專利名稱：一種檢測阪崎克羅諾桿菌的方法及其試劑盒和引物的制作方法
技術領域：
本發明涉及微生物檢測領域，具體涉及一種檢測阪崎克羅諾桿菌的方法及其試劑盒和引物。
背景技術：
阪崎克羅諾桿菌(Cronobacter sakazakii)隸屬于克羅諾桿菌屬(原阪崎腸桿菌)，是人和動物腸道內寄生的一種革蘭氏陰性無芽孢桿菌。經臨床研究發現阪崎克羅諾桿菌是克羅諾桿菌屬臨床感染病例中最常見的條件致病菌，阪崎克羅諾桿菌菌株能夠引起嬰兒致命的感染，致死率高達40%-80%。它通常能導致嬰兒嚴重的臨床癥狀，例如腦膿瘍，腦膜炎，壞死性小腸結腸炎和全身性敗血癥。曾經有在嬰兒配方粉中分離到阪崎克羅諾桿菌菌株的報道。阪崎克羅諾桿菌菌株是通過配方粉危害嬰幼兒健康的重要條件性致病菌。新生嬰兒或早產兒都存在通過食用污染有阪崎克羅諾桿菌進駐的嬰兒配方粉而感染阪崎克羅諾桿菌菌株的風險。在污染環節調查中發現，整個嬰幼兒配方粉生產工藝流程中，可檢測到阪崎克羅諾桿菌的污染點占到全部取樣點的31%。因此，對阪崎克羅諾桿菌菌株快速鑒定與鑒別是實現有效控制的基礎。該菌在1980年被首次命名和定義后，又于2008年由一個種被重新分為阪崎克羅諾桿菌屬(Cronobacter spp.),屬下分為5個新種(其中Cronobactersakazakii稱為新組合)、I個阪崎克羅諾桿菌基因種(Genomospeciese)和3個新亞種，至丨J2012年阪崎克羅諾桿菌屬經多序列比對發現，最終確定將該屬分為7個種。盡管該菌的分類和名稱已變，但目前的檢測仍然沿用程序式的阪崎腸桿菌標準檢測方法，以傳統生化反應進行鑒定，一般需要18-24h，而且無法區分為哪一種，這顯然已經不能滿足對阪崎克羅諾桿菌菌株檢測的需求。在鑒別方面，盡管已有擴增片段長度多態性分析(Amplifiedfragment length polymorphismas,AFLP)、16S rRNA全序列比較、DNA-DNA雜交實驗及多位點測序等多種可靠方法，·但這些根據遺傳特征的分析方法耗時長、工作量大。因此，本領域目前仍然缺乏對阪崎克羅諾桿菌菌株的高效率的鑒定與鑒別方法。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是為了克服現有的對阪崎克羅諾桿菌的檢測方法耗時長、操作繁瑣等缺陷，而提供一種新的檢測阪崎克羅諾桿菌的方法及其試劑盒和引物。以本發明的方法檢測阪崎克羅諾桿菌菌株，檢測時間短，成本低，檢測結果特異，結果判定簡單，在實際應用中非常方便。本發明提供的技術方案之一是:一種非疾病的診斷或治療目的的檢測阪崎克羅諾桿菌的方法，包括以下步驟:(I)提取待測樣品的基因組DNA ；(2)以步驟(I)所得的基因組DNA為模板，以序列如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的引物對進行PCR反應；和(3)檢測步驟(2)所得反應產物中498bp單一擴增產物的存在。
根據本發明，步驟(I)中，所述的提取待測樣品的基因組DNA的方法為本領域常規，如使用市售的各種基因組DNA提取試劑盒進行操作。步驟(2)中，所述的PCR反應為本領域常規，只要能夠擴增出阪崎克羅諾桿菌特異性的基因片段即可。較佳地，所述PCR反應的反應體系包括:1XPCR反應緩沖液，10-15mmol/L Mg2+，
0.2-0.3mmol/L dNTP，0.1-0.3 μ mol/L 的序列分別如 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.2 所示的引物，Taq酶0.01-0.1U/μ L，和DNA模板IO-1OOng/μ L。所述PCR反應的反應程序為:① 94 95°C，3 5min ,② 94 95°C，20 40s 60 62°C，30 40s 68 72°C，30 40s ;步驟②至④共30 35個循環； 68 72°C，7 IOmin 4 15°C保存。更佳地，所述PCR反應的反應體系包括:I X PCR反應緩沖液，12.5mmol/LMg2+，
