專利名稱：一種高活力β-淀粉酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物中的淀粉酶的分離提純方法，尤其是一種工業(yè)化生產(chǎn)高活力β -淀粉酶的方法。
背景技術(shù)：
β-淀粉酶(E.C3.2.1.2)是淀粉酶的一種，又稱1，-3-麥芽糖苷酶。β -淀粉酶廣泛存在于大麥，小麥，甘薯，豆類等植物中，還有不少微生物能產(chǎn)生β_淀粉酶。β_淀粉酶在食品工業(yè)中作為生物催化劑，可以應(yīng)用于麥芽糖、啤酒、面包等的生產(chǎn)和制造。在食品點(diǎn)心上使用β_淀粉酶可以防止淀粉老化，在醫(yī)藥工業(yè)上制造注射用麥芽糖，可以和α-淀粉酶一起作為消化劑。近年來，以β_淀粉酶作為生物催化劑制造麥芽糖漿，補(bǔ)足了我國食糖不足的狀況。隨著科技進(jìn)步，人們對高麥芽糖漿，超高麥芽糖漿研究非?；钴S。但國內(nèi)由甘薯，小麥來生產(chǎn)淀粉酶的活力低(50萬u/ml)，耐溫性差(58°C)，不符合高麥芽糖，超高麥芽糖漿的生產(chǎn)要求。進(jìn)口的高活力β -淀粉酶雖然能夠符合高麥芽糖漿的生產(chǎn)，但由于其耐溫性不及大豆β-淀粉酶，在用于生產(chǎn)高麥芽糖時(shí)β-淀粉酶的使用量大，且生產(chǎn)高麥芽糖時(shí)所必需的普羅蘭酶用量也要大于大豆β_淀粉酶(大麥β_淀粉酶的使用PH窄和普羅蘭酶pH不一致所造成的)。上述高活力大豆β_淀粉酶的工藝應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，使用范圍受到限制，價(jià)格高，不能滿足需求。與此同時(shí)，國內(nèi)科研部門雖然取得了不少淀粉酶的制備方法科研成果，但是大部分能耗高，環(huán)境污染高(鹽析方法`)，原料的綜合利用率低，成本高(原料采用低溫豆柏，價(jià)格3500元/噸以上)(參見名稱為《大豆β -淀粉酶的制備工藝》、專利號為99102506的中國發(fā)明專利)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種消耗資源少，得率高、活力高、性能好的β -淀粉酶制備方法。依據(jù)該制備方法獲得的產(chǎn)品具有耐溫、耐酸優(yōu)于同類產(chǎn)品的優(yōu)點(diǎn)，且保存穩(wěn)定性好，是應(yīng)用效果較好的高活力β_淀粉酶。本發(fā)明提供了一種β -淀粉酶的制備方法，包括分離水收集，預(yù)處理，沉淀并溶出β -淀粉酶，采用聚丙烯酸與溶液中的β -淀粉酶形成復(fù)合沉淀物，溶解復(fù)合沉淀物，調(diào)節(jié)PH大于等于6.0溶出β-淀粉酶，經(jīng)凈化，濃縮，配以穩(wěn)定劑，精制后獲得高活力淀粉酶
上述方法中，可以采用廢棄的植物提取液作為原料。例如，本發(fā)明的優(yōu)選例中，以大豆蛋白分離水作為分離水原料。上述方法中，可以采用聚凝劑及篩選的濾材對分離水進(jìn)行固液分離，使濾液不會堵塞超濾膜。其中，分離水收集后，調(diào)整溫度10-50°c，pH 3.2-5.0。
加入濃度為0.05-5%的PAA (聚丙烯酸)。加入PAA后分離沉淀物，再中和沉淀物溶出淀粉酶。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，上述的PAA.Ε (聚丙烯酸.淀粉酶)復(fù)合沉淀物，加水溶解并加入碳酸鈣中和至ΡΗ6.0以上，促進(jìn)Ca2+能與沉淀物中PAA形成溶解度更小的復(fù)合物沉淀，而使酶蛋白釋放溶于水中。上述方法中，溶出淀粉酶后，還包括聚凝除雜質(zhì)，超濾的步驟。超濾過程中，可以采用10Κ-30Κ道爾頓分子量的濾材進(jìn)行濃縮。所述的濾材可以是有機(jī)膜、無機(jī)膜或者金屬膜。超濾到一定倍數(shù)后，調(diào)整pH和聚凝劑使得殘余蛋白及膠體物質(zhì)沉淀。超濾可以分二段進(jìn)行，第一段對濃縮液進(jìn)行聚凝處理并調(diào)整pH，使得濃縮液中非含酶物質(zhì)得到沉淀；第二段對第一段獲得的產(chǎn)物過濾后再進(jìn)行二次濃縮。