專利名稱：miR-27a的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種miR-27a的新用途。
背景技術(shù)：
MicroRNAs CmiRNAs)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性非編碼小分子RNAs，長度約為19-25nt，可通過直接降解靶基因mRNA或抑制其蛋白翻譯而負性調(diào)控轉(zhuǎn)錄后表達。研究發(fā)現(xiàn)miRNAs可調(diào)控約30%的人類基因，從而參與調(diào)控一系列的細胞生物學過程包括細胞分化、增殖及凋亡等。近年來，越來越多的研究表明一些miRNA可作為一些腫瘤的診斷標志物或治療靶點包括結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、胃癌等。因此，為我們針對miRNA為靶點開發(fā)診斷試劑或治療藥物提供了新的思路。卵巢癌是致死率最高的婦科惡性腫瘤。由于起病隱匿，許多病人就診時已處于晚期。對于晚期病人，其5年生存率只有28°/Γ45%。卵巢癌的標準治療方法包括外科腫瘤細胞減滅術(shù)聯(lián)合鉬類藥物化療。術(shù)后70%病人會對化療藥物起作用，但是大部分仍舊會復發(fā)，最終死于此疾病。因此，尋找與卵巢癌診斷、治療有關(guān)的新靶點成為科研工作或臨床實踐中亟待解決的難題。目前，一系列研究發(fā)現(xiàn)異常的miRNAs表達在卵巢癌診斷和治療方面發(fā)揮重要作用。MicroRNA-27a (miR_27a)位于19號染色體上，研究發(fā)現(xiàn)其廣泛高表達于一系列腫瘤中。在乳腺癌細胞中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染反義miR-27a后，通過對靶基因Myt-1的抑制，使細胞周期進展阻滯在G2-M，細胞有絲分裂受阻，增殖能力受到抑制。也有報道顯示GT-094(NO類非留體抗炎藥)或⑶ODA-Me可通過下調(diào)miR_27a，進而上調(diào)ZBTBlO表達，最終抑制轉(zhuǎn)錄因子Sp及其相關(guān)基因產(chǎn)物表達，引起細胞生長能力下降及凋亡增加。在胃腺癌細胞中，通過使用miR-27a ASO (反義寡核苷酸)下調(diào)miR_27a表達后，細胞的生長及克隆形成能力被顯著下調(diào)
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的:針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種miR_27a的新用途，以期為制備用于治療卵巢癌的藥物提供有效途徑。技術(shù)方案:為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為: miR-27a作為藥物靶點在制備用于治療卵巢癌藥物中的應(yīng)用。miR-27a在制備卵巢癌診斷試劑盒中的應(yīng)用。有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點:本發(fā)明根據(jù)miR_27a在卵巢癌癌組織中的表達高于卵巢良性組織這一特性，將miR-27a應(yīng)用于制備卵巢癌診斷試劑盒；同時，通過反義核酸或者藥物干擾miR-27a表達，可抑制卵巢癌細胞的生長和侵襲，可用miR-27a作為靶點設(shè)計或開發(fā)藥物，在治療卵巢癌治療中，具有重要用途。
圖1是miR_27a在卵巢癌組織中的相對表達量結(jié)果圖；圖2是SRB和Transwell實驗結(jié)果圖；A圖為SRB細胞增殖實驗，說明反義核酸干擾miR-27a表達后可抑制卵巢癌細胞的增殖；B圖為Transwell遷徙實驗，說明反義核酸干擾miR-27a表達后可抑制卵巢癌細胞的遷移；C圖也為細胞增殖實驗，說明當誘導miR_27a高表達則可促進卵巢癌細胞的增殖；D圖為遷徙實驗，說明當誘導miR-27a高表達后，在一定程度上可部分促進卵巢癌細胞的遷移；
