專利名稱：一種葡萄霜霉病菌的快速分子檢測方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明“一種葡萄霜霉病菌的快速分子檢測方法與應用”，本發明屬于作物病害診斷與防治技術領域，具體涉及一種葡萄霜霉菌的分子檢測方法及應用。
背景技術：
葡萄(Vitis vinifera)是世界上栽培面積最大、產量最多的果樹之一，已經具有5000 7000年的栽培歷史，世界葡萄產業的貿易額超過581億美元(2010年度葡萄產業技術發展報告)，遠遠超過其他果樹。葡萄作為一種世界性的水果，具有多種價值，隨著人民生活水平的提高，無公害葡萄及葡萄產品的需求量逐漸增加，葡萄產業向著優質、綠色、健康的方向發展是大勢所趨。葡萄霜霉病一直是制約葡萄和葡萄酒產業的一大瓶頸，一般年份可減產10 20%，嚴重的可達70 80%，并且嚴重影響次年的產量和品質，目前該病的最主要防治手段仍是噴施化學農藥，但隨著施藥量的增加，出現了如果實品質下降、環境污染、病菌抗性產生等一系列問題。及時、準確預測霜霉病的發生時期、流行強度，確定藥劑使用時期、次數和劑量能夠提高藥效、減少施藥次數、降低生產成本、減輕環境污染等因農藥使用所帶來的負面影響，為霜霉病的綜合防治提供依據。因此，開展葡萄霜霉病預測預報研究對于科學防治葡萄霜霉病具有重要的意義。目前，還沒有葡萄霜霉病菌(Plasmoparaviticola)快速檢測技術的報道，因此，建立高效、快速的早期檢測技術將為葡萄霜霉病的科學防控提供新的思路，推動葡萄產業的健康發展。傳統的霜霉早期檢測方法往往根據病組織的癥狀、病原菌的特征以及研究人員的經驗進行，但是，霜霉菌引起的早期褪綠與其他病原引起的癥狀相似，很難準確判斷。另一方面，霜霉菌是專性寄生菌，不能進行人工培養，因此不能單靠傳統的分離培養、血清鑒定和ELISA等方法進行檢測難度較大，霜霉目真菌的檢測方法為葡萄霜霉病菌的檢測提供了很好的借鑒。霜霉目真菌的檢測方法`主要有菌體化學染色法、熒光檢測法、酶聯免疫吸附法、特異性聚合酶鏈式反應等手段。近年來，酸性品紅、苯胺藍、棉蘭藏紅等染色劑都被用于對玉米組織中大孢指疫霉(Sclerospora macropsora)菌絲體的檢測。周肇慧等提出了棉蘭一藏花紅染色法能有效地檢出向日葵種子中的霜霉菌，崔鐵軍等在對向日葵種子帶菌規律的研究過程中，也發現了霜霉菌的自體熒光現象，并據此建立了向日葵霜霉病種子帶苗的熒光檢驗法，結果顯示:在熒光顯微鏡的視野內，寄主組織不發生熒光或只具微弱的黃色熒光，霜霉菌菌絲和吸器發出亮藍色熒光，形態和結構清晰可見。向日葵種子中潛藏的其它種帶病菌(主要為半知菌)菌絲不發出熒光或熒光極弱，很容易與霜霉菌區分。但當病菌在寄主組織中僅以菌絲體的形態存在時，染色法只能準確地判斷病菌是否為卵菌，仍缺乏分類上種的鑒定能力。合適的分子靶標是開發病原菌分子檢測技術的基礎，目前大多數植物病原菌的分子檢測祀標都是基于ITS序列。Valsesia等基于葡萄葉片霜霉菌(P.viticola)的ITS序列的定量實時熒光PCR的高通量檢測方法，檢測靈敏度可達0.1pgo劉艷等建立了基于大豆霜霉菌(Peronospora man-schurica)的rDNA ITS序列的早期檢測方法,靈敏度可以達到0.lpg。同時為了快速準確的檢測土壤中辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici),王淑芳等建立了基于辣椒疫霉病菌ITS序列的實時熒光定量檢測體系，利用構建的標準曲線和優化的實時熒光定量體系對人工接種含梯度濃度的辣椒疫霉菌的土壤樣品進行實時熒光定量PCR檢測，效果良好。