白血病融合基因的檢測方法及其引物、探針和基因芯片的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種多重RT-PCR聯合基因芯片檢測白血病融合基因的方法，步驟包括：1）抽提樣本細胞總RNA；2）RNA特異性逆轉錄為cDNA；3）多重RT-PCR擴增cDNA；4）用含檢測白血病融合基因的特異性探針的基因芯片檢測PCR擴增產物。本發明還公開了上述方法所用的探針、引物和基因芯片。本發明采用一管巢式多重PCR，擴增樣本中可能含有的特異性融合基因片段，再通過基因芯片雜交和芯片掃描圖像分析，獲得融合基因檢測結果，如此實現了15個白血病融合基因的27種及以上不同融合形式的特異性片段的同時檢測，從而大大提高了白血病融合基因的檢測效率，有利于大規模的臨床篩選。
【專利說明】白血病融合基因的檢測方法及其引物、探針和基因芯片
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因檢測【技術領域】，特別是涉及一種多重RT-PCR聯合基因芯片檢測白血病融合基因的方法，以及該方法所用的特異性探針、引物和基因芯片。
【背景技術】
[0002]白血病是造血系統的一種惡性腫瘤，年發病率約為2.76人/10萬人，占癌總發病數的5%，兒童及35歲以下成人惡性腫瘤死亡率排名第一位。白血病的發生發展是一個復雜的過程，往往涉及多個基因的改變，包括正常基因的突變或缺失、癌基因的異常擴增和表達以及多個基因的協同作用，加之基因本身多效性和免疫因素，最終決定腫瘤表型是否表達。
[0003]根據病程、臨床表現白血病可分為兩大類急性白血病和慢性白血病。根據母細胞來源又可將急性白血病分為急性淋巴性白血病(Acute Lymphoblastic Leukemia, ALL),急性髓性白血病(Acute Myelogenous Leukemia, AML);慢性白血病分為慢性淋巴性白血病(Chronic Lymphocytic Leukemia, CLL),慢性髓性白血病(Chronic MyelogenousLeukemia, CML)0其中以急性白血病多見(70% )，各年齡均可發生，而且男性多于女性。成年人中最常見的是AML和CML，兒童中比較常見的是ALL。
[0004]部分白血病的發生可能與染色體易位所形成的融合基因有關，如染色體易位 t(9;22) (q34;qlI)BCR-ABL pl90、t(4;11) (q21;q23)MLL-AF4、t(12;21) (pl3;q22)TEL-AMLl、t(l; 19) (q23; pl3) E2A-PBX1 可能會與 ALL 相關；t(8;21) (q22; q22) AML1-ET0、inv(16)(pl3;q22)/t(16;16)(pl3;q22)CBFB-MYH11、 t(15;17)(q22;ql2)PML-RARA、t(9;ll) (p22;q23)MLL-AF9及其他一些llq23MLL基因重排可能會與AML相關。染色體異位形成的融合基因的檢測，結合臨床細胞形態學檢查、骨髓象檢查等，可進行白血病的診斷、預后和治療方面的分析。
[0005]檢測白血病染色體異常的方法主要有常規G顯帶染色體核型分析、熒光原位雜交技術(Fluorescence in situ hybridizat1n, FISH)和 PCR 技術。常規 G 顯帶染色體核型分析依舊是染色體遺傳病檢查的重要手段，它能夠可靠識別染色體數目和結構的變化，盡管在靈敏度和操作性上有局限，比如白血病細胞分裂指數低、染色體形態短小、常顯帶不清、隱匿型易位，使得一些結構復雜或細微的改變難以準確識別。FISH是利用熒光標記探針結合特定染色體序列，從而得以在顯微鏡下分析。通過探針熒光可以識別顯微甚至亞顯微的隱匿型結構異常和染色體數目變化。FISH相對于核型分析更能直接觀察染色體異常，而且靈敏度更高，適用于分裂間期中期細胞，但其僅能對已知探針的基因位點進行分析。PCR檢測急性白血病相當普遍，不僅對白血病的診斷有用，而且更適用于對白血病微小殘留病灶的檢測。這些方法都具有各自的優缺點，但是都不適合于多樣本的白血病融合基因篩查。
[0006] 因此，出現了一些新型檢測技術，尤其是基因芯片技術。基因芯片技術檢測的最大優點是信息量大、操作自動化、智能化，能快速靈敏地檢測出所需基因，不僅操作簡便，耗費也不高，因此可能是一種很好的檢測方法，應用于常規臨床評估和疾病控制方面有很大的前景。國外有采用基因芯片的方法檢測白血病融合基因的報道，而國內尚未有相關報道。但是國外主要的幾款芯片局限性也相當明顯，僅針對少數幾種白血病類型的其中一種融合形式，并且涉及PCR部分都是采用多管巢式PCR，這不利于稍具規模的臨床篩選。