圖3是SRB結(jié)果圖；顯示藥物Genistein可濃度、時間依賴性的抑制卵巢癌細胞的生
長;
圖4是Real time PCR結(jié)果圖；顯示藥物Genistein可劑量依賴的抑制miR_27a的表
達;
圖5是Real time PCR結(jié)果圖；顯不藥物Genistein可誘導miR_27a革巴基因Sprouty2的mRNA表達增高；
圖6是Western b lot結(jié)果圖；其中，A為Western blot結(jié)果圖；顯不藥物Genistein可誘導miR-27a祀基因Sprouty2蛋白表達增高；B為Western blot結(jié)果灰度分析后量化的柱狀 圖7是miR-27a拮抗藥物Genistein通過miR_27a途徑對細胞的抑制作用結(jié)果 圖8是miR-27a拮抗藥物Genistein誘導祀基因Sprouty2表達的作用結(jié)果圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步的說明。實施例1 miR-27a在卵巢癌組織標本中表達水平的檢測 URNA的提取
(O收集石蠟包埋的卵巢癌及良性卵巢組織，選取代表性蠟塊，5Mm厚切片5 10張，收于 1.5mL Ep 管。(2)脫臘:各Ep管加入二甲苯1.2mL,混勻，55°C下脫臘5min ；IOOOOrpm離心5min,去上清,視石臘多少重復上述步驟3 5次；無水乙醇，1.2mL洗漆2次，10000 rpm離心5^8 min ;室溫干燥。(3)消化:加入組織裂解液(20mmol/L Tris-HCl, pH 8.0,20mmol/L EDTA, 2%sodium dodecyl sulfate)200PL,蛋白酶 K 溶液 5PL (20 mg/mL),置于 55°C水浴鍋內(nèi)過夜;待組織完全溶解后，95°C加熱lOmin，滅活蛋白酶K。(4)加ImL Trizol，混勻，室溫下放置IOmin ;加入200μ 氯仿，劇烈混勻15s ；4°C,13000r/min，離心15 min ;吸取水相，加入等體積異丙醇，_20°C放置I 2h ；4°C,13000r/min,離心15min ;棄上清,加75%乙醇1.5mL洗漆沉淀，4°C，13000r/min,離心IOmin ;棄上清，室溫干燥后，加DEPC水溶解RNA，測濃度后-80°C保存，得RNA樣本。2、利用“Stem Loop”方法檢測miR_27a的表達
總體積7.5μ 的反應(yīng)體系為:1.5PL 5 XM-MLV Buffer, 2.45μ DEPC處理過的滅菌水，0.75μ IOmmoI/L dNTP,0.1 μ L 40 υ/μ Rnasin，0.2PL 200υμ/1 MMLV，1.5μ Stem Loop特異引物(購于Applied Biosystems公司)，IPL RNA樣本。將以上體系吹打混勻，置于PCR儀器中16°C 30min,42°C 30min,85°C 5min反應(yīng)結(jié)束后，所得cDNA產(chǎn)物-20°C保存。
總體積IOKL 的 miR_27a 反應(yīng)體系為:5KL TaqMan 2XUniversal PCR MasterMix (購于 Applied Biosystems 公司)，2.5KL DEPC 處理過的滅菌水，0.5KL 20XTaqManmicroRNA assays, 2M-L Stem Loop 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(購于 Applied Biosystems 公司)。反應(yīng)條件:將以上體系吹打混勻，置于ABI7300 PCR儀器，反應(yīng)條件是50°C 2min ；95°C IOmin ；95°C 15s ；60°C lmin，共 40 個循環(huán)。通過統(tǒng)計方法比較,計算miR_27a的相對表達量。結(jié)果如圖1所示,miR_27a在卵巢癌組織中的表達高于良性組織(P = 0.039)。以上結(jié)果提示miR-27a高表達與卵巢癌的發(fā)生有關(guān)。實施例2轉(zhuǎn)染Ant1-miR-27a/miR_27a minic對卵巢癌細胞生長和遷移的影響 Ant1-miR-27a及miR_27a mimic均為常規(guī)化學合成。miR-27a mimic 序列為:5 ’ -UUCACAGUGGCUAAGUUCCGC-3 ’，5，-GGAACUUAGCCAC腳GAAUU-3，；
