專利名稱：產右旋糖酐蔗糖酶優良菌種的選育方法
技術領域：
本發明屬于生物工程領域，尤其涉及一種產右旋糖酐蔗糖酶優良菌種的選育方法。
背景技術：
腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides, L.M.)是用于生產右旋糖酐最常見的菌種，其分泌的右旋糖酐鹿糖酶(Dextransucrase, DSase, EC2.4.1.5)是一種糖基轉移酶，可以催化D-吡喃葡萄糖基從蔗糖轉移到右旋糖酐鏈上，從而使產物的分子量不斷增力口。在酶法制備右旋糖酐的研究中，高產酶菌株的獲得是整個發酵過程的基礎與關鍵。然而，從自然界篩選得到的腸膜明串珠菌(野生菌)往往存在產酶少、酶活力低的缺陷，為獲得高產右旋糖酐酶的菌株，需要運用各種技術對原始菌株進行改造，以提高其產酶性能。目前國內幾大菌種保藏中心所藏的腸膜明串珠菌在43號液體培養基中產酶活力僅為I 2U/
mLo國內對腸膜明串珠菌的改造或誘變的研究并不多，也有研究者通過基因工程技術構建了產右旋糖酐蔗糖酶的工程菌且其產酶活力得到了大幅提高，但基因工程技術成本較高，對操作人員要求也高。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種成本低廉、操作簡單的產右旋糖酐蔗糖酶優良菌種的選育方法，以提高腸膜明串珠菌的產酶能力。為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案:產右旋糖酐蔗糖酶優良菌種的選育方法，包括以下步驟: (I)腸膜明串珠菌的葡萄糖耐受性培養；(2)腸膜明串珠菌的復壯培養；( 3 )腸膜明串珠菌的產酶培養。葡萄糖耐受性培養是原始腸膜明串珠菌取種，接種于以葡萄糖為唯一碳源的培養基中培養48 60h。葡萄糖耐受性培養的培養基配方為:葡萄糖100 120g/L，KH2PO40.3 0.35g/L，Na2HPO4L 4 1.5g/L，蛋白胨1.5 2g/L，酵母膏8 10g/L，瓊脂16 20g/L，蒸餾水1L，ρΗ7.0 7.2。復壯培養是選取耐受性培養后茁壯的單菌落接種于43號培養基進行培養24 48h。復壯培養的培養基(43號培養基)配方為:蔗糖130g/L，KH2PO40.3g/L，Na2HPO4L 4g/L，蛋白胨 2g/L，瓊脂 20g/L，蒸餾水 1L，ρΗ7.0 7.2。產酶培養經歷種子培養基培養和產酶培養基培養兩個階段；選取復壯培養后茁壯的單菌落接種于種子培養基，待菌種繁殖至對數期時，以2%ν/ν的接種量接種于產酶培養基，培養21 25h后對培養液以12000r/min、4°C、30min的條件進行離心去除菌體，收集上清液即為右旋糖酐蔗糖酶酶液。種子培養基的配方為:蔗糖50 60g/L，KH2P040.3 0.35g/L，Na2HPO4L 4 1.5g/L，蛋白胨2 2.5g/L，酵母膏8 10g/L，蒸餾水1L，pH6.8 7.0 ;產酶培養基的配方為:蔗糖 50 60g/L, KH2PO40.3 0.35g/L，Na2HPO4L 4 1.5g/L，蛋白胨 1.5 2g/L，酵母膏8 10g/L，牛肉膏8 10g/L，蒸餾水1L, ρΗ6.8 7.0。上述固體培養基培養菌種的條件為25±3°C ;液體培養基培養菌種的條件為25 ± 3°C、150 土 50r/min，裝液量為所盛容器標準容量的20%。針對目前產右旋糖酐蔗糖酶菌種產酶性能、改造成本高等問題，發明人利用微生物與環境“和諧相處”、“趨利避害”的生物性能，建立了本發明優良菌種的選育方法:先對腸膜明串珠菌進行葡萄糖耐受性培養得到葡萄糖耐受菌，選取茁壯單菌落用高含蔗糖的43號培養基進行復壯培養，再經營養更為豐富的種子培養基、發酵培養基的擴大培養，獲得高酶活力的右旋糖酐蔗糖酶酶液，其酶活力可達8.4U/mL,比原腸膜明串珠菌所產酶的酶活力高出120%以上，為后續藥用右旋糖酐的生產提供了高效的酶催化劑。本發明成本低廉、操作簡單，所得菌種的產酶能力可基本滿足工業化生產需要。
