專利名稱：Dna分子、擴增該dna分子的引物組、包含該引物組的試劑盒及其使用方法
技術領域：
本發明涉及醫藥技術領域，尤其涉及DNA分子、擴增該DNA分子的引物組、包含該引物組的試劑盒及其使用方法。
背景技術：
宮頸癌是全球婦女中僅次于乳腺癌和結直腸癌的第3個常見的惡性腫瘤，在發展中國家是僅次于乳腺癌居第2位常見的惡性腫瘤，是最常見的女性生殖道惡性腫瘤。2008年全球新發宮頸癌病例52.98萬，死亡病例25.51萬人，其中85%新發病例在發展中國家。
宮頸癌的臨床癥狀的輕重與病情早晚有關，宮頸上皮內瘤變及鏡下早期浸潤癌一般無癥狀，多在普查中發現。Ib期和以后各期最早出現的癥狀主要有陰道出血和陰道排液。若癌瘤侵犯盆腔結締組織，壓迫膀胱、直腸和坐骨神經以及影響淋巴和靜脈回流時，可出現尿頻、尿急、肛門墜脹、便秘、下腹痛、坐骨神經痛、下肢腫痛等。癌瘤壓迫或侵犯輸尿管，可出現腎盂積水、尿毒癥。終末期因長期消耗常出現惡液質。
宮頸癌提早發現和治療就會有好的效果。一期的宮頸癌五年的生存率可以達到93%，二期大約為80%，但如果到了三期和四期，特別是四期就只有20%左右了。一期或者二期的患者可以做手術，可到了三期后只能采用放療或放化療，一期做手術患者可以有90%的治愈率，有些甚至達到98%。可見，宮頸癌的早期治療有賴于早期診斷。但是，早期子宮頸癌往往無癥狀，體征也不明顯，確診需進行三階梯診斷。第一步，宮頸細胞學檢查，即陰道脫落細胞涂片檢查，這是目前篩選和早期發現宮頸癌的主要方法。第二步進行陰道鏡檢查，對宮頸刮片細胞學可疑或陽性而肉眼未見明顯癌灶者，陰道鏡可將病變放大6 40倍，在強光源下直接觀察宮頸上皮及血管的細微形態變化。第三步是宮頸和頸管活組織檢查，這是確診宮頸癌前病變和宮頸癌的最可靠和不可缺少的方法，當宮頸刮片細胞學檢查可疑或陽性而活檢為陰性時，應搔刮宮頸管送檢，如宮頸刮片發現腺癌細胞，應行分段診刮術，以明確腺癌是來自子宮內膜還是宮頸管。可見，現有的臨床診斷依賴傳統的病理切片上形態學的改變。宮頸癌在出現典型癥狀和體征后，一般已為浸潤癌。而早期宮頸癌往往與正常組織難以區分，體征也不明顯，給臨床診斷造成很大困難。因此，急需研究應用于宮頸癌早期的新診斷方法。 發明內容
有鑒于此，本發明要解決的技術問題在于提供一種DNA分子、擴增該DNA分子的引物組、包含該引物組的試劑盒及其使用方法，本發明提供的DNA分子為人類DDXll的突變基因。本發明提供的引物組，可用于擴增包括突變點的片段，根據對擴增產物的測序結果可判斷待測樣品是否攜帶突變，從而預測患者是否有患宮頸癌的風險，實現宮頸癌的早期診斷。
本發明提供的DNA分子為在Genbank登錄號為NM_004399的核苷酸序列的第1102位核苷酸和第2183位核苷酸發生突變，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2或SEQID NO:3 所示。Genbank登錄號為NM_004399的核苷酸序列，為正常人類DDXlI的基因序列。DDXll是人體內的一種解旋酶，英文名稱為:Homo sapiens DEAD/H(Asp-Glu-Ala-Asp/His)boxhelicasell，簡稱DDX11。本發明通過對宮頸癌標本進行全基因組外顯子測序，并利用癌旁組織作為對照，發現宮頸癌標本中DDXll基因發生突變。宮頸癌標本中的DDXll基因發生突變的位點有兩個，第1102位核苷酸由G突變為A，第2183位核苷酸由G突變為A。核苷酸的突變會使密碼子發生變化，但是由于密碼子存在簡并性，并非所有核苷酸的突變都是非同義突變，而本發明提供的DNA分子核苷酸序列中的兩個位點的突變皆為非同義突變，導致了氨基酸序列的變化。其中第1102位核苷酸的突變，使氨基酸序列中相應氨基酸由脯氨酸突變為絲氨酸；第2183位核苷酸的突變，使氨基酸序列中相應氨基酸由精氨酸突變為組氨酸。本發明提供的DNA分子中，如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA分子為Genbank登錄號為NM_004399的核苷酸序列中第1102位核苷酸由G突變為A得到的序列JnSEQ IDNO:2所示核苷酸序列的DNA分子為Genbank登錄號為NM_004399的核苷酸序列中第2183位核苷酸由G突變為A得到的序列JnSEQ ID NO: 2所示核苷酸序列的DNA分子為Genbank登錄號為NM_004399的核苷酸序列中第1102位核苷酸由G突變為A且第2183位核苷酸由G突變為A得到的序列。這兩個位點中任一位點發生突變，都有可能增加患宮頸癌的風險。因此，本發明提供了本發明提供的DNA分子在宮頸癌診斷中的應用。本發明提供了擴增本發明提供的DNA分子的引物組，由具有SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的下游引物組成。本發明還提供了具有SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的下游 引物的引物組在檢測Genbank登錄號為NM_004399的核苷酸序列的第1102位核苷酸突變中的應用。本發明提供了擴增本發明提供的DNA分子的引物組，由具有SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的下游引物組成。本發明還提供了具有SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的下游引物的引物組在檢測Genbank登錄號為NM_004399的核苷酸序列的第2183位核苷酸突變中的應用。