一種用于肺癌預后評價的基因檢測試劑盒及其制備與用途
【專利摘要】本發明提供了一種用于肺癌預后評價的基因檢測試劑盒，其包括與肺癌預后密切相關的5個基因的多重DNA聚合酶鏈式反應擴增引物序列和固定了該5個基因探針的芯片，以及人腫瘤組織DNA提取液、PCR擴增反應液、陰性對照、陽性對照和DNA雜交液；本發明還提供一種該試劑盒的制備方法，采用敏感性及特異性均很高的表面等離子共振儀檢測肺癌預后密切相關基因的表達，可以快速、有效、準確、經濟地檢測出該5個肺癌預后密切相關基因的表達水平，可用于肺癌臨床預后評價和臨床指導用藥的檢測。
【專利說明】—種用于肺癌預后評價的基因檢測試劑盒及其制備與用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及肺癌臨床預后評價中相關基因表達的檢測試劑盒，以及該試劑盒制備及其在肺癌臨床預后評價和臨床指導用藥中的用途。本發明涉及的肺癌預后密切相關的5個基因，即蛋白激酶C iota、五次跨膜單鏈糖蛋白Promininl、乙醛脫氫酶1、乳腺癌耐藥蛋白ATP結合轉運蛋白G超家族成員2和八聚體結合轉錄因子4，可用于肺癌預后評價和指導患者的臨床用藥。
【背景技術】
[0002]目前，肺癌是人類常見的惡性腫瘤，嚴重威脅著人類的生命。隨著疾病的進展，肺癌患者的臨床預后也在不斷發生變化。在肺癌進展的不同階段，患者臨床預后表現也不一樣，臨床上用藥會發生改變。但肺癌由于缺乏基礎檢驗指標而難以在做出準確的預后評價和臨床用藥。
[0003]肺癌預后是很差，嚴重影響了患者生活質量和生存期。日前研究肺癌預后與基因的表達水平密切相關。如關鍵基因蛋白激酶C iota、五次跨膜單鏈糖蛋白Promininl、乙醒脫氫酶1、乳腺癌耐藥蛋白ATP結合轉運蛋白G超家族成員2和八聚體結合轉錄因子4的高表達在維持肺癌的自我更新、增殖分化、侵襲和耐藥性等方面發揮重要的作用。肺癌細胞的分化程度和更高的惡性生物學行為轉化也與這些基因密切聯系在一起。
[0004]目前，還沒有專門針對肺癌預后密切相關基因進行檢測的成熟產品和方法。本發明針對世界范圍內已報道的肺癌表達基因，應用表面等離子共振檢測技術發明了檢測肺癌預后密切相關的5個基因的試劑盒產品及其制備方法，分別為上述5個關鍵基因，可以快速、有效、準確、經濟地檢測出5個肺癌預后評價相關基因表達水平，為肺癌預后的臨床預后和臨床用藥提供指導性的評價。
【發明內容】
[0005]肺癌預后是個在疾病進展過程中涉及自我更新、增殖分化、侵襲轉移、耐藥性及惡性轉化等相關基因的變化，這些基因表達與肺癌的發生和發展密切相關。本發明遴選出與肺癌預后密切相關的5個關鍵基因，其中分別為蛋白激酶C iota (protein kinase Ciota, PKC iota)、五次跨膜單鏈糖蛋白 Promininl (PR0M1)、乙醒脫氫酶 I (aldehyde dehy肺癌ogenasel, ALDH1)、乳腺癌耐藥蛋白ATP結合轉運蛋白G超家族成員2 (ATP-bindingcassette transporter G2, ABCG2)和八聚體結合轉錄因子 4 (octamer-bindingtranscription factor4, 0CT4)。
[0006]PKC iota過量表達為肺癌細胞遷移、侵潤和抗失巢凋亡所需，也證實在肺癌干細胞轉化中起重要作用。PR0M1具有 使肺癌細胞成集落能力，賦予肺癌細胞自我更新、增殖分化、侵襲和耐藥性的能力，是肺癌干細胞的重要標志物。ABCG2與肺癌的侵襲能力、非小細胞肺癌分化程度以及更高惡性生物學行為相關，也是肺癌干細胞的重要標志物。肺癌細胞中表達ALDHl陽性，與肺癌患者的預后呈負相關。肺癌干細胞的分子標記0CT-4在維持肺癌細胞的侵襲、克隆形成、耐藥方面有著重要作用。通過提取肺癌腫瘤組織總RNA并進行聚合酶鏈式反應(PCR)檢測基因表達狀況，該5個關鍵基因其中2個以上的都過表達，表明肺癌患者預后變差和腫瘤惡性程度增強，需要靶向這些基因的抑制劑治療或干擾基因表達，將有助于肺癌患者預后好轉。