【發明內容】
[0007]本發明要解決的技術問題之一是提供一種多重RT-PCR聯合基因芯片檢測白血病融合基因的方法，它可以提高白血病融合基因的檢測效率。
[0008]為解決上述技術問題，本發明的多重RT-PCR聯合基因芯片檢測白血病融合基因的方法，步驟包括:
[0009]I)抽提樣本細胞總RNA ；
[0010]2)將步驟I)得到的RNA特異性逆轉錄為cDNA ；
[0011]3)以cDNA為模板，進行多重RT-PCR擴增反應；
[0012]4)用含有一條以上檢測白血病融合基因的特異性探針的基因芯片檢測PCR擴增產物中是否含有相應的白血病融合基因片段。
[0013]本發明要解決的技術問題之二是提供用于檢測白血病融合基因的特異性探針，該探針的序列包括SEQ ID NO: 31~80所示的序列或其互補鏈,且探針5’端修飾有氨基。
[0014]本發明要解決的技術問題之三是提供用于檢測白血病融合基因的基因芯片，該基因芯片含有一條以上上述檢測白血病融合基因的特異性探針。
[0015]本發明要解決的技術問題之四是提供用于上述多重RT-PCR聯合基因芯片檢測白血病融合基因方法的RNA逆轉錄為cDNA的引物組合，所述引物組合具有如SEQ ID No:1~16所示的序列或其互補鏈。
[0016]本發明要解決的技術問題之五是提供多重RT-PCR擴增cDNA的引物組合，所述引物組合具有如SEQ ID No: 17~30所示的序列或其互補鏈。
[0017]本發明采用一管巢式多重PCR，擴增樣本中可能含有的特異性融合基因片段，實現了 15個白血病融合基因的27種及以上不同融合形式的特異性片段的同時檢測，包括:t(8;21) (q22;q22)AMLl-ET0, inv(16) (pl3q22)/t (16; 16) (pl3; q22) CBFB—MYH11，t(15; 17)(q22;q2I)PML-RARA, t(ll;17)(q23;ql2)PLZF-RARA, t(5;17)(q35;ql2)NPM1-RARA,t(9;11) (p22;q23)MLL-AF9, t(6;11)(q27;q23)MLL_AF6，t(ll;19) (q23;pl3.3)MLL_ENL，t (11 ; 19) (q23;pl3.1)MLL_ELL，t(10; 11) (pl2 ; q23) MLL-AF10, t(12;21) (pl3; q22)TEL-AMLl，t(l;19) (q23;pl3)E2A-PBX1，t(4;11) (q21;q23)MLL-AF4, del(I) (p32;p32)SIL-TALl，t (9; 22) (q34, qlI) BCR-ABL pl90，p210 和p230，后續借助基因芯片雜交和芯片掃描圖像分析，就可以獲得融合基因檢測結果，從而大大提高了白血病融合基因的檢測效率，可用于大規模的臨床篩選。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1為基因芯片示意圖，其中A為芯片各探針的位置圖，B為整體芯片示意圖。
[0019]圖2為K-562細胞系的芯片雜交結果。其中A為K-562芯片雜交圖；B為芯片上各探針的信號值分布圖，虛線為閾值(背景信號和陰性信號平均值+3SD)。
[0020]圖3為多重RT-PCR特異性凝膠電泳結果。其中，M泳道為DL2000DNA Marker ;泳道1-6為細胞系，分別為KASUM1-1、NB-4、ME-1、THP-1、K-562、REH ;泳道7-14為樣本，分別為 PML-RARA S-form、MLL-AF4、MLL-ENL, MLL-ELL, MLL-AF6、MLL-AFlO, E2A-PBX1、BCR-ABLP190 ;泳道15為陰性對照；泳道16為H20。
[0021]圖4為KASUM1-1細胞系不同稀釋梯度的凝膠電泳圖和芯片雜交結果。其中A為KASUM1-1不同稀釋梯度的凝膠電泳結果；B為KASUM1-1各稀釋梯度對應的芯片雜交圖；C為KASUM1-1稀釋梯度10_3和10_4對應各探針的信號值分布圖，虛線為閾值(背景信號和陰性信號平均值+3SD)。
[0022]圖5為用本發明的多重RT-PCR聯合基因芯片檢測部分白血病臨床樣本的結果。
【具體實施方式】
[0023]下面通過具體實施例，并結合附圖，對本發明作進一步詳細說明。下列實施例旨在舉例說明而不是限制本發明。
[0024]實施例1多重RT-PCR聯合基因芯片檢測K-562細胞系的白血病融合基因
[0025]1.細胞總RNA抽提
[0026]取K-562細胞系，采用Trizol的方法,按照Invitrogen公司Trizol說明書提取細胞總RNA，提取的具體步驟如下:
[0027](I)取保存在Trizol里的標本400 μ 1，加入400 μ I氯仿，混勻，室溫放置5分鐘；
[0028](2) 15000rpm離心10分鐘，離心后吸取無色上清液；
[0029](3)在上述上清中加入等體積預冷的異丙醇，顛倒混勻后室溫放置10分鐘；
[0030] (4) 15000rpm離心10分鐘，吸棄上清；
[0031](5)在上述離心管中，加入300μ I預冷的70%乙醇，15000rpm離心5分鐘，吸棄上清；室溫放置10分鐘，使乙醇揮發；
[0032](6)加入30-60 μ I DEPC (焦碳酸二乙酯)水混勻溶解，定量，RNA的0D26(l/0D28。在
1.8 ~2.0 ;
[0033](7)取2 μ g總RNA，用于下一步的特異性逆轉錄反應。
[0034]2.RNA特異性逆轉錄為cDNA
[0035]逆轉錄反應體系為25 μ 1，包括:2μ g總RNA、2.5~3pmol各種特異性逆轉錄引物(見表1，由上海捷瑞生物工程有限公司合成)、200U M-MLV逆轉錄酶、25U RNA酶抑制劑、ImMdNTPUOmM DTT (二硫蘇糖醇)、50mM Tris-HCl (ρΗ8.3)、75mM KCl、3mM MgCl20
[0036]反應條件:RNA與逆轉錄引物先于70°C反應5分鐘，置于冰上，混入其他反應成分于42°C孵育I小時。
[0037]表1逆轉錄引物序列
[0038]
【權利要求】
1.多重RT-PCR聯合基因芯片檢測白血病融合基因的方法，其特征在于，步驟包括: 1)抽提樣本細胞總RNA； 2)將步驟I)得到的RNA特異性逆轉錄為cDNA； 3)以cDNA為模板，進行多重RT-PCR擴增反應； 4)用含有一條以上檢測白血病融合基因的特異性探針的基因芯片檢測PCR擴增產物中是否含有相應的白血病融合基因片段。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)，RNA逆轉錄為cDNA的引物組合具有如SEQ ID No:1~16所示的序列或其互補鏈。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)，進行兩輪巢式多重RT-PCR擴增反應。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟3)，第一輪PCR體系20μ 1，包括:.1μ I cDNA、3pmol 各種 PCR 弓丨物、4pmol SP6、llmM Tris_HCl、55mM KCl、1.5mM MgCl2,15%DMS0、0.4mM dNTP 和 1.25U ExTaq HS 酶；第二輪 PCR 體系 20 μ 1，包括:1 μ I 第一輪 PCR產物、1mM Tris-HCl、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.2mM dNTP、2pmol T7和2pmol標記生物素的SP6和IU ExTaq HS酶；第一輪PCR程序包括25圈循環，第二輪PCR程序包括30圈循環，每圈循環包括:95°C變性30秒，55°C退火40秒，72°C延伸I分鐘；循環結束后，均在72°C延伸7分鐘。
5.根據權利要求1或3或4所述的方法，其特征在于，步驟3)，PCR引物組合具有如SEQID No: 17~30所示的序列或其互補鏈。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)，所述特異性探針的序列包括SEQID NO:31~80所示的序列或其互補鏈，探針5’端修飾有氨基。
7.用于檢測白血病融合基因的特異性探針，其特征在于，探針的序列包括SEQIDNO: 31~80所示的序列或其互補鏈，且探針5’端修飾有氨基。
8.用于檢測白血病融合基因的基因芯片，其特征在于，含有一條以上權利要求7所述的探針。
9.RNA逆轉錄為cDNA的引物組合，其特征在于，具有如SEQ ID No:l~16所示的序列或其互補鏈。
10. 多重RT-PCR擴增cDNA的引物組合，其特征在于，具有如SEQID No: 17~30所示的序列或其互補鏈。
【文檔編號】C12Q1/68GK104178557SQ201310204497
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2013年5月28日 優先權日:2013年5月28日
【發明者】熊斐斐, 張春秀, 張慶華, 熊慧 申請人:上海生物芯片有限公司, 上海華盈生物醫藥科技有限公司