專利名稱：一種對蝦細胞培養基的制作方法
技術領域：
本發明屬于動物細胞、組織培養技術領域，具體涉及一種新型對蝦細胞培養基。
背景技術：
對蝦病毒病的頻繁爆發一直是困擾對蝦養殖業并亟待解決的一個難題，而對蝦永生性細胞系是分離和純化對蝦病毒、研究病毒的致病機理、發展有效的診斷試劑和防控技術以及生產高效的病毒疫苗等的有利工具和研究手段。盡管國內外專家學者在對蝦細胞的體外培養和建系上進行了大量的探索和不懈的努力，但目前對蝦的細胞培養仍然處于原代培養水平，永生性的細胞系一直未成功建立。而找到有效的對蝦細胞培養基，是實現對蝦細胞成功建系的關鍵。目前，對蝦細胞培養并沒有專門商業化的培養基。大部分研究者利用哺乳動物和昆蟲的商品化人工培養基為基礎培養基，同時添加血清和其它營養因子來開展對蝦的細胞培養工作。例如 Leibovitz (L-15)、M199、MEM、TC199、Grace 培養基、TC-100、LHM,CMPLT和RPM1-1640等培養基都曾被用于對蝦的細胞培養研究。其中以L-15培養基，尤其是2XL-15培養基的培養效果最好，應用最為廣泛。Purushothaman等(1998)在印度對蟲下(Penaeus indicus)和斑節對奸(P.monodon)的原代培養中發現,在添加10%小牛血清的條件下，L-15培養基(IX )的培養效果比MEM好。Goswami等(2009)采用L-15培養基(I X )為基礎培養基，同時添加20%胎牛血清(FBS)、1%蝦血清、0.1%葡萄糖和0.5%NaCl，開展了羅氏沼奸(Macrobrachium rosenbergii)的心臟組織塊原代培養,2周后觀察到心肌細胞的遷出，并最終獲得原代培養細胞單層。Nadala等(1993)采用2XL-15培養基為基礎培養基，同時添加20%FBS、8%蝦肌肉提取液和20 ng/mL表皮生長因子(EGF)，成功開展了南美藍對奸(P.stylirostris)和南美白對奸(P.vannamei)的淋巴組織塊原代培養,并在I周后獲得了原代培養細胞單層。但是同樣添加了胎牛血清、蝦肌肉提取液和EGF生長因子的其它基礎培養基如M199、RPMI1640和Grace昆蟲培養基則沒有得到滿意的培養效果。Ellender等(1992)采用2XL-15培養基(添加20%FBS)成功培養了南美白對蝦的血細胞。Hu等(2008)采用2XL-15培養基為基礎培養基，同時添加20%FBS、5 g/L NaCl、0.75g/L NaHCO3,1%葡萄糖和20 μ g/mL堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)，也成功開展了中國對蟲下(P.chinensis)的淋巴組織塊原代培養和永生性轉化研究。也有研究者通過分析和了解對蝦血淋巴的營養組成、pH值和滲透壓，然后模擬蝦血淋巴來設計對奸細胞培養基。例如，Shimizu等(2001)根據南美藍對奸血淋巴的營養組成設計了 2個分別以M199和0.2XL-15為基礎培養基的對蝦細胞培養基，用于對蝦卵巢組織的原代培養，并且與2 X L-15培養基(添加20%FBS)的培養效果進行了比較。發現，新設計的2個培養基的培養效果優于2XL-15培養基。最近，Jayesh等(2012)也根據斑節對蝦的血淋巴營養組成設計了一個新的對蝦細胞培養基，并發現其培養效果優于2XL-15和Grace昆蟲細胞培養基。總的來說， 不同研究者所采用的對蝦細胞培養基的配方大都是不一樣的，其培養效果也基本上沒有被其它研究者所重復，而且獲得對蝦原代培養細胞單層的成功率不高。盡管有人報道所得到的對蝦體外培養細胞可在體外存活幾個月，但所維持的往往是少量對蝦細胞，而不是健康的連續性細胞單層，因而對于對蝦細胞建系的幫助不大。因此，有必要提供一種更有效的對蝦細胞培養液。
發明內容
本發明的目的是提供一種新型對蝦細胞培養基配方，據此配方配制的培養基可用于對蝦細胞的體外培養，并能更好地維持體外培養對蝦細胞的存活和生長，從而彌補現有技術的不足。本發明的對蝦細胞培養基的保存液，是以1.5XL-15培養基為基礎培養基，并添加如下終濃度的組分:體積比為10%的對蝦肌肉提取液、5 g/L NaCl,2 g/L葡萄糖、lg/LNaHC03、10 μ g/mL牛磺酸、10 μ g/mL脯氨酸、100 IU/mL青霉素鈉和100 μ g/mL硫酸鏈霉素；pH 為 7.3-7.5。其中對蝦肌肉提取液的制備方法如下:將對蝦肌肉用2.4% NaCl溶液作為緩沖液勻漿后，于60°C水浴I小時，然后轉移到離心管中，低溫離心收集上清，濾膜過濾除菌完成制備。