[0007]本發明涉及一種檢測肺癌預后評價相關基因的試劑盒，其特征在于，包括與肺癌預后密切相關的5個基因多重PCR擴增引物。
[0008]本發明涉及一種檢測肺癌預后評價相關基因的試劑盒，包括與肺癌預后密切相關的5個基因多重PCR預擴增引物，其序列如下:
[0009]
【權利要求】
1.一種用于肺癌預后評價相關基因的檢測試劑盒，其特征在于，包括與肺癌預后密切相關的5個基因的多重PCR擴增引物序列和固定了該5個基因探針的芯片；其中，所述的與肺癌預后密切相關的5個基因為蛋白激酶C iota、五次跨膜單鏈糖蛋白Promininl、乙醛脫氫酶1、乳腺癌耐藥蛋白ATP結合轉運蛋白G超家族成員2和八聚體結合轉錄因子4。
2.一種用于肺癌預后評價相關基因的檢測試劑盒，其特征在于，其包括:固定了如權利要求I所述的與肺癌預后密切相關的5個基因探針的芯片，即通過標記探針的基團與包被芯片的結合基團結合固定，芯片中還含有陰性對照探針。
3.一種用于肺癌預后評價相關基因的檢測試劑盒，其特征在于，如權利要求2所述的所述基因芯片為巰基包被芯片、鏈霉親和素包被芯片或羧化葡聚糖包被芯片。
4.一種用于肺癌預后評價相關基因的檢測試劑盒，其特征在于，如權利要求3所述的基因芯片優選為鏈霉親和素包被芯片。
5.一種用于肺癌預后評價相關基因的檢測試劑盒，其特征在于，其包括:人腫瘤組織DNA提取液、PCR擴增反應液、陰性對照、陽性對照和DNA雜交液； 其中，人腫瘤組織DNA提取液包括:去離子水、6M Nal、氯仿/異戊醇混合液、異丙醇和無水乙醇； PCR擴增反應液包括:10 XPCR緩沖液、2U-5U的Taq酶、0.2~1.0mM的dNTPs以及權利要求1所述的5個基因的多重PCR引物混合物，該擴增引物混合物的用量分別都為0.2 μ mo I ； 陰性對照為DEPC去離子水； 陽性對照為構建的5個基因質粒DNA ； DNA雜交液為50%甲酰胺、6XSSC、0.5% SDS、5XDenharde’ S試劑、5%硫酸葡聚糖、200mg/L變性的鮭精DNA。
6.一種用于肺癌預后評價相關基因的檢測試劑盒，其特征在于，其使用步驟如下: 取來自肺癌患者腫瘤組織1-2克，按腫瘤組織DNA抽提純化的方法抽提腫瘤組織中DNA，取2 μ I用I X TAE緩沖液加熱溶解的m/v為I %的瓊脂糖凝膠進行電泳；以及取2 μ I用I X TAE緩沖液稀釋50倍，進行DNA定量； 獲取的肺癌患者腫瘤組織DNA后，提取的DNA為PCR模板進行擴增，PCR擴增反應條件如下: DPCR反應體系如下:
7.—種如權利要求5或6所述的用于肺癌預后評價相關基因的檢測試劑盒，其特征在于，所述HBS-EP緩沖液的pH為7.4。
8.—種如權利要求5或6所述的用于肺癌預后評價相關基因的檢測試劑盒，其特征在于，所述靶探針的摩爾濃度為0.20 μ M0
9.一種如權利要求1-6任一項所述的肺癌預后評價相關基因的檢測試劑盒的制備方法。
10.根據權利要求1~6任一項所述的試劑盒在檢測肺癌預后密切相關的5個基因中的臨床應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK103898206SQ201310174083
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2013年5月13日 優先權日:2013年5月13日
【發明者】黃啟明, 李一民, 徐世洪, 李一漢, 陳宗明, 連日平 申請人:北京希普生國際生物醫學研究院