長溫度為300C ;生長的pH范圍為6-8.5，最適pH為7.5，生長的NaCl濃度范圍為0_9% (w/v),最適的生長鹽濃度為2% (w/v)。菌株SH-52可將硫和硫代硫酸鈉中的硫元素還原為H2S。
[0011]本發明中菌株SH-52碳源利用情況如下(見表1):
表1:本發明菌株的碳源利用結果
【權利要求】
1.一株厭氧海藻酸分解菌alginatiIytica SH-52,其在中國典型培養物保藏中心的保藏編號為CCTCC NO:M 2013073。
2.權利要求1所述厭氧海藻酸分解菌在生產海藻酸裂解酶中的應用。
【文檔編號】C12N9/88GK103525717SQ201310218590
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年6月4日 優先權日:2013年6月4日
【發明者】伊日布斯, 錢龍, 尚淑梅 申請人:昆明理工大學