Ant1-miR-27a 序列為:5’-GCGGAACUUAGCCACUGUGAA-3’ ；
轉(zhuǎn)染前一天，取生長狀態(tài)良好的細胞，胰酶消化，將其接種到不含抗生素的DMEM培養(yǎng)基中，使次日轉(zhuǎn)染時細胞融合度達70%。轉(zhuǎn)染之前用PBS輕輕地沖洗細胞。
a.稀釋 miRNA mimics/inhibitor:5KL+100KL 無血清 DMEM,輕輕混勻，室溫孵育 5min ；
b.稀釋 Lipofectamine2000:lipo2000 5μ +ΙΟΟμ 無血清 DMEM，輕輕混勻，并室溫孵育 5 min。c.將a與b輕輕混勻，室溫孵育20min。d.混合液加入板內(nèi)，并補充無血清DMEM,使miRNA mimics/inhibitor終濃度為100nm/L。4 6h后吸去培養(yǎng)液，換成含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。到指定時間后，棄去96孔板中的培養(yǎng)基，加入10%的氯醋酸(TCA)IO(^L /孔，在4°C固定lh。用去離子水洗漆96孔板5次,晾干。再加入sulforhodamine B 50μ /孔,室溫孵育10 min以使細胞著色。再用1%的冰醋酸洗滌5次以除去未結(jié)合的SRB，晾干。加入IOmM Tris堿(pH10.5)100μ /孔，在平板振蕩器上振蕩5 min混勻，用酶標儀在500 nm波長處讀取吸光度值。細胞存活率用下式計算:
細胞存活率％ =(用藥組吸光度值-空白對照)/ (對照組吸光度值-空白對照)X 100%。細胞遷移實驗:卵巢癌SK0V3細胞用Ant1-miR-27a/miR-27a minic處理48 h后，消化重懸于無血清DMEM培養(yǎng)基，接種于24孔板Transwell上室內(nèi)(8 Mm孔徑)，每小室200μ (含3Χ IO4個細胞)，同時下室加入含10% FBS的培養(yǎng)基600μ 。繼續(xù)培養(yǎng)16h后，取出小室，PBS洗三次，用棉簽輕輕擦掉膜上層未穿過的細胞，小室上的聚碳酸酯膜用甲醇固定20min，再用三蒸水沖洗，晾干后0.1%結(jié)晶紫染色20min，于200倍顯微鏡下計數(shù)穿膜細胞。每膜計數(shù)上下左右中5個不同視野透過細胞數(shù)，計算平均值，每組平行3個濾膜。計算細胞相對遷移能力。細胞相對遷移率=處理組遷移細胞數(shù)/對照組遷移細胞數(shù)X 100%。通過SRB 實驗，發(fā)現(xiàn)相對于轉(zhuǎn)染了 inhibitor negative control 組，miR_27ainhibitor使細胞生長能力明顯降低(圖2A, P < 0.01)。同時,利用Transwell實驗,觀察miR-27a對細胞運動能力的影響。結(jié)果說明轉(zhuǎn)染了 miR_27a inhibitor后，與對照組相比，細胞遷移數(shù)目降低至73% (圖2B，P < 0.01)。而miR-27a minic處理細胞則可促進細胞的增殖。上述結(jié)果表明miR-27a在卵巢癌細胞中是癌基因，且可調(diào)控細胞生長及遷移。實施例3藥物(Gen)通過miR_27a為靶點的抗卵巢癌活性