其中對蝦肌肉和2.4% NaCl溶液的質量體積百分比為1:3 ；所述的低溫離心為4°C,9000 rpm離心1.5小時；本發明的對蝦細胞培養基的工作液，是在保存液中還添加有終濃度如下的組分:體積比為15%的胎牛血清(FBS)、20ng/mL堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和20 ng/mL表皮生長因子(EGF)，培養基滲透壓為621 ±20 m0sm/kg，pH值為7.3-7.5。本發明所涉及的新型對蝦細胞培養基保存液的配制方法如下:在I升超純水中溶解20.55 g L-15培養基、5 g NaCl,2 g葡萄糖、I g NaHCO3'0.01 g牛磺酸、0.01 g脯氨酸、100 mL蝦肌肉提取液、1.0XlO5 IU青霉素鈉和100 mg硫酸鏈霉素，調節pH值至7.3-7.5 ；在無囷條件下，用0.22 μ m濾I旲將培養基過濾除囷后完成保存液的制備。應用本發明所設計的對奸細胞培養基開展基圍奸(Metapenaeus ensis,又稱刀額新對蝦)的淋巴組織塊原代細胞培養，(O能夠使對蝦原代培養組織塊中的細胞快速遷出，在組織塊接種后2-3小時內啟動細胞的遷出；(2)快速獲得對蝦原代培養細胞單層，可在組織塊接種后16-24小時內形成70%-80%匯合度的細胞單層；(3)能夠使原代培養組織塊被重復接種和利用；(4)不破壞所培養對蝦細胞的病毒敏感性。
圖1:本發明所設計的對蝦細胞培養基與Shimizu對蝦細胞培養基和2XL-15培養基的基圍蝦淋巴組織塊原代細胞培養的培養效果比較；其中:1-1、1_2和1-3分別表示用Shimizu對蝦培養基培養對蝦淋巴組織原代細胞生長6小時、24小時和36小時的生長狀態；2-U2-2和2-3分別表示用2XL-15培養基培養對蝦淋巴組織塊原代細胞生長6小時、24小時和36小時的生長狀態；3-1、3_2和3-3分別表示用本發明所設計的對蝦細胞培養基培養對蝦淋巴組織塊原代細胞生長6小時、24小時和36小時的生長狀態；圖2:本發明所設計的對蝦細胞培養基培養基圍蝦的淋巴組織原代細胞可存活超過25天的細胞圖；圖3:基圍蝦淋巴組織塊的重復利用；對蝦淋巴組織塊原代培養3天后重新懸浮，并接種到新的培養板上后貼壁生長24小時(A)和4天(B)時的細胞生長圖；圖4:基圍蝦淋巴組織原代培養細胞接種200yL白斑病毒(WSSV)(滴度為
4X IO6/μ L)后細胞病變效應的光鏡照片，其中C0、C1、C2和C3分別為對蝦淋巴組織原代細胞單層接種PBS (對照)后O天、I天、2天和5天時的細胞生長光鏡照片；V0、V1、V2和V3分別為對蝦淋巴組織原代細胞單層接種病毒滴度為4X IO6的WSSV病毒液后O天、I天、2天和5天時的顯微圖。
具體實施例方式本發明的對蝦細胞培養基在組分的選擇、濃度的配比上進行了長期的研究，使各組分之間充分發揮互配效果，從而得出了本發明。本發明使用到了對蝦肌肉提取液，其具體制備方法如下:取活對蝦，酒精棉球消毒體表后，無菌條件下，去除頭、尾和腸以及甲殼，取肌肉放入500 mL體積大燒杯中，稱重，然后按照Ig組織:3 mL緩沖液的比例加入2.4% NaCl溶液，并用電動勻漿器將肌肉打成漿狀。于60°C水浴I小時，期間晃動瓶子混勻數次。然后轉移到50 mL離心管中，4°C，9000rpm離心1.5小時。收集上清，先后用0.45 μπι濾膜和0.22 μπι濾膜過濾除菌，_20°C儲存備用。 制備20 Pg/mL bFGF母液。具體制備方法如下:取1.5 mL滅菌離心管，稱取20Pg bFGF粉末，然后加入I mL PBS緩沖液(配方:每升超純水中溶解3.0 g Na2HPO4.Iffi2O,0.2 g KH2PO4, 8.0 g NaCl 和 0.2 g KCl，pH 7.2)，顛倒混勻溶解后，用 0.22 μπι 針式濾器過濾除菌，_20°C儲存備用。使用時，每100 mL對蝦培養基保存液添加100 PL該bFGF母液(20 Pg/mL)。制備20 Pg/mL EGF母液。具體制備方法如下:取1.5 mL滅菌離心管，稱取20 μδEGF粉末，然后加入I mL PBS緩沖液(配方同上)，顛倒混勻溶解后，用0.22 μ m針式濾器過濾除菌，_20°C儲存備用。使用時，每100 mL對蝦培養基保存液添加100 μ 該EGF母液(20 Pg/mL)。配制本發明所涉及的新型對蝦細胞培養基保存液。具體配制方法如下:在I升超純水中溶解20.55 g L-15培養基、5 g NaCl,2 g葡萄糖、I g NaHC03、0.01 g牛磺酸、0.01g脯氨酸、100 mL蝦肌肉提取液、1.0XlO5 IU青霉素鈉和100 mg硫酸鏈霉素，調節pH值至7.3-7.5。在無菌條件下，用0.22 μπι濾膜將培養基過濾除菌后，分裝于100 mL血清瓶，85 mL/瓶，4°C保存或_20°C凍存。本發明對蝦細胞培養基工作液的一種配制方法如下:取85 mL對蝦細胞培養基保存液，在超凈工作臺內，加入15 mL FBSUOO μ 20 Pg/mL bFGF母液和100 μ 20 Pg/mLEGF母液，混勻，4°C保存備用。應用本發明所設計的對奸細胞培養基開展了基圍奸(Metapenaeus ensis)的淋巴組織塊原代細胞培養，分析其培養效果，并與Shimizu對蝦培養基和2 X L-15培養基的培養效果進行了比較。結果表明，本發明的對蝦細胞培養基的培養具有很好的效果(圖1 )，細胞從組織塊中遷出的時間最早(可在組織塊接種后2-3小時開始遷出)；細胞生長最快，