采用本發明提供的引物組，通過PCR的方式，可擴增得到包括突變點的片段，根據對擴增產物的測序結果可判斷待測樣品是否攜帶突變，從而預測患者是否有患宮頸癌的風險，實現宮頸癌的早期診斷。由于組織細胞形態學的改變是由于基因突變所致，本發明提供的引物用于宮頸癌的早期診斷與傳統技術相比，具有更高的靈敏度和更高的準確度。本發明提供了一種試劑盒，其中包括:第一引物組和第二引物組；其中，第一引物組中上游引物具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列，下游引物具有SEQ ID NO: 3所示核苷酸序列；第二引物組中上游引物具有SEQ ID NO:4所示核苷酸序列，下游引物具有SEQ IDNO: 5所示核苷酸序列。作為優選，本發明提供的試劑盒中還包括Taq酶。
本發明提供的試劑盒的使用方法包括如下步驟:
步驟1:提取宮頸組織全基因組DNA ；
步驟2:以宮頸組織全基因組DNA為模板，以第一引物組擴增獲得第一擴增產物，以第二引物組為引物擴增獲得第二擴增產物，第一、第二擴增產物為Genbank登錄號為NM_004399的核苷酸序列中的片段；
步驟3:取第一、二擴增產物經測序分析，第一擴增產物中Genbank登錄號為NM_004399的核苷酸序列第1102位核苷酸為A和/或第二擴增產物中Genbank登錄號為NM_004399的核苷酸序列第2183位核苷酸為A，則攜帶突變；第一擴增產物中Genbank登錄號為NM_004399的核苷酸序列第1102位核苷酸為G，且第二擴增產物中Genbank登錄號為NM_004399的核苷酸序列第2183位核苷酸為G，則不攜帶突變。
由于Genbank登錄號為NM_004399的核苷酸序列中第1102位和第2183位上的兩個突變點中任一位點發生突變，都有可能增加患宮頸癌的風險。因此，本發明提供了本發明提供的DNA分子在宮頸癌診斷中的應用。
本發明提供的試劑盒的使用方法中，提取宮頸癌標本全基因組DNA、擴增、測序步驟皆可采用現有技術中的常規方法。
其中擴增的程序為:
權利要求
1.一種DNA分子，其特征在于，為在Genbank登錄號為NM_004399的核苷酸序列的第1102位核苷酸和第2183位核苷酸發生突變，其核苷酸序列如SEQ ID NOiUSEQ ID N0:2或SEQ ID NO:3 所示。
2.如權利要求1所述的DNA分子在宮頸癌診斷中的應用。
3.—種擴增如權利要求1所述DNA分子的引物對，其特征在于，由具有SEQ ID N0:4所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的下游引物組成。
4.如權利要求3所述的引物對在檢測Genbank登錄號為NM_004399的核苷酸序列的第1102位核苷酸突變中的應用。
5.—種擴增如權利要求1所述DNA分子的引物對，其特征在于，由具有SEQ ID N0:6所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的下游引物組成。
6.如權利要求5所述的引物對在檢測Genbank登錄號為NM_004399的核苷酸序列的第2183位核苷酸突變中的應用。
7.一種試劑盒，其特征在于，包括:第一引物對和第二引物對； 其中，第一引物組中上游引物具有SEQ ID NO:4所示核苷酸序列，下游引物具有SEQ IDNO:5所示核苷酸序列； 第二引物組中上游引物具有SEQ ID NO:6所示核苷酸序列，下游引物具有SEQ ID NO:7所示核苷酸序列 。
8.根據權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，還包括Taq酶。
9.如權利要求7或8所述試劑盒的使用方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟1:提取宮頸組織全基因組DNA ； 步驟2:以宮頸組織全基因組DNA為模板，以所述第一引物組擴增獲得第一擴增產物，以所述第二引物組為引物擴增獲得第二擴增產物，所述第一、第二擴增產物為Genbank登錄號為NM_004399的核苷酸序列中的片段； 步驟3:取第一、二擴增產物經測序分析，所述第一擴增產物中Genbank登錄號為NM_004399的核苷酸序列第1102位核苷酸為A和/或所述第二擴增產物中Genbank登錄號為NM_004399的核苷酸序列第2183位核苷酸為A，則攜帶突變；所述第一擴增產物中Genbank登錄號為NM_004399的核苷酸序列第1102位核苷酸為G，且所述第二擴增產物中Genbank登錄號為NM_004399的核苷酸序列第2183位核苷酸為G，則不攜帶突變。
全文摘要
本發明涉及醫藥技術領域，尤其涉及DNA分子、擴增該DNA分子的引物組、包含該引物組的試劑盒及其使用方法。本發明提供的DNA分子為人類DDX11的突變基因。采用本發明提供的引物組，通過PCR的方式，可擴增得到包括突變點的片段，根據對擴增產物的測序結果可判斷待測樣品是否攜帶突變，從而預測患者是否有患宮頸癌的風險，實現宮頸癌的早期診斷。本發明提供的試劑盒包含本發明提供的引物組，可用于檢測樣品是否攜帶人類DDX11上的突變位點。由于組織細胞形態學的改變是由于基因突變所致，本發明提供的引物用于宮頸癌的早期診斷與傳統技術相比，具有更高的靈敏度和更高的準確度。
文檔編號C12N15/55GK103243113SQ20131018592
公開日2013年8月14日 申請日期2013年5月20日 優先權日2013年5月20日
發明者宋耀華, 楊舒婷, 王家俊 申請人:蘇州大學