超濾分二次進(jìn)行，首先對粗酶液進(jìn)行聚凝處理并調(diào)整PH4.5-5.5，使得非酶物質(zhì)得到沉淀，過濾后的粗酶液再進(jìn)行超濾濃縮。從而有效地提高了濃縮倍數(shù)從而得到高活性的β _淀粉酶。在本發(fā)明的優(yōu)選例中，加入了酶穩(wěn)定劑(含有食鹽，糊精，醋酸鈉)，以進(jìn)一步提升所得大豆淀粉酶的性能。上述方法中，可以采用助濾劑進(jìn)行固液分離或微孔膜進(jìn)行精制，和去除微生物 本發(fā)明的制備方法，以廢棄植物提取液為原料，不僅變廢為寶，綠色環(huán)保，而且能夠大
幅度的減少大豆蛋白質(zhì)工·廠分離水中C0D?；瘜W(xué)需氧量COD (Chemical Oxygen Demand)是以化學(xué)方法測量水樣中需要被氧化的還原性物質(zhì)的量。水樣在一定條件下，以氧化I升水樣中還原性物質(zhì)所消耗的氧化劑的量為指標(biāo)，折算成每升水樣全部被氧化后，需要的氧的毫克數(shù)，以mg/L表示。它反映了水中受還原性物質(zhì)污染的程度。該指標(biāo)也作為有機(jī)物相對含量的綜合指標(biāo)之一。利用本發(fā)明的制備方法，生產(chǎn)I噸高活力β -淀粉酶可以節(jié)約10余噸豆柏，同時(shí)還可以減少大豆蛋白質(zhì)工廠分離水中COD約20-30%。另一方面，本發(fā)明還提供了依據(jù)上述制備方法生產(chǎn)的大豆淀粉酶，其特性為最適作用溫度60-63°C，作用溫度范圍40-65°C，最適作用pH5.5，作用pH范圍3.8-7.0。本發(fā)明制備的β_淀粉酶，其酶活最高可以達(dá)到100萬u/ml (lu即I個(gè)酶活力單位，它是指定適宜反應(yīng)條件下，每小時(shí)產(chǎn)生I毫克麥芽糖的酶量)。由于該產(chǎn)品具備上述優(yōu)異特性，保證制糖高效率，又增強(qiáng)了抗御微生物對糖化液污染的危害。圖1顯示，本發(fā)明的制備方法生產(chǎn)的大豆β -淀粉酶在較高的溫度，不僅活性沒有降低，反而略有提升。而同樣溫度下，大麥淀粉酶的活性就迅速下降。圖2顯示，在其他條件相同的情況下，大麥β -淀粉酶在pH彡4.5時(shí)，幾乎沒有活性，當(dāng)pH大于4.5后，活性逐步提高，在pH=5.5時(shí)達(dá)到最高峰，隨后立即下降；而本發(fā)明的制備方法生產(chǎn)的大豆β-淀粉酶在較寬的PH范圍內(nèi)，活性穩(wěn)定。本發(fā)明高活力β -淀粉酶制備方法優(yōu)異效果:
采用廢棄大豆蛋白分離液提取β_淀粉酶達(dá)到綜合利用，變廢為寶，能夠減少大豆蛋白質(zhì)工廠分離水中C0D，對改善環(huán)境起到很好作用。
采用PAA沉淀分離獲得β_淀粉酶方法簡單，收率高，采用超濾濃縮可以獲得高活力β_淀粉酶。更重要的是，運(yùn)用本發(fā)明獲得比其他植物提取的β_淀粉酶更優(yōu)異的產(chǎn)品特性，保證制糖高效率又增強(qiáng)了抗御微生物對糖化液污染的危害。本發(fā)明高活力β_淀粉酶適合于上述工業(yè)產(chǎn)品的制造。特別是制造高麥芽糖漿，超高麥芽糖糖漿及防止淀粉老化的優(yōu)選產(chǎn)品。比較試驗(yàn)顯示，在生產(chǎn)高麥芽糖時(shí)，大豆β -淀粉酶的使用量相比大麥β -淀粉酶可以減少20%，普羅藍(lán)酶的用量也可減少20%。
圖1是大豆β -淀粉酶和大麥β -淀粉酶對溫度的耐受比較圖。其中，橫坐標(biāo)是溫度(攝氏度)，縱坐標(biāo)是相對酶活。SBA是大 β -淀粉酶,BBA是大麥β_淀粉酶。圖1顯示，本發(fā)明的制備方法生產(chǎn)的大豆β_淀粉酶在較高的溫度，不僅活性沒有降低，反而略有提升。而同樣溫度下，大麥淀粉酶的活性就迅速下降。圖2是大豆β -淀粉酶和大麥β -淀粉酶對酸堿度的耐受比較圖。其中，SBA=Soyβ-amylase (大豆 β-淀粉酶)，BBA=Barley β -amylase (大麥β -淀粉酶);
