一種固定化酶催化生產(chǎn)胞磷膽堿鈉的方法
【專利摘要】一種固定化酶催化生產(chǎn)胞磷膽堿鈉的方法，包括如下步驟：利用分子克隆胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的大腸桿菌工程菌發(fā)酵制備胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，并提純制備胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶液；胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶的固定化；以磷酸膽堿及三磷酸胞苷二鈉為原料，由固定化胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶催化生成胞磷膽堿。本發(fā)明生產(chǎn)工藝簡單，生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)成本低，能廣泛應(yīng)用于胞磷膽堿的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】一種固定化酶催化生產(chǎn)胞磷膽堿鈉的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明涉及制藥領(lǐng)域，具體是指一種固定化酶催化生產(chǎn)胞磷膽堿鈉的方法。
【背景技術(shù)】:
[0002]胞磷膽堿鈉又稱胞二磷膽堿鈉，化學(xué)名膽堿胞嘧啶核苷二磷酸酯的單鈉鹽，一種腦代謝激活劑，為核苷衍生物，是磷酯酰膽堿的前體物質(zhì)，是卵磷脂合成所必需的輔酶，于1954年發(fā)現(xiàn)，1956年合成，1973年國內(nèi)試制成功。
[0003]胞磷膽堿鈉的藥理作用主要有:可恢復(fù)腦細(xì)胞損傷后細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)細(xì)胞膜的功能，改善神經(jīng)元的功能；降低腦血管阻力，增加腦血流量，促進(jìn)腦代謝，改善腦循環(huán)，提高腦功能；增加包括乙酰膽堿和多巴胺在內(nèi)的神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)的分泌，增強(qiáng)與意識有關(guān)的腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)功能，改善頭部外傷后或腦手術(shù)后意識障礙的意識狀態(tài)及腦電圖，促進(jìn)腦卒中偏癱病人的上肢運(yùn)動功能的恢復(fù)，對促進(jìn)大腦功能恢復(fù)、促進(jìn)蘇醒有一定作用；促進(jìn)卵磷脂生物合成和抗磷脂酶A作用，從而加速腦水腫的重吸收。增進(jìn)多巴胺能活動，調(diào)控錐體外系的生理功能。與蛋白分解酶抑制劑合用，可保護(hù)及修復(fù)胰腺組織。
[0004]臨床上胞磷膽堿鈉主要用于急性顱腦外傷和腦手術(shù)后意識障礙，治療帕金森氏綜合癥(Parkinson’s disease);神經(jīng)性耳聾；對老年性癡呆癥(Alzheimer’s disease )、抑郁癥、延緩衰老，提高學(xué)習(xí)效果和記憶力等有一定的療效。
[0005]胞磷膽堿鈉的生產(chǎn)方法包括化學(xué)合成法，微生物發(fā)酵法及酶促合成法三種方法。化學(xué)合成法，以胞苷酸(CMP)、磷酸膽堿(CP)為底物，用對甲苯磺酰氯為縮合劑，在N-二甲基甲酰胺(DMF)存在下縮合成胞磷膽堿鈉，化學(xué)合成存在反應(yīng)轉(zhuǎn)化率低，副產(chǎn)物多，生產(chǎn)成本高，環(huán)境污染嚴(yán) 重等問題；微生物發(fā)酵法是用酵母菌或產(chǎn)氨短桿菌等微生物利用葡萄糖，并添加CMP、CP等前提物發(fā)酵生成胞磷膽堿鈉，微生物發(fā)酵法存在產(chǎn)物濃度低，產(chǎn)率不穩(wěn)定等問題；酶促合成法曾有以豚鼠肝細(xì)胞勻漿提抽胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，并催化CTP與磷酸膽堿生成胞磷膽堿鈉的初步報(bào)道，但因酶的來源問題，酶促合成法無法實(shí)現(xiàn)。
【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0006]本發(fā)明的目的是提供一種旨在解決化學(xué)合成法，微生物發(fā)酵法及酶促合成法生產(chǎn)胞磷膽堿鈉的種種缺陷，生產(chǎn)工藝簡單，生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)成本低，能廣泛應(yīng)用于胞磷膽堿鈉的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的酶催化合成胞磷膽堿鈉的方法。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0008]一種固定化酶催化生產(chǎn)胞磷膽堿鈉的方法，包括如下步驟:
[0009](I)、工程菌發(fā)酵:
[0010]把分子克隆胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的大腸桿菌工程菌的種子液接種到培養(yǎng)基體系中培養(yǎng)26~32小時(shí)，所述分子克隆胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的大腸桿菌工程菌的種子液的加入體積為培養(yǎng)基體系體積的5%~10% ;期間補(bǔ)充適量的葡萄糖、蛋白胨以及酵母提取物，發(fā)酵完成后發(fā)酵液離心收集菌體。[0011](2)、制備胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶清液:
[0012]取上述菌體懸浮在磷酸緩沖液中用超聲波或勻漿儀破碎，獲得破碎液，在上述破碎液中加入硫酸銨進(jìn)行鹽析，獲得飽和度為25%~45%鹽析液，再用孔徑為100~500nm的陶瓷膜過濾器將上述鹽析液固液分離，得胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶清液，其中，所述菌體與所述磷酸緩沖液的懸浮比例為1:4~1:10。
[0013](3)、胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶清液的固定化:
[0014]上述胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶清液中加入固定化載體，攪拌固化，獲得固定化胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，所述固定化載體的加入量與胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶清液的比例為100~200克/L。
[0015]( 4 )、胞磷膽堿鈉的合成:
[0016]將含三磷酸胞苷二鈉30~80mmol/L、磷酸膽堿60~400mmol/L以及乙酸鎂10~50mmol/L的水溶液混合配制成合成反應(yīng)液,調(diào)節(jié)合成反應(yīng)液的pH值至6.0~9.0,加入固定化胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，并在10~50°C的水浴溫度下攪拌反應(yīng)4~10小時(shí)，過濾后得到的清液即為胞磷膽堿鈉液，所述固定化胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶的加入量與合成反應(yīng)液的比例為10~50g/L。
[0017](5)、提取純化
[0018]將上述胞磷膽堿鈉液經(jīng)層析分離結(jié)晶干燥，得到胞磷膽堿鈉的干品。
[0019]其中，所述分子克隆胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的大腸桿菌工程菌的分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏中心地址:北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所保藏編號為CGMCC NO:4428。
[0020]進(jìn)一步地，所述培養(yǎng)基體系中含有蛋白胨10~20g/L，酵母提取物10~20g/L，葡萄糖5~8g/L，無機(jī)鹽8~15g/L，余量為純化水，工程菌發(fā)酵發(fā)酵過程中，期間補(bǔ)充的葡萄糖的量為培養(yǎng)基體系中含有的葡萄糖的量的10-15倍，補(bǔ)充的蛋白胨的量為為培養(yǎng)基體系中含有的蛋白胨的量的50-80%，補(bǔ)充的酵母提取物的量為為培養(yǎng)基體系中含有的酵母提取物的量的50-80%。
[0021]進(jìn)一步地，所述固定化載體選自纖維素、葡萄糖凝膠、瓊脂糖、聚丙烯酰胺凝膠、多聚氨基酸、聚苯乙烯、尼龍或多孔玻璃載體的任一種。
[0022]進(jìn)一步地，所述固定化載體中含有芳香氨基或羥基或羧基或羧甲基或環(huán)氧基或氨基功能基團(tuán)中的至少一個基團(tuán)。
[0023]優(yōu)選地，胞磷膽堿鈉的合成的步驟中，固定化胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶10~50g/L，三磷酸胞苷二鈉為30~80mmol/L ;磷酸膽堿60~400mmol/L ;乙酸鎂10~50mmol/L ;反應(yīng)溫度25 ~40°C ；pH 值為 6.0 ~9.0。
[0024]優(yōu)選地，胞磷膽堿鈉的合成的步驟中，固定化胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶含量為20~30g/L，三磷酸胞苷二鈉為40~60mmol/L ;磷酸膽堿120~240mmol/L ；乙酸鎂20~30mmol/L ;反應(yīng)溫度30~40°C ；pH值為6.5~8.0。
[0025]本發(fā)明的主要技術(shù)優(yōu)越特性如下:
[0026]1.采用分子克隆胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的大腸桿菌工程菌高密度發(fā)酵制備胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，酶源穩(wěn)定，避免目前國內(nèi)普遍采用的啤酒酵母反應(yīng)體系所帶來的車間環(huán)境污染及大量廢酵母渣需處理等缺點(diǎn)。
[0027]2.采用固定化胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶催化合成反應(yīng)，可反復(fù)多次使用，反應(yīng)條件溫和容易控制，減少合成工序時(shí)間，轉(zhuǎn)化率達(dá)到90%以上，有效降低生產(chǎn)成本。
[0028]3.與傳統(tǒng)工藝相比，本發(fā)明工藝對環(huán)境友好，在節(jié)能減耗、保護(hù)環(huán)境方面有明顯優(yōu)勢。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0029]附圖1為固定化酶催化生產(chǎn)胞堿膽堿鈉流程圖；