Genistein 處理細胞:SK0V3 細胞給予 Gen 0，10，25，50，100，200 μ mol/L 分別處理 24，48，72h。用SRB法(方法同實施例2)檢測藥物對細胞生長的作用。藥物對細胞生長的抑制率％= [1-(用藥組吸光度值-空白對照)/ (對照組吸光度值一空白對照)]X 100%。實時定量PCR檢測miR_27a (方法同實施例1)及靶基因Sprouty2的表達。Sprouty2 反應(yīng)條件是:95°C,2min ;95°C，15s，60°C，40s，共 40 個循環(huán)；95°C, 15s,60°C, lmin ；95°C, 15s ;60°C, 15s。Sprouty2 弓丨物:上游弓丨物 5’-ATCCAGAGACAAGACATGTAC -3’ ；下游引物5’-TTCAGATGTGTTCTAAGCC-3’ 。內(nèi)參GAPDH 引物:上游引物 5’-TGTTCGACAGTCAGCCGC-3’ ；下游引物5’-GGTGTCTGAGCGATGTGGC-3’ 。Western blot檢測Sprouty2蛋白的表達。細胞經(jīng)不同濃度Genistein (O, 25,50，ΙΟΟμΜ),處理48h，每瓶按細胞量加入裂解液20(Γ300μ ，抽提細胞總蛋白?？捡R斯亮藍法測蛋白濃度后加入5XSDS上樣緩沖液，于95°C煮沸5 min，使蛋白變性，儲存于_20°C備用。SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育并ECL發(fā)光及顯影后觀察并分析結(jié)果。結(jié)果表明(圖3-6)，Gen可隨時間、劑量抑制人卵巢癌細胞的生長。當用25，50，ΙΟΟμΜ Genistein處理細胞48h后，與對照組相比，miR_27a表達水平分別降至83.1±1.9，71.1±4.6，72±8.1%。靶基因Sprouty2 mRNA表達水平則被顯著上調(diào)，分別升高至1.7，2.7, 5.7倍。Western blot實驗也發(fā)現(xiàn)用ΙΟΟμΜ Genistein處理細胞后,Sprouty2蛋白水平也被上調(diào)，與對照組相比，增至1.81倍。實施例4 miR-27a拮抗藥物Gen通過miR_27a途徑對細胞的抑制作用
為進一步明確miR-27a可作為藥物開發(fā)的靶點，給予藥物Gen處理細胞后，再利用miR-27a minic來恢復由Gen誘導的miR_27a下調(diào)。具體方法為將人卵巢癌細胞SK0V3接種于無菌六孔板，24h后細胞貼壁生長,分別轉(zhuǎn)染miR_27a mimics,mimics negative control24h (轉(zhuǎn)染方法同實施例2)。之后細胞制成懸液接種于96孔板中，貼壁后，轉(zhuǎn)染了 miR-27amimics 或mimics negative control 組，再分別加入 Genistein 100 μ mol/L 處理 48h。SRB結(jié)果(圖7)說明，外源性誘導miR-27a表達上調(diào)后，可以部分拮抗Gen的抑制細胞生長的能力。此外，對Gen致mi R_27a祀基因Sprouty2高表達的作用，miR-27a minic同樣可以部分拮抗(方法同實施例2，圖8)，該結(jié)果結(jié)合實例，明確的說明了 miR-27a是某些藥物的作用靶點。
權(quán)利要求
1.miR-27a作為藥物靶點在制備用于治療卵巢癌藥物中的應(yīng)用。
2.miR-27a在制備卵巢 癌診斷試劑盒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了miR-27a作為藥物靶點在制備用于治療卵巢癌藥物中的應(yīng)用以及miR-27a在制備卵巢癌診斷試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明根據(jù)miR-27a在卵巢癌癌組織中的表達高于卵巢良性組織這一特性，將miR-27a應(yīng)用于制備卵巢癌診斷試劑盒；同時，通過反義核酸或者藥物干擾miR-27a表達，可抑制卵巢癌細胞的生長和侵襲，可用miR-27a作為靶點設(shè)計或開發(fā)藥物，在治療卵巢癌治療中，具有重要用途。
文檔編號C12Q1/68GK103243163SQ20131016853
公開日2013年8月14日 申請日期2013年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月9日
發(fā)明者孫慶敏, 荊亞莉, 晏婷婷, 項靜英, 邱召娟, 徐琳琳 申請人:江蘇省中醫(yī)院