0.25mmol/L dNTP，0.2 μ mol/L 的序列分別如 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.2 所示的引物，Taq酶0.04U/ μ L，和DNA模板50ng/ μ L。所述PCR反應的反應程序為:①94°C，5min.級94°C，30s ;@6(TC，30s ;@72°C，30s ;步驟②至④共 35 個循環； 72°C，IOmin ； 12°C保存。步驟(3)中，所述的檢測可以采用本領域常規的方法，優選為凝膠電泳檢測法，可以是瓊脂糖凝膠電泳，也可以是聚丙烯酰胺凝膠電泳。根據本領域常規可知，在本發明中，若步驟(2)所得的反應產物在498bp位置存在單一擴增產物，則說明待檢樣品中含有阪崎克羅諾桿菌菌株；若步驟(2)所得的反 應產物在498bp位置不存在單一擴增產物，則說明待檢樣品中不含有阪崎克羅諾桿菌菌株。本發明的方法尤其適用于檢測食品中的阪崎克羅諾桿菌菌株，特別是奶粉中的阪崎克羅諾桿菌菌株。本發明提供的技術方案之二是:一種檢測阪崎克羅諾桿菌的引物對，其包括序列如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的引物。本發明提供的技術方案之三是:一種檢測阪崎克羅諾桿菌的試劑盒，其包括前述引物對。本發明中，較佳地，所述的試劑盒還包括PCR緩沖液，Taq酶，dNTP溶液和Mg2+中的一種或多種。更佳地，所述的試劑盒還包括基因抽提試劑和/或陽性基因組DNA。在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實例。本發明所用試劑和原料均市售可得。本發明的積極進步效果在于:采用本發明的檢測方法及引物對和試劑盒檢測阪崎克羅諾桿菌菌株，檢測時間短、檢測成本低、檢測效率高；本發明的檢測方法具有單一特異性，檢測結果可靠，結果判定簡單。本發明為食品安全檢測技術領域提供了一種簡單快速靈敏的檢測阪崎克羅諾桿菌的方法及其試劑盒和引物，對我國的食品安全具有重要意義。
圖1為實施例1中PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后的實驗結果。泳道I 32為:阪崎克羅諾桿菌(ATCC29544)，鼠傷寒沙門氏菌(ATCC14023)，腸炎沙門氏菌(ATCC13311),陰溝腸桿菌(ATCC13047)，大腸桿菌(ATCC43889)，大腸桿菌(ATCC25922)，奇異變形桿菌(ATCC12453)，普通變形桿菌(ATCC33420)，枸櫞酸桿菌(ATCC8090)，肺炎克雷伯桿菌(ATCC27336)，肺炎克雷伯桿菌(ATCC46114)，宋志氏志賀氏菌(CMCC51334)，痢疾志賀氏菌(CMCC51335)，福氏志賀氏菌(ATCC51371 )，綠膿桿菌(CDCB32116)，蠟樣芽胞桿菌(ATCC1220)，氣味沙雷氏菌(ATCC33077)，粘質沙雷氏菌(ATCC14040)，惡臭假單胞菌(ATCC17485)，產堿假單胞菌(IQCC12604)，金黃色葡萄球菌(ATCC29213)，金黃色葡萄球菌(ATCC8095)，屎腸球菌(ATCC14025)，糞腸球菌(ATCC49452)，產氣腸桿菌(ATCC13048)，霍亂弧菌(SJTU32001 )，副溶血弧菌(ATCCl7802)，副溶血弧菌(ATCC33846)，創傷弧菌(ATCC27562)，單核增生李斯特菌(AB97021)，單核增生李斯特菌(ATCC13313)，無菌水，M為DNA Marker。圖2是實施列I中PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后的圖譜結果。