具體實施例方式以下實施例使用固體培養基(平板或斜面)培養菌種的條件為25±3°C;液體培養基培養菌種的條件為25±3°C、150±50r/min，裝液量為所盛容器標準容量的20%。實施例1從斜面保存的原始腸膜明串珠菌(中國工業微生物菌種保藏管理中心，保藏號21724，酶活力約在I 2.5U/mL)取種，接種于葡萄糖耐受性培養基平板，置于25°C培養箱中培養60h ;從耐受 性培養基平板上選取耐受性培養后茁壯的單菌落接種于43號培養基平板，置于25°C培養箱中進行復壯培養36h ;選取復壯培養后茁壯的單菌落接種于種子培養基，待菌種繁殖至對數期時(發酵液在600nm處的吸光值為0.4左右)，以2% (v/v)的接種量接種于產酶培養基，培養21h后對培養液以12000r/min、4°C、30min的條件進行離心去除菌體，收集上清液即為右旋糖酐蔗糖酶酶液。酶液經DNS法測其酶活力為8.4U/mL。本例培養基配方如下:葡萄糖耐受性培養的培養基:葡萄糖100g/L，KH2PO40.3g/L，Na2HPO4L 4g/L，蛋白胨2g/L，酵母膏10g/L，瓊脂20g/L，蒸餾水1L，ρΗ7.0。復壯培養的培養基:蔗糖130g/L，KH2PO40.3g/L，Na2HPO4L 4g/L，蛋白胨2g/L，瓊脂20g/L，蒸餾水 lL，pH7.0。種子培養基:蔗糖50g/L，KH2PO40.3g/L，Na2HPO4L 4g/L，蛋白胨 2g/L，酵母膏 8g/L,蒸懼水 1L, pH6.8。產酶培養基:蔗糖50g/L，KH2PO40.3g/L，Na2HPO4L 4g/L，蛋白胨 2g/L，酵母膏 8g/L，牛肉膏8g/L，蒸餾水lL，pH6.8。實施例2從斜面保存的原始腸膜明串珠菌(中國工業微生物菌種保藏管理中心，保藏號21724，酶活力約在I 2.5U/mL)取種，接種于葡萄糖耐受性培養基平板，置于26°C培養箱中培養48h ;從耐受性培養基平板上選取耐受性培養后茁壯的單菌落接種于43號培養基平板，置于25°C培養箱中進行復壯培養38h ;選取復壯培養后茁壯的單菌落接種于種子培養基，待菌種繁殖至對數期時(發酵液在600nm處的吸光值為0.4左右)，以2% (v/v)的接種量接種于產酶培養基，培養21h后對培養液以12000r/min、4°C、30min的條件進行離心去除菌體，收集上清液即為右旋糖酐蔗糖酶酶液。酶液經DNS法測其酶活力為8.0U/mL。本例培養基配方如下:葡萄糖耐受性培養的培養基:葡萄糖120g/L，KH2PO40.35g/L，Na2HPO4L 45g/L，蛋白胨1.8g/L，酵母膏8g/L，瓊脂18g/L，蒸餾水1L，pH7.2。復壯培養的培養基:蔗糖130g/L，KH2PO40.3g/L，Na2HPO4L 4g/L，蛋白胨2g/L，瓊脂20g/L，蒸餾水 1L，ρΗ7.2。種子培養基:蔗糖60g/L，KH2PO40.35g/L，Na2HPO4L 5g/L，蛋白胨 2.5g/L，酵母膏10g/L,蒸懼水 1L, pH6.8。產酶培養基:蔗糖60g/L，KH2PO40.35g/L，Na2HPO4L 45g/L，蛋白胨 1.5g/L，酵母膏10g/L，牛肉膏 10g/L ，蒸餾水 lL，pH7.0。
