專利名稱：一種豬圓環病毒2型快速分型檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種豬圓環病毒2型快速分型檢測試劑盒，屬于生物檢測領域。
背景技術：
豬圓環病毒(porcine circovirus type2, PCV-2)屬于圓環病毒科，直徑僅為17nm，無囊膜，二十面體對稱，共價閉合環狀單股DNA病毒。PCV-2是引起仔豬斷奶后多系統衰竭綜合征(postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)的主要病原，該病自1991年在加拿大豬群中首次爆發以后，在全球各國豬群中廣泛流行，給世界養豬業造成了巨大的經濟損失。PCV-2常與豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductiveand respiratory syndrome virus, PRRSV)、豬細小病毒(porcine parvovirus, PPV)、豬偽狂犬病毒(pseudorabies virus, PRV)、副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis, HPs)、豬胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae, App)和豬巴氏桿菌(swinepasteurellosis, Sp)等諸多病原并發或繼發感染，增加了其防治難度。除了引起PMWS以外，PCV-2還會導致育肥豬皮炎與腎病綜合征(porcine dermatis and nephropathysyndrome, FONS)、豬呼吸道綜合征(porcine respiratory disease complex, PRDC)、增生性壞死性肺炎(proliferativenecrotising pneumonia, PNP)、新生仔豬的腹灣病等綜合征以及豬體內免疫抑制，因而很難進行有效的藥物治療，再加上與之同源性很高且無致病力的PCV-1的存在，無疑為PCV-2感染的準確診斷及有效防控增加了難度。在2000年初，PCV-2已經成世界性流行,給世界各養豬生產大國(North and South America, Europe, andAsia)造成了巨大的經濟損失。諸多數據表明，盡管PCV-2在我國各地區豬群中的感染陽性率不盡相同，但其在我國豬群中廣泛存在已是不爭的事實，已經給豬群的健康構成重大威脅。目前我國豬群中PCV-2呈現多基因型混合感染，不同基因型毒株共存，已報道的包括PCV2A、PCV2B、PCV2D、PCV2C。4株不同基因型毒株，它們的核心區序列未發生改變，突變存在于外表面(Cap蛋白氨基酸)，因此不同基因型毒株的抗原性存在一定差異。豬圓環病毒分為2個血清型，PCVl和PCV2。其中PCVl型不引起臨床癥狀，廣泛存在于正常豬體各器官組織及豬源細胞。PCV2對各種年齡的家豬和野豬均有致病性。與血清型分類相對應，豬圓環病毒基因組也分為2種基因型，即PCVl型基因組和PCV2型基因組。PCV2型基因組全長為1766bp、1767bp或1768bp，通常含有11個0RF，其中0RF1、0RF5、0RF7 和 0RF10 在病毒鏈上，而 0RF2、0RF3、0RF4、0RF6、0RF8、0RF9 和 0RF11 在互補鏈上，這些基因表現為重疊基因，從而充分利用了病毒有限的遺傳物質。ORFl和0RF2是2個主要的開放閱讀框，分別編碼與病毒復制有關的蛋白和病毒的衣殼蛋白(Cap)。在ORFl和0RF2的中間區域是病毒DNA的復制起始區(Ori)莖環序列，在病毒的蛋白合成、DNA自身復制及子代病毒產生中發揮重要作用。對PCV2的基因組分析發現，所有PCV2分離株的基因組同源性都在90%以上，但與PCVl的核苷酸同源性卻只有68% 79%。PCVl和PCV2間與復制相關的DNA復制起始區和復制酶編碼基因(r印)序列的同源性分別約為79.5%和82% ；但其衣殼蛋白編碼基因(cap)存在較大差 異，同源性只有約62%。