泳道I 44依次為:阪崎克羅諾桿菌(ATCC29544)，阪崎克羅諾桿菌(BDCS001 )，阪崎克羅諾桿菌(BDCS002)，阪崎克羅諾桿菌(BDCS003)，阪崎克羅諾桿菌(BDCS004)，阪崎克羅諾桿菌(BDCS005)，阪崎克羅諾桿菌(BDCS006)，阪崎克羅諾桿菌(BDCS007)，阪崎克羅諾桿菌(BDCS008)，阪崎克羅諾桿菌(BDCS009)，阪崎克羅諾桿菌(BDCS010)，阪崎克羅諾桿菌(BDCS011)，阪崎克羅諾桿菌(BDCS012)，阪崎克羅諾桿菌(BDCS013)，阪崎克羅諾桿菌(BDCS014)，阪崎克羅諾桿菌(BDCS015)，阪崎克羅諾桿菌(BDCS016)，阪崎克羅諾桿菌(BDCS017)，阪崎克羅諾桿菌(BDCS018)，阪崎克羅諾桿菌(BDCS019)，阪崎克羅諾桿菌(BDCS020)，阪崎克羅諾桿菌(BDCS021)，阪崎克羅諾桿菌(BDCS022)，阪崎克羅諾桿菌(BDCS023)，阪崎克羅諾桿菌(BDCS024)，阪崎克羅諾桿菌(BDCS025)，阪崎克羅諾桿菌(BDCS026)，阪崎克羅諾桿菌(BDCS027)，阪崎克羅諾桿菌(BDCS028)，阪崎克羅諾桿菌(BDCS029)，阪崎克羅諾桿菌(BDCS030)，阪崎克羅諾桿菌(BDCS031 )，阪崎克羅諾桿菌(BDCS032)，阪崎克羅諾桿菌(BDCS033)，阪崎克羅諾桿菌(BDCS034)，阪崎克羅諾桿菌(BDCS035)，阪崎克羅諾桿菌(BDCS036)，阪崎克羅諾桿菌(BDCS037)，阪崎克羅諾桿菌(BDCS038)，阪崎克羅諾桿菌(BDCS039)，阪崎克羅諾桿菌(BDCS040)，阪崎克羅諾桿菌(BDCS041)，阪崎克羅諾桿菌(BDCS042)，阪崎克羅諾桿菌(BDCS043)，無菌水；M為DNAMarker0
圖3是實施例1中PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗證引物靈敏度的實驗圖譜結果。泳道 I 10 依次為:711.0ng/PCR，71.lng/PCR, 7.llng/PCR, 711pg/PCR, 71.lpg/PCR,7.llpg/PCR，711fg/PCR，71.lfg/PCR,7.llfg/PCR, ddH20, M 為 DNA Marker。圖4是實施例2中PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗證人工污染實驗的圖譜結
果O圖5是實施例3中PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗證實際樣品檢測的實驗圖譜結果。其中，泳道I 30依次為:樣品I 樣品30，泳道31 32:ddH20,阪崎克羅諾桿菌(ATCC29544)，M 為 DNA Marker。
具體實施例方式下面通過實施例的方式進一步說明本發明，但并不因此將本發明限制在所述的實施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，均按照常規方法和條件，或按照商品說明書選擇。
下述實施例中，所用引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。所用Marker購自天根生化科技(北京)有限公司，產品型號為Marker I (MD101)。實施例1對阪崎克羅諾桿菌菌株的檢測(I)采用本發明的引物對和檢測方法對阪崎克羅諾桿菌屬標準菌株ATCC29544進行PCR檢測。所用引物對的序列如下:SEN2-L:5’ -ACTGGCTTGGGGCTAATA-3’ (SEQ ID N0:1),SEN2-R:5’ -AGAGGCGGATAAATCTTGT-3’ (SEQ ID NO:2)。采用上述引物對，以阪崎克羅諾桿菌屬標準菌株ATCC29544的基因組DNA為模板，進行PCR反應體系和反應程序的建立和優化，經過單因素、多因素試驗和雜交試驗，從而建立了適用于檢測阪崎克羅諾桿菌菌株的反應體系及反應參數。所述的PCR 反應體系為:1XPCR 反應緩沖液，10-15mmol/L Mg2+，0.2-0.3mmol/L dNTP, 0.1-0.3μΜ 引物 SEN2-L，0.1_0.3 μ M 引物 SEN2-R，Taq 酶 0.05-0.lU/μ L, DNA 模板IO-1OOng/ μ L。所述的PCR擴增程序為:94_95°C預變性3_5min，之后開始以下循環，每個循環的程序為:94-95°C變性30-40s，60-62°C退火30_40s，68-72°C延伸30_40s ;循環共30-35個；循環結束后，68-72°C延伸7_10min，降溫至4_15°C，結束。結果表明，在所述的反應體系和反應程序范圍內都能得到單一的498bp的擴增產物。最優的PCR 反應體系為:I XPCR 反應緩沖液，12.5mmol/L Mg2+，0.25mmol/L dNTP,