[0030]附圖2為胞磷膽堿鈉標(biāo)準(zhǔn)品的IR圖譜；
[0031]附圖3為制得的胞磷膽堿鈉的IR圖譜；
[0032]附圖4為胞磷膽堿鈉標(biāo)準(zhǔn)品的1HNMR圖譜；
[0033]附圖5為制得的胞磷膽堿鈉的1HNMR圖譜；
[0034]附圖6為胞磷膽堿鈉標(biāo)準(zhǔn)品的13CNMR圖譜；
[0035]附圖7為制得的胞磷膽堿鈉的13CNMR圖譜；
[0036]附圖8為胞磷膽堿鈉標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜；
[0037]附圖9為制得的胞磷膽堿鈉的質(zhì)譜。
【具體實(shí)施方式】
[0038]以下通過本發(fā)明的實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明: [0039]參照附圖1，一種固定化酶催化生產(chǎn)胞磷膽堿鈉的方法，包括如下步驟:利用分子克隆胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的大腸桿菌工程菌發(fā)酵制備胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，并提純制備胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶液；胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶的固定化；以磷酸膽堿及三磷酸胞苷二鈉為原料，由固定化胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶催化生成胞磷膽堿，其中本發(fā)明中用的分子克隆胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的大腸桿菌工程菌的分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心地址:北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所保藏編號為CGMCC NO:4428,以下實(shí)施例中均采用該分子克隆胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的大腸桿菌工程菌。
[0040]實(shí)施例一
[0041]一種固定化酶催化生產(chǎn)胞磷膽堿鈉的方法，包括如下步驟:
[0042](I)、工程菌發(fā)酵:
[0043]把150ml分子克隆胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的大腸桿菌工程菌的種子液接種到3L培養(yǎng)基體系中培養(yǎng)26小時(shí)，該培養(yǎng)基體系中含有蛋白胨10g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖5g/L,無機(jī)鹽8g/L,純化水溶解期間補(bǔ)充150g葡萄糖、15g蛋白胨和15g酵母提取物；發(fā)酵完成后發(fā)酵液離心收集菌體152g。
[0044](2)、制備胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶清液:
[0045]取菌體30g，用180ml磷酸緩沖液混溶懸浮并用超聲波破碎30分鐘獲得破碎液，在破碎液中加入硫酸銨至30%飽和度進(jìn)行鹽析，然后用200nm微膜過濾除去固體物質(zhì)，獲得胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶清液205ml。
[0046](3)、胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶清液的固定化:
[0047]取上述胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶清液205ml，加入41g含環(huán)氧基的聚丙烯酰胺凝膠固定化載體，攪拌進(jìn)行固定化，獲得59g固定化胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，折合每克固定化載體固定胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶蛋白llmg。
[0048]( 4 )、胞磷膽堿鈉的合成:
[0049]配制IL合成反應(yīng)液，合成反應(yīng)液中三磷酸胞苷二鈉為80mmol/L ;磷酸膽堿400mmol/L ;乙酸鎂50mmol/L，余量為水，調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH值為7.5，加入固定化胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶50g，水浴40°C攪拌反應(yīng)10小時(shí)，過濾后獲得胞磷膽堿鈉液960ml，此三磷酸胞苷二鈉的轉(zhuǎn)化率達(dá)到88%。
[0050](5)、提取純化:
[0051]上述將上述胞磷膽堿鈉液經(jīng)層析分離結(jié)晶干燥，得到胞磷膽堿鈉的干品27g，產(chǎn)品含量99.8%。
[0052]實(shí)施例二
[0053]一種固定化酶催化生產(chǎn)胞磷膽堿鈉的方法，包括如下步驟:
[0054](I)、工程菌發(fā)酵:
[0055]把200ml分子克隆胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的大腸桿菌工程菌種子液接種到3L培養(yǎng)基體系(培養(yǎng)基體系中含蛋白胨15g/L，酵母提取物15g/L，葡萄糖8g/L，無機(jī)鹽13.5g/L，純化水溶解)中培養(yǎng)28小時(shí)，期間補(bǔ)充288g葡萄糖、30g蛋白胨和30g酵母提取物。發(fā)酵完成后發(fā)酵液離心收集菌體165g。
[0056](2)、制備胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶清液:
[0057]取菌體20g，用200ml磷酸緩沖液混溶懸浮后用超聲波破碎30分鐘，獲得破碎液，在破碎液中加入硫酸 銨至45%飽和度，然后用500nm微膜過濾除去固體物質(zhì)，獲得胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶清液218ml。
[0058](3)、胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶清液的固定化:
[0059]取胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶清液200ml，加入20g含羥基的聚苯乙烯固定化載體，攪拌進(jìn)行固定化，獲得28g固定化胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，折合每克固定化載體固定胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶蛋白17mg。
[0060]( 4 )、胞磷膽堿鈉的合成:
[0061]配制IL合成反應(yīng)液(合成反應(yīng)液中含三磷酸胞苷二鈉為30mmol/L，磷酸膽堿60mmol/L,乙酸鎂10mmol/L,余量為水),調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH值至9.0,加入固定化胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶10g，水浴25°C攪拌反應(yīng)9小時(shí)，三磷酸胞苷二鈉的轉(zhuǎn)化率達(dá)到90%，過濾后獲得的清液(胞磷膽堿鈉液)973ml。
[0062](5)、提取純化:
[0063]上述胞磷膽堿鈉液經(jīng)層析分離結(jié)晶干燥后，獲得胞磷膽堿鈉的干品llg，產(chǎn)品含量99.7%。
[0064]實(shí)施例三
[0065]胞磷膽堿鈉的制備包括如下步驟:
[0066](I)、工程菌發(fā)酵:
[0067]把300ml分子克隆胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的大腸桿菌工程菌種子液接種到3L培養(yǎng)基體系(培養(yǎng)基體系中含有蛋白胨20g/L，酵母提取物20g/L，葡萄糖8g/L，無機(jī)鹽15g/L，余量為純化水溶解沖培養(yǎng)32小時(shí)，期間補(bǔ)充360g葡萄糖、48g蛋白胨和48g酵母提取物。發(fā)酵完成后發(fā)酵液離心收集菌體187g。[0068](2)、制備胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶清液:
[0069]取菌體30g，用120ml磷酸緩沖液混溶懸浮，菌液用超聲波破碎30分鐘，獲得破碎液，在破碎液中加入硫酸銨至25%的飽和度，然后用500nm微膜過濾除去固體物質(zhì)，獲得胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶清液144ml。
[0070](3)、胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶清液的固定化:
[0071]取胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶清液144ml，加入28g含羥基的聚苯乙烯固定化載體，攪拌進(jìn)行固定化，獲得40g固定化胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，折合每克固定化載體固定胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶蛋白20mgo
[0072]( 4 )、胞磷膽堿鈉的合成:
[0073]配制IL合成反應(yīng)液(合成反應(yīng)液中含三磷酸胞苷二鈉為50mmol/L;磷酸膽堿180mmol/L ;乙酸鎂20mmol/L),調(diào)節(jié)合成反應(yīng)液的pH至8.0,加入固定化胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶30g，水浴30°C攪拌反應(yīng)4小時(shí)，三磷酸胞苷二鈉的轉(zhuǎn)化率達(dá)到91%，過濾后獲得胞磷膽堿鈉液 966ml ο
[0074](5)、提取純化:
[0075]上述胞磷膽堿鈉液經(jīng)層析分離結(jié)晶干燥后，獲得胞磷膽堿鈉的干品18.5g，產(chǎn)品含量 99.9%ο
[0076]實(shí)施例四
[0077]胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶液的制備包括如下步驟: [0078](I)、工程菌發(fā)酵:
[0079]把2.5L分子克隆胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的大腸桿菌工程菌接種到30L培養(yǎng)基體系(含蛋白胨15g/L，酵母提取物15g/L，葡萄糖8 g/L，無機(jī)鹽13.5g/L，余量為純化水)中培養(yǎng)28小時(shí)，期間補(bǔ)充2880g葡萄糖、320g蛋白胨和320g酵母提取物。發(fā)酵完成后發(fā)酵液離心收集菌體1670g。