歐盟豬圓環病毒病委員會提出的將PCV2分為PCV2a、PCV2b、PCV2c三種基因亞型的分類方法被廣泛接受，其分型的基本原則是全基因遺傳距離大于0.02和0RF2基因遺傳距離大于0.035，其中PCV2a和PCV2b是目前存在的主要基因型。基因型與致病力的關系目前也成為PCV2研究的熱點，Grau-Roma等發現PMWS發生的豬群中分離到的PCV2多屬于PCV2b(原文中命名為genotypel)，而從健康豬群和有輕微消瘦癥狀的豬分離到的PCV2多屬于PCV2a(原文中命名為genotype2)，結果提示PCV2存在不同毒力的毒株.且基因分型可能對判斷疾病流行狀況有很大幫助。而且系統進化分析顯示，PCV2a型毒株在出現時間上早于PCV2b型的毒株，許多國家也發現隨著PMWS的不斷暴發，出現了由PCV2a向PCV2b基因型轉換的現象。此外有人還發現在同一豬體內分離到多個PCV2分離株，目這些分離株分屬不同的基因型，此現象提示基因重組可能在PCV2遺傳進化中起到重要作用。按照歐盟豬圓環病毒病委員會的分類方法.我國目前的PCV2分離株多屬于PCV2b亞型。豬PCV-2的檢測與診斷是疫病防治的前提，豬PCV-2的分型檢測與診斷對后續疫苗的研究、正確使用及治療等具有指導性意義。但由于PCV-2病原體的加速突變和在豬場中多基因型PCV-2混合感染的特點，傳統的醫學檢測手段(普通PCR、ELISA等)已經無法檢測到新型病原體的突變體和分型系統檢測與診斷，而分子生物學技術和熒光定量檢測技術的飛速發展，為新型病原體及其突變體的定性和定量檢測提供了可能。目前實時定量PCR (real time PCR, qPCR)可以實現PCV2快速的測定，已有學術文章和專利報道，PCV2實時定量PCR反應體系常包含四個組分:(I)反應液(master mix),通常有緩沖液，鎂離子，酶，和dNTP等；⑵被測的病毒核酸染色體(target DNA), (3)引物(primers), (4)探針(probe),最常用的探針是TaqMan探針。但PCV2實時定量PCR反應體系檢測體系中，由于引物的特異性不夠，所以需要探針來保證反應特異性。探針通常需熒光標記，即探針寡聚核苷酸(oligo nucleotide)需偶聯一個突光基團(fluorophore),和一個淬滅基團(quencher)。從合成角度上看，熒光探針合成的難度比引物合成大，所以，探針在市場上的價格常高于引物十倍。
發明內容
本發明的目的是提供一種簡便快速的豬圓環病毒2型快速分型檢測試劑盒，該檢測試劑盒是基于SMART測定體系方法的試劑盒。一種豬圓環病毒2型快速分型檢測試劑盒，該檢測試劑盒是基于SMART測定體系方法的試劑盒，包括以下三對引物:
正向引物反向引物
PCV2a GCGTTCTGACTGTGGTTCGC CCTCTCCTGCACCTTCGGATATAC
PCV2b GGGCGTTCTGACTGTGGTTTTC CCTCTCCTGCACCTTCGGATATAC
PCV2c GGCGTTCTGACTGTGGTAGCC
CCTCTCCTGCACCTTCGGATATAC 。在SMART測定體系中，由于引物的特異性極強，所以無需要探針可以達到反應的高度特異性的要求，SMART檢測體系包含具有高熒光強度、高反應特異性EvaGreen和能增強反應特異性的CrystalTaq。我們SMART檢測體系包含的PCV2a，PCV2b, PCV2c引物序列中反向引物是三種基因型都共有的，而正向引物可以區分PCV2a，PCV2b，PCV2c。如圖1，圖2，圖3所示，SMART檢測體系在三種基因型之間沒有交叉反應，而用普通體系(SYBR GreenERSuper Mix, Life Technologies, Carlsbad, California, USA)會存在不同程度的交叉反應。所以，常規體系必須使用價格昂貴的探針來保證反應的特異性。也就是說，SMART系統應用更為簡單的系統達到了復雜系統(常規體系)的目的。而且應用探針的常規體系也會有另一個問題:其檢測體系(實驗試劑盒)需要包括陽性對照的樣品，以檢驗試劑盒的反應液、引物和探針是否有效。在上述三種成分中，任何一種失效就會使反應失效。陽性對照樣品通常是人造核酸來模擬實際檢測目標。但是這種模擬實際檢測目標一旦污染了反應系統，就無法區分陽性對照樣品和實際樣品(由于熒光信號都一樣)。如果一定要區分，就需要打開每個反應試劑，做進一步檢驗，但這一步驟會增加污染的機會。而在我們的SMART檢測體系，人造模擬核酸和實際靶標DNA采用同樣的引物進行擴增，但長度不一樣，所以有同樣的PCR放大曲線，但人造模擬核酸在熔解曲線上和實際的靶標DNA不一樣。依據這一點，可以準確判定是污染還是真正的陽性信號(圖4)。