0.2 μ M 引物 SEN2-L, 0.2 μ M 引物 SEN2-R, Taq 酶 0.04U/ μ L, DNA 模板 40ng/ μ L。最優的PCR擴增程序為:94°C預變性5min，之后開始以下循環，每個循環的程序為:94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸3·0s ;循環共35個；循環結束后，72°C延伸lOmin，降溫至12°C，結束。在最優的反應體系和反應程序下，其在498bp左右的擴增產物的產量最高，電泳條帶最明顯、最清晰。因此，本發明建立了最優的PCR檢測方法如下:先加入16.1yL無菌水到反應管中，再依次加入IOXPCR反應緩沖液2.5 μ L，25mmol/L的Mg2+2.0 μ L，2.5mmol/L的dNTP 1.0 μ L，5 μ M引物1.0 μ L，2.5U/ μ L Taq酶0.4 μ L，最后加模板溶液2 μ L，使得體系總體積為25 μ L，并以無菌水為模板作為反應的陰性對照。然后將反應管離心后，放入PCR反應儀中，按照以下PCR程序進行:在94°C預變性5min，接著作35個循環，每個循環的程序包括94°C變性30s，退火溫度63°C，退火時間為30s，然后在72°C延伸30s，循環結束后在72°C延伸lOmin，最后降溫至12°C，結束所有操作程序。(2)特異性評價試驗取阪崎克羅諾桿菌標準菌株I株及42株分離菌株(如表I所示，表中所示菌株均為本領域的技術人員可通過公開的渠道獲得的)，按照基因組DNA模板提取方法，分別提取基因組DNA。提取過程如下:將阪崎克羅諾桿菌標準菌株和分離菌株等43株菌株(如表I所示)分別接種至5mL的TSB液體培養基中，在37°C培養8h后，取ImL菌液，放入1.5mL離心管中；之后在5，OOOr/min離心lOmin，棄上清液。用無菌雙蒸水重新懸浮菌體，再在12，OOOr/min離心5min,收集菌體。離心洗漆后加入100 μ L無菌超純水,在沸水浴中煮IOmin,立即取出，在-20°C放置lOmin。在37°C解凍后，12，OOOr/min離心5min，取上清液放置_20°C備用。每株菌株的DNA溶液(DNA濃度50ng/ μ L )均取2 μ L作為PCR反應模板添加到PCR反應體系中進行擴增反應，反應采用前述最優的反應體系和最優的擴增程序。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，判斷在498bp位置是否存在單一擴增條帶，結果見表1，電泳結果見圖1和圖2。從表I中可知，除了阪崎克羅諾桿菌菌株的標準菌株和食品分離株外，其余陰性對照菌株均沒有特異擴增條帶。表I中，-:PCR結果為陰性；+:PCR結果為陽性。表I中阪崎克羅諾桿菌屬(Cronobacter spp)使用了 8株標準菌株,代表了該屬內所有種的典型標準菌株。屬內包括6個種(其中Cronobacter sakazakii稱為新組合)，即阪崎克羅諾桿菌ATCC29544，丙二酸鹽陽性阪崎克羅諾桿菌DSM18702，穆汀斯阪崎克羅諾桿菌ATCC51329，蘇黎世阪崎克羅諾桿菌DSM18703，阪崎克羅諾桿菌基因種1NCTC9529和都柏林阪崎克羅諾桿菌。其中都柏林阪崎克羅諾桿菌包括三個亞種，即都柏林阪崎克羅諾桿菌都柏林亞種DSM18705,都柏林阪崎克羅諾桿菌洛桑亞種DSM18706和都柏林阪崎克羅諾桿菌乳粉亞種DSM18707。阪崎克羅諾桿菌屬和腸桿菌屬的親緣關系最近，尤其和腸桿菌屬內的陰溝腸桿菌親緣關系最近。本次試驗共使用了腸桿菌屬標準菌株12株，志賀氏菌屬標準菌株3株，沙雷氏菌屬標準菌株2株，克雷伯屬標準菌株2株，葡萄球菌屬標準菌株2株，假單胞菌屬標準菌株3株，李斯特菌屬標準菌株2株，弧菌屬標準菌株3株及分離菌株I株。所使用的這些菌株都是食源性致病菌，而且絕大多數都屬于腸桿菌科的，它們和阪崎克羅諾桿菌菌株具有較近的親緣關系。如果這些菌株經本發明的引物通過PCR實驗后擴增不到特異的片段，那么其它的和阪崎阪崎克羅諾桿菌菌株親緣關系較遠的菌株更加難以擴增到目的片段(498bp)，因此經過這些親緣關系較近的菌株的系統生物學實驗驗證，充分保證了本發明所述檢測方法和引物的特異性。上述結果充分證明本發明的方法能擴增阪崎克羅諾桿菌屬內的任何菌株，而不會擴增除阪崎克羅諾桿菌屬以外的其它任何菌株。表1.特異性評價所用菌株及試驗結果