[0080](2)、制備胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶清液:
[0081 ] 取菌體300g，用2400ml磷酸緩沖液混溶懸浮，菌液用均質(zhì)機(jī)破碎3次，在破碎菌液中加入硫酸銨至35%飽和度，然后通用孔徑500nm的陶瓷膜過濾器澄清酶液，獲得胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶清液2610ml。
[0082](3)、胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶清液的固定化:
[0083]取胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶清液2610ml，加入400g含氨基的瓊脂糖固定化載體，攪拌進(jìn)行固定化，獲得580g固定化胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，折合每克固定化載體固定胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶蛋白15mg。
[0084]( 4 )、胞磷膽堿鈉的合成:
[0085]配制IOL合成反應(yīng)液(合成反應(yīng)液中含三磷酸胞苷二鈉為60mmol/L ;磷酸膽堿200mmol/L ；乙酸鎂25mmol/L，余量為水)，調(diào)節(jié)合成反應(yīng)液的pH值至8.0,加入固定化胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶300g，水浴30°C攪拌反應(yīng)5小時(shí)，三磷酸胞苷二鈉的轉(zhuǎn)化率達(dá)到91%。過濾后獲得胞磷膽堿鈉液10.4L。
[0086](5)、提取純化:
[0087]上述胞磷膽堿鈉液經(jīng)層析分離結(jié)晶干燥后，獲得胞磷膽堿鈉的干品203g，產(chǎn)品含量 99.7%。[0088]參照附圖2-附圖9，對比樣品與制得的胞磷膽堿鈉的干品紅外吸收圖譜、核磁共振圖譜及質(zhì)譜見可知均與標(biāo)準(zhǔn)品一致。
[0089]實(shí)施例五
[0090]一種固定化酶催化生產(chǎn)胞磷膽堿鈉的方法，包括如下步驟:
[0091](I)、工程菌發(fā)酵:
[0092]把400ml分子克隆胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的大腸桿菌工程菌種子液接種到6L培養(yǎng)基體系(培養(yǎng)基體系中含蛋白胨15g/L，酵母提取物15g/L，葡萄糖8g/L，無機(jī)鹽13.5g/L，純化水溶解)中培養(yǎng)30小時(shí)，期間補(bǔ)充576g葡萄糖、60g蛋白胨和60g酵母提取物。發(fā)酵完成后發(fā)酵液離心收集菌體330g。
[0093](2)、制備胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶清液:
[0094]取菌體40g，用400ml磷酸緩沖液混溶懸浮后用超聲波破碎30分鐘，獲得破碎液，在破碎液中加入硫酸銨至40%飽和度，然后用IOOnm微膜過濾除去固體物質(zhì)，獲得胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶清液436ml。
[0095](3)、胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶清液的固定化:
[0096]取胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶清液400ml,加入40g含羧基的纖維素固定化載體,攪拌進(jìn)行固定化，獲得56g固定化胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，折合每克固定化載體固定胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶蛋白17mg。
[0097]( 4 )、胞磷膽堿鈉的合成:
[0098]配制IL 合成反應(yīng)液(合成反應(yīng)液中含三磷酸胞苷二鈉為70mmol/L，磷酸膽堿300mmol/L,乙酸鎂40mmol/L,余量為水),調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH值至6.0,加入固定化胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶10g，水浴10°C攪拌反應(yīng)8小時(shí)，三磷酸胞苷二鈉的轉(zhuǎn)化率達(dá)到90%。過濾后獲得的清液(胞磷膽堿鈉液)973ml。
[0099](5)、提取純化:
[0100]上述胞磷膽堿鈉液經(jīng)層析分離結(jié)晶干燥后，獲得胞磷膽堿鈉的干品lig，產(chǎn)品含量99.8%。