權利要求
1.一種產右旋糖酐蔗糖酶優良菌種的選育方法，其特征在于包括以下步驟: (1)腸膜明串珠菌的葡萄糖耐受性培養； (2)腸膜明串珠菌的復壯培養； (3)腸膜明串珠菌的產酶培養。
2.根據權利要求1所述的產右旋糖酐蔗糖酶優良菌種的選育方法，其特征在于:所述葡萄糖耐受性培養是原始腸膜明串珠菌取種，接種于以葡萄糖為唯一碳源的培養基中培養48 60ho
3.根據權利要求2所述的產右旋糖酐蔗糖酶優良菌種的選育方法，其特征在于葡萄糖耐受性培養的培養基配方為:葡萄糖100 120g/L, KH2PO40.3 0.35g/L，Na2HPO4L 4 1.5g/L，蛋白胨1.5 2g/L，酵母膏8 10g/L，瓊脂16 20g/L，蒸餾水lL，pH7.0 7.2。
4.根據權利要求1所述的產右旋糖酐蔗糖酶優良菌種的選育方法，其特征在于:所述復壯培養是選取耐受性培養后茁壯的單菌落接種于43號培養基進行培養24 48h。
5.根據權利要求4所述的產右旋糖酐蔗糖酶優良菌種的選育方法，其特征在于復壯培養的培養基配方 為:蔗糖130g/L，KH2PO40.3g/L，Na2HPO4L 4g/L，蛋白胨2g/L，瓊脂20g/L，蒸餾水1L，pH7.0 7.2。
6.根據權利要求1所述的產右旋糖酐蔗糖酶優良菌種的選育方法，其特征在于:所述產酶培養經歷種子培養基培養和產酶培養基培養兩個階段；選取復壯培養后茁壯的單菌落接種于種子培養基，待菌種繁殖至對數期時，以2%v/v的接種量接種于產酶培養基，培養21 25h后對培養液以12000r/min、4°C、30min的條件進行離心去除菌體，收集上清液即為右旋糖酐蔗糖酶酶液。
7.根據權利要求6所述的產右旋糖酐蔗糖酶優良菌種的選育方法，其特征在于種子培養基的配方為:蔗糖50 60g/L，KH2PO40.3 0.35g/L，Na2HPO4L 4 1.5g/L，蛋白胨2 2.5g/L，酵母膏8 10g/L,蒸懼水lL,pH6.8 7.0 ;產酶培養基的配方為:鹿糖50 60g/L, KH2PO40.3 0.35g/L, Na2HPO4L 4 1.5g/L，蛋白胨 1.5 2g/L，酵母膏 8 10g/L，牛肉膏8 10g/L,蒸餾水1L, ρΗ6.8 7.0。
8.根據權利要求1至7任一所述的產右旋糖酐蔗糖酶優良菌種的選育方法，其特征在于:固體培養基培養菌種的條件為25±3°C ;液體培養基培養菌種的條件為25±3°C、150±50r/min，裝液量為所盛容器標準容量的20%。
全文摘要
本發明公開了一種產右旋糖酐蔗糖酶優良菌種的選育方法，先對腸膜明串珠菌進行葡萄糖耐受性培養得到葡萄糖耐受菌，選取茁壯單菌落用高含蔗糖的43號培養基進行復壯培養，再經營養更為豐富的種子培養基、發酵培養基的擴大培養，獲得高酶活力的右旋糖酐蔗糖酶酶液，其酶活力可達8.4U/mL，比原腸膜明串珠菌所產酶的酶活力高出120%以上，為后續藥用右旋糖酐的生產提供了高效的酶催化劑。本發明成本低廉、操作簡單，所得菌種的產酶能力可基本滿足工業化生產需要。
文檔編號C12N1/20GK103243052SQ201310192348
公開日2013年8月14日 申請日期2013年5月22日 優先權日2013年5月22日
發明者陳山, 浦媛媛, 鄒青松, 王曉, 王清, 劉玫, 張義平, 姚曉麥, 黃磊 申請人:廣西大學