圖1 為 PCV2a SMART PCR 反應和 SYBR GreenER 普通 PCR 檢測比較；圖2 為 PCV2b SMART PCR 反應和 SYBR GreenER 普通 PCR 檢測比較；圖3 為 PCV2c SMART PCR 反應和 SYBR GreenER 普通 PCR 檢測比較；圖4為人造模板和實際模板的Tm比較。
具體實施例方式以下結合實施例旨在進一步說明本發明，而非限制本發明。
實施例1，在實時SMART熒光定量定性PCV。步驟1:在PCR實時反應管a中，加入10μ 12X SMART Master Mix(其中包括EvaGreen熒光染料，SMART緩沖系統，SMART Taq，dNTP,鎂離子)，500nM PCV2a正向引物和PCV2a反向引物，和I μ I待測核酸樣品，用純水把總反應容積加到20 μ I。步驟2:在PCR實時反應管b 中，加入 10 μ 12Χ SMART Master Mix,500nM PCV2b 正向引物和PCV2b反向引物，和I μ I待測核酸樣品，用純水把總反應容積加到20 μ I。步驟3:在PCR實時反應管 c 中，加入 10 μ 12Χ SMART Master Mix,500nM PCV2c 正向引物和PCV2C反向引物，和I μ I待測核酸樣品，用純水把總反應容積加到20 μ I。步驟4:把以上三個管子放置在ΑΒΙ7500 (或是ΑΒΙ7900，或是BioRad, Bioer, Roche,相似功能的儀器)里進行實時PCR放大。反應的溫度條件為:95 °C 2分鐘熱啟動，在95°C 15s 和 65°C 30s 之間循環 40 次。在65 °C檢測熒光。實施例2，在實時熒光定量PCR法中SMART具有更高特異性本發明比較了 SMART PCR反應和以SYBR GreenER為代表的普通PCR的特異性。結果如圖1所示。圖1的上幅顯示了 IOyLSMART PCR反應體系中含有250nM，用來檢測PCV2a的正負引物(表I所示)，和分別為一百萬個拷貝的PCV2a，或是PCV2b，或是PCV2c，或是NTC.圖1的下幅顯示了 10 μ L的SYBR GreenER為代表的普通反應體系中含有250ηΜ濃度用來檢測PCV2a的正負引物(表I所示)，和分別為一百萬個拷貝的PCV2a，或是PCV2b，或是 PCV2c,或是 NTC.
表I
權利要求
1.一種豬圓環病毒2型快速分型檢測試劑盒，其特征在于，該檢測試劑盒是基于SMART測定體系方法的試劑盒，包括以下三對引物: 正向引物反向引物 PCV2a GCGTTCTGACTGTGGTTCGC CCTCTCCTGCACCTTCGGATATAC PCV2b GGGCGTTCTGACTGTGGTTTTC CCTCTCCTGCACCTTCGGATATAC PCV2C GGLGTTCTGACTGTbGTAGCCCCTCTCCTGCACCTTCGGATATAC 。
全文摘要
本發明涉及了一種豬圓環病毒2型快速分型檢測試劑盒。屬于生物檢測領域，是一種基于SMART測定體系方法的試劑盒，解決了豬圓環病毒2型(PCV2a、2b、2c、2d等)分型檢測方法操作程序復雜、需要較高的實驗技能、實驗周期較長等的技術問題，可為豬圓環病毒2型分型提供一種快速和準確的分子診斷技術產品。本發明能用于豬圓環病毒2型快速分型的系統診斷，指導該病預防和治療，同時可實現該病毒各型序列突變的檢測，將有助于豬圓環病毒的分子流行病學調查、肉類食品檢疫以及豬場飼料、水質的病毒監測等。
文檔編號C12R1/93GK103225001SQ201310162390
公開日2013年7月31日 申請日期2013年5月6日 優先權日2013年5月6日
發明者楊毅, 忻星, 王乃東, 鄧治邦, 薛立群, 湛洋, 首易君 申請人:楊毅