孟軍等就三種在農業生產上危害比較嚴重的疫霉菌P.nicotianae、P.1nfestans、P.sojae和首次在我國報道的疫霉種P.tentaculata的分子檢測祀標進行了研究，采用普通PCR、套式PCR等技術對以上四種疫霉菌的游動孢子、卵孢子、發病植株、病田的土壤樣品進行分子檢測，結果顯示:普通PCR檢測靈敏度均為lOOpg，套式PCR對游動孢子和厚垣孢子的檢測精度可達I 3個游動孢子和I個卵孢子，該體系可用于田間土壤和發病植物組織中的P.nicotianae、P.1nfestans和P.tentaculata進行快速靈敏的檢測。但是，由于ITS存在著無法區分一些病原菌與其親緣種的缺點，因此開發出更精確的病原菌檢測方法勢在必行。竇坦德等利用間接ELISA和夾心ELISA技術建立了大豆疫霉菌(Phytophthorasojae)的快速檢測體系，并利用其檢測了 20株不同來源的大豆疫霉菌，結果表明間接法(1-ELISA)和夾心法(Das-ELISA)均能較好地檢測純培養的大豆疫霉菌，但在檢測病組織時，夾心ELISA的特異性較強。酶聯免疫吸附法雖操作簡單，費用較低，但ELAISA方法檢測靶標比較單一，由于農業生產和口岸檢疫植物病原物的復雜性，而該方法存在著無法同時檢測多種病原物的缺點，因此催生出了多靶標分子檢測技術。近年來隨著分子生物學的快速發展，多靶標分子檢測技術取得了一系列的重要進展。Sikora等利用鎖式探針與微陣列技術相結合，建立了基于ITS序列的、能夠同時檢測出多種Phytophthora spp.的通用微陣列檢測方法，孟軍等利用同樣的方法建立了 10種植物病原菌的高通量分子檢測技術，不同探針的靈敏度分別為20pg和10pg。但是以上這些方法都存在檢測耗時長、對設備要求高、操作程序復雜、很難適應多種檢測環境等缺點，大大限制了其在基層檢測的應用和推廣，并且以上方法由于DNA提取方法的限制，并不能真正 滿足“快速”檢測的需求，因此有必要建立一種精確、高效、快速、靈敏、經濟的檢測方法。
發明內容
技術問題本發明的目的是研制一種能夠快速、高效、準確檢測葡萄霜霉病菌的分子檢測方法，以期達到快速、準確、低成本檢測出葡萄霜霉病菌(P.viticola)目的，為快速監測組織中霜霉菌潛伏侵染并及早采取防治措施提供積極的指導作用。本發明采用環介導等溫擴增法(Loop-mediated isothermal amplification,簡稱 LAMP),利用針對革E基因的 6 個區域設計4條特異引物，外加一條環引物，利用Bst DNA聚合酶的鏈置換活性，在同一反應體系中恒溫高效擴增，無需昂貴、精密的試驗儀器設備，大大簡化了檢測的步驟，結合DNA快速提取技術，55min即可檢測出33fg/ μ L水平的P.viticola基因組DNA，靈敏度是常規PCR檢測法的100倍。擴增產物可以通過目測法、瓊脂糖凝膠電泳法、熒光染料法等多種方法實現判讀，另外，該方法不僅檢測準確率高，適用范圍也很廣，不僅適用于釀酒、鮮食葡萄品種組織內霜霉菌的檢測，還適用于有核、無核品種葡萄組織內霜霉菌的檢測；不僅適用于不同地區的相同葡萄品種霜霉菌的檢測，相同地區的不同葡萄品種霜霉菌的檢測，還適用于不同地區的不同葡萄品種霜霉菌的檢測。總之，該方法特異性強、靈敏度高、產物檢測方便、成本低廉、操作步驟簡單，可以試劑盒的形式在我國大規模推廣。本發明是這樣實現的:利用已經公開發表的多個霜霉目真菌ITS的序列信息，通過序列比對，找到葡萄霜霉病菌ITS相對保守性差的區段作為模板，設計一組LAMP引物。經過一次LAMP擴增后，產物經目測法、瓊脂糖凝膠電泳法、熒光染料法等多種方法，根據有無白色沉淀、有無梯形條帶、產物顏色有無變化，直接判斷樣品中有無葡萄霜霉病菌，完成檢測。