權利要求
1.一種非疾病的診斷或治療目的的檢測阪崎克羅諾桿菌的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)提取待測樣品的基因組DNA； (2)以步驟(I)所得的基因組DNA為模板，以序列如SEQID N0.1和SEQ ID N0.2所示的引物對進行PCR反應；和 (3)檢測步驟(2)所得反應產物中498bp單一擴增產物的存在。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR反應的反應體系包括:IXPCR反應緩沖液，10-15mmol/L Mg2+，0.2-0.3mmol/L dNTP，0.1-0.3 μ mol/L 的序列分別如 SEQ IDN0.1 和 SEQ ID N0.2 所示的引物，Taq 酶 0.01-0.lU/μ L，和 DNA 模板 IO-1OOng/μ L ;所述PCR反應的反應程序為:①94 95°C，3 5min !②94 95°C，20 40s 60 62°C，30 40s ;@68 72°C，30 40s ;步驟②至④共30 35個循環； 68 72°C，7 IOmin ；⑥4 15°C保存。
3.如權利要求1 所述的方法，其特征在于，所述PCR反應的反應體系包括:IXPCR反應緩沖液，12.5mmol/L Mg2+，0.25mmol/L dNTP，0.2 μ mol/L 的序列分別如 SEQ ID N0.1 和SEQ ID N0.2所示的引物，Taq酶0.04υ/μ L，和DNA模板50ng/μ L ;所述PCR反應的反應程序為:① 94°C，5min ;@94°C，30s ;@60°C，30s ;@72°C，30s ;步驟②至④共 35 個循環；(5)72°C, IOmin ； 12°C保存。
4.一種檢測阪崎克羅諾桿菌的引物對，其特征在于，其包括序列如SEQID N0.1和SEQID N0.2所示的引物。
5.一種檢測阪崎克羅諾桿菌的試劑盒，其特征在于，其包括如權利要求4所述的引物對。
6.如權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包括PCR緩沖液，Taq酶，dNTP溶液和Mg2+中的一種或多種。
7.如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包括基因抽提試劑和/或陽性基因組DNA。
全文摘要
本發明公開了一種檢測阪崎克羅諾桿菌的方法及其試劑盒和引物。所述的方法包括以下步驟(1)提取待測樣品的基因組DNA；(2)以步驟(1)所得的基因組DNA為模板，以序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物對進行PCR反應；和(3)檢測步驟(2)所得反應產物中498bp單一擴增產物的存在。所述引物包括序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物。所述試劑盒包括所述引物。本發明的方法檢測時間短，成本低，具有單一特異性，檢測結果可靠，結果判定簡單；為食品安全檢測技術領域提供了一種簡單快速靈敏的檢測阪崎克羅諾桿菌的方法，對我國的食品安全具有重要意義。
文檔編號C12R1/01GK103243171SQ20131020775
公開日2013年8月14日 申請日期2013年5月29日 優先權日2013年5月29日
發明者陳萬義, 任婧, 杭鋒, 穆海菠, 艾連中, 郭本恒 申請人:光明乳業股份有限公司