橫坐標(biāo)是pH值，縱坐標(biāo)是相對酶活。SBA是大豆β -淀粉酶，BBA是大麥β -淀粉酶；圖中顯示，在其他條件相同的情況下，大麥β -淀粉酶在pH彡4.5時(shí)，幾乎沒有活性，當(dāng)pH大于4.5后，活性逐步提高，在 pH=5.5時(shí)達(dá)到最高峰，隨后立即下降；而本發(fā)明的制備方法生產(chǎn)的大豆淀粉酶在較寬的PH范圍內(nèi)，活性穩(wěn)定。圖3是330個(gè)單位(330u/g淀粉)的大豆β -淀粉酶和各濃度普羅蘭酶的差別。反應(yīng)條件:pH4.562°C。圖4是330個(gè)單位(330u/g淀粉)的大麥β -淀粉酶和各濃度普羅蘭酶的差別。反應(yīng)條件:pH4.562°C。圖5是在普羅藍(lán)酶添加0.5ASPU情況下，大麥β -淀粉酶和大豆β _淀粉酶生成麥芽糖的表現(xiàn)。圖6是在普羅藍(lán)酶添加1.0ASPU情況下，大麥β -淀粉酶和大豆β _淀粉酶生成麥芽糖的表現(xiàn)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)
笪
ο除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練、人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例1優(yōu)選制備例I取分離水(蛋白分離后的廢水)IOOL (活性4125u/ml)，調(diào)整溫度45°C，pH3.4加入
0.P/oPAA獲得沉淀，經(jīng)溶解加入IOOg碳酸鈣，中和pH6.30，經(jīng)300cm2過濾器過濾，得到濾液用中孔纖維膜濃縮，配以酶穩(wěn)定劑(食鹽，糊精，醋酸鈉)，精制得71.64萬u/ml成品416ml。實(shí)施例2優(yōu)選制備例2
取收集分離水1500L (活性4380u/ml)，調(diào)整溫度44°C，pH3.3加入0.2%PAA獲得沉淀，加水1:5溶解，加入1.1kg碳酸鈣中和pH6.05，用Im2板框過濾得到濾液，用4寸卷式膜超濾濃縮，配以酶穩(wěn)定劑(食鹽，糊精，醋酸鈉)，精制得到74.58萬u/ml成品6589ml。實(shí)施例3優(yōu)選制備例3
取收集分離水IOM3 (活性4217u/ml)調(diào)整溫度44°C，中和pH3.4加入0.50%PAA獲得沉淀，經(jīng)溶解加入1:5水溶解，加入IOkg碳酸鈣中和pH6.18，用8寸卷式膜超濾濃縮，經(jīng)酶穩(wěn)定劑(食鹽，糊精，醋酸鈉)精制后得到91.64萬u/ml成品34787ml。實(shí)施例4優(yōu)選制備例4
取收集分離水1000L (4530u/ml)，采用篩選的硅藻土過濾處理，濾液用膜超慮濃縮到20倍，第一次濃縮液用聚合氯化鋁(PAC)0.03%聚凝并調(diào)整pH到4.0-6.0,使?jié)饪s液中的蛋白及膠體物質(zhì)得到沉淀，過濾去除雜質(zhì)，濾液進(jìn)行二次超濾，二次濃縮液經(jīng)酶穩(wěn)定劑(食鹽，糊精，醋酸鈉)精制得到90萬u/ml成品4836ml。實(shí)施例5大豆β-淀粉酶和大麥β-淀粉酶生成麥芽糖的性能比較
用實(shí)施例3獲得的大豆β-淀粉酶和目前中國普遍在用的大麥β-淀粉酶作比較制造麥芽糖方面的應(yīng)用。所使用的普羅蘭酶(GCI 0ΡΤΙΜΑΧ L-1000)活性為1000 ASPU/g。所使用的大豆β-淀粉酶和大麥β -淀粉酶的活性相近，分別為大豆β淀粉酶705870U/ml，大麥β淀粉酶 708840u/mlo糖化試驗(yàn)的條件設(shè)定如下:
基質(zhì)濃度:日本淀粉 100，33%W/V濃度(DE = 11相當(dāng))/50mM冰醋酸-醋酸鈉緩沖溶液。酶的添加量:根據(jù)表I和表2的組合添加。
糖化pH溫度:大豆β -淀粉酶為ρΗ4.5，62.(TC ;大麥β -淀粉酶為ρΗ5.5，58.5°C。
糖化時(shí)間:O 48小時(shí)。