技術方案用于檢測葡萄霜霉病菌的LAMP方法，包括:I)用于檢測的DNA模板的快速制備用槍頭在樣品葉片上挑取少量霉層(葡萄霜霉病菌孢子囊)放入PCR管，加入50 μ L Buffer A 溶液(IOOmM NaOH，2% Tween 20，BufferA 用 IOM NaOH 和 20 % Tween : 20現配現用)，95°C溫育 lOmin。再加入 50 μ L Buffer B 溶液(IOOmM Tris_HCl，2mM EDTA)，振蕩混勻，12000rpm離心15s，取I μ L上清液做LAMP擴增的模板，直接加到LAMP反應體系中。DNA提取過程耗時15min。2)用于檢測葡萄霜霉病菌的特異性LAMP引物表I葡萄霜霉病菌特異性LAMP引物
權利要求
1.一種葡萄霜霉病菌的快速檢測方法，其特征在于由以下步驟構成: (1)五條葡萄霜霉病菌的特異性LAMP引物，序列分別為:FIP:5’ -GAAGCCAACCATACCGCAAATCGGCGACCAATTTATTTGCTGTTG-3’ ；BIP:5’ -GAATCGGTGAACCGTAGCTATATGTAAGCTGCCACTCTACTTCG-3’ ；F3:5’ -GTTTGTCTATTGTGGCCAGTC-3’ ；B3:5， -CCAAATGGATCGACCCTCG-3，；LB:5’ -GACTATGCTTTCAATCAGTTT-3’ ； (2)葡萄霜霉病菌的快速分子檢測體系的建立，其步驟包括: 1)從被測樣品材料中抽提葡萄霜霉病菌基因組DNA； 2)LAMP 擴增反應體系 25 μ L:包含 2.5 μ LlO X ThermoPol Reaction buffer, 8mMMgCl2,1.4mM dNTP, IM Betain，1.4 μ M 內引物 FIP 和 BIP，0.2 μ M外引物 F3 和 B3，1.4uM LB環引物，8U Bst DNA聚合酶大片段，I μ L模板DNA，ddH203.4 μ L ;反應程序:65°C恒溫反應30min ； 3)產物檢測:反應完成后，取出PCR管，對著光用肉眼觀察濁度或400nm光下使用濁度儀檢測濁度就能判定結果，或者取5μ L LAMP產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離130V30min，經溴化乙錠染色后于紫外燈下根據梯形條帶的有無判定結果，或向PCR管內加入2 μ L IOOOXSYBRGreenI染料后于紫外燈下根據綠色熒光的有無判定結果。
2.權利要求1中所述的葡萄霜霉 病菌的LAMP快速檢測方法在檢測葡萄霜霉病菌中的應用，其特征在于該檢測方法可應用于檢測葉片組織中葡萄霜霉病菌，檢測釀酒、鮮食葡萄品種組織內霜霉菌，檢測有核、無核品種葡萄組織內霜霉菌，檢測不同地區的相同葡萄品種霜霉菌，檢測相同地區的不同葡萄品種霜霉菌，檢測不同地區的不同葡萄品種霜霉菌。
全文摘要
本發明屬于作物病害診斷與防治技術領域，具體涉及一種葡萄霜霉菌的分子檢測方法及應用。本發明根據已公開的多種霜霉目真菌和其他常見的植物病原真菌的ITS序列信息，通過生物信息分析，自行設計了一組LAMP引物，結合葡萄霜霉病菌的基因組DNA快速提取技術，采用一步LAMP反應，僅需55min即可從不同葡萄種植區不同品種的葡萄霜霉病樣中快速檢測出33fg/μL水平葡萄霜霉病菌基因組DNA的存在。本發明特異性強、靈敏度高、檢測準確率高、適用范圍廣，可作為葡萄霜霉病菌的快速檢測技術在各地推廣應用。
文檔編號C12Q1/04GK103243166SQ20131017816
公開日2013年8月14日 申請日期2013年5月15日 優先權日2013年5月15日
發明者秦文韜, 張昊, 孔繁芳, 黃曉慶, 王忠躍 申請人:中國農業科學院植物保護研究所