[0101]以上所述的本發(fā)明實(shí)施方式，并不構(gòu)成對本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。任何在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的權(quán)利要求保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種固定化酶催化生產(chǎn)胞磷膽堿鈉的方法，包括如下步驟: (1)、工程菌發(fā)酵: 把分子克隆胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的大腸桿菌工程菌的種子液接種到培養(yǎng)基體系中培養(yǎng)26~32小時(shí)，所述分子克隆胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的大腸桿菌工程菌的種子液的加入體積為培養(yǎng)基體系體積的5%~10% ;期間補(bǔ)充適量葡萄糖、蛋白胨和酵母提取物，發(fā)酵完成后發(fā)酵液離心收集菌體； (2)、制備胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶清液: 取上述菌體懸浮在磷酸緩沖液中用超聲波或勻漿儀破碎，獲得破碎液，在上述破碎液中加入硫酸銨進(jìn)行鹽析，獲得飽和度為25%~45%鹽析液，再用孔徑為100~500nm的陶瓷膜過濾器將上述鹽析液固液分離，得胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶清液，其中，所述菌體與所述磷酸緩沖液的懸浮比例為1:4~1:10 ; (3)、胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶清液的固定化: 上述胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶清液中加入固定化載體，攪拌固化，獲得固定化胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，所述固定化載體的加入量與胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶清液的比例為100~200克/L ； (4)、胞磷膽堿鈉的合成: 將含三磷酸胞苷二鈉30~80mmol/L、磷酸膽堿60~400mmol/L以及乙酸鎂10~50mmol/L的水溶液混合配制成合成反應(yīng)液,調(diào)節(jié)合成反應(yīng)液的pH值至6.0~9.0,加入所述固定化胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，并在10~50°C的水浴溫度下攪拌反應(yīng)4~10小時(shí)，過濾后得到的清液即為胞磷膽堿鈉液，所述固定化胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶的加入量與合成反應(yīng)液的比例為10 ~50g/L ；· (5)、提取純化: 將上述胞磷膽堿鈉液經(jīng)層析分離結(jié)晶干燥，得到胞磷膽堿鈉的干品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種固定化酶催化生產(chǎn)胞磷膽堿鈉的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基體系中含有蛋白胨10~20g/L,酵母提取物10~20g/L,葡萄糖5~8g/L,無機(jī)鹽8~15g/L，余量為純化水。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種固定化酶催化生產(chǎn)胞磷膽堿鈉的方法，其特征在于，工程菌發(fā)酵發(fā)酵過程中，期間補(bǔ)充的葡萄糖的量為培養(yǎng)基體系中含有的葡萄糖的量的10-15倍，補(bǔ)充的蛋白胨的量為為培養(yǎng)基體系中含有的蛋白胨的量的50-80%，補(bǔ)充的酵母提取物的量為為培養(yǎng)基體系中含有的酵母提取物的量的50-80%。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種固定化酶催化生產(chǎn)胞磷膽堿鈉的方法，其特征在于，所述固定化載體選自纖維素、葡萄糖凝膠、瓊脂糖、聚丙烯酰胺凝膠、多聚氨基酸、聚苯乙烯、尼龍或多孔玻璃載體的任一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種固定化酶催化生產(chǎn)胞磷膽堿鈉的方法，其特征在于，所述固定化載體中含有芳香氨基或羥基或羧基或羧甲基或環(huán)氧基或氨基功能基團(tuán)中的至少一個基團(tuán)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種固定化酶催化生產(chǎn)胞磷膽堿鈉的方法，其特征在于，胞磷膽堿鈉的合成的步驟中，固定化胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶10~50g/L，三磷酸胞苷二鈉為30~HOmmoI /I,;憐酸膽喊60~40OmmoI /I,;乙酸續(xù)10~SOmmoI /I,;反應(yīng)溫度25~40°C ;pH值為 6.0 ~9.0。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種固定化酶催化生產(chǎn)胞磷膽堿鈉的方法，其特征在于，胞磷膽堿鈉的合成的步驟中，固定化胞苷磷酸轉(zhuǎn)移酶含量為20~30g/L，三磷酸胞苷二鈉為40~60mmol/L ;憐酸膽減120~240mmol/L ;乙酸鎮(zhèn)20~30mmol/L ;反應(yīng)溫度30~40°C;pH值為6.5~8.0。`
【文檔編號】C12R1/19GK103849666SQ201310167034
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2013年5月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月8日
【發(fā)明者】劉桂禎, 黃炯威, 周華潤, 莫世藝, 勞瑞雄 申請人:開平牽牛生化制藥有限公司