糖化目標(biāo):70%以上。按照大豆β -淀粉酶和大麥β -淀粉酶的最適合條件，就糖化能力作比較。表I中大豆β -淀粉酶在比大麥β -淀粉酶減少20%添加量時(shí),糖化40小時(shí)后能夠同樣達(dá)到相同的糖化效果。另外由于大麥β -淀粉酶的適用pH和普羅藍(lán)酶不一致，因此對普羅藍(lán)酶有依存性(添加大于2ASPU)，而大豆β -淀粉酶和普羅藍(lán)酶的適用pH —致，因此當(dāng)普羅藍(lán)酶添加到
0.75ASPU后對麥芽糖的增長作用不大了，所以生產(chǎn)高麥芽糖時(shí)普羅藍(lán)酶的添加量可以減少20%。這說明本發(fā)明的大豆淀粉酶生產(chǎn)制造麥芽糖時(shí)，成本相對較低。
注:Gl=葡萄糖，G2=麥芽糖，G3=麥芽三塘，G4=四糖。表I大豆β -淀粉酶和大麥β -淀粉酶的糖化比較試驗(yàn)
權(quán)利要求
1.一種β-淀粉酶的制備方法，包括分離水收集，預(yù)處理，沉淀并溶出β-淀粉酶，其特征在于，其包括步驟:采用聚丙烯酸與溶液中的β-淀粉酶形成復(fù)合沉淀物，溶解復(fù)合沉淀物，調(diào)節(jié)PH大于等于6.0溶出β -淀粉酶，經(jīng)凈化，濃縮，配以穩(wěn)定劑，精制獲得高活力的β -淀粉酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，分離水收集后，調(diào)整溫度10-50°C，pH3.2_5.0 ο
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，加入聚丙烯酸的終濃度為0.05-5%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，溶出淀粉酶后，還包括超濾和除雜質(zhì)的步驟。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，超濾采用10Κ-30Κ道爾頓分子量的有機(jī)膜、無機(jī)膜或者金屬膜進(jìn)行濃縮。
6.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，超濾到一定倍數(shù)后，調(diào)整pH和聚凝劑使得殘余蛋白及膠體物 質(zhì)沉淀。
7.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，超濾分二段進(jìn)行，第一段對濃縮液進(jìn)行聚凝處理并調(diào)整PH，使得濃縮液中非含酶物質(zhì)得到沉淀；第二段對第一段獲得的產(chǎn)物過濾后再進(jìn)行二次濃縮。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于采用助濾劑進(jìn)行固液分離或微孔膜進(jìn)行精制和去除微生物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，采用大豆蛋白分離水作為分離水原料。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法獲得的β-淀粉酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種植物中的淀粉酶的分離提純方法，尤其是一種工業(yè)化生產(chǎn)高活力β-淀粉酶的方法。本發(fā)明的β-淀粉酶的制備方法，包括分離水收集，預(yù)處理，沉淀并溶出β-淀粉酶，采用聚丙烯酸與溶液中的β-淀粉酶形成復(fù)合沉淀物，溶解復(fù)合沉淀物，調(diào)節(jié)pH大于等于6.0溶出β-淀粉酶。本發(fā)明是一種消耗資源少，得率高(收率75%左右)，活力高(通常70-90萬u/ml)的β-淀粉酶制備方法，所得產(chǎn)品對溫度和酸堿度的耐受性好，應(yīng)用于麥芽糖生產(chǎn)成本較低。
文檔編號C12N9/24GK103232982SQ201310177110
公開日2013年8月7日 申請日期2013年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月15日
發(fā)明者霍國昌, 許建中 申請人:常熟市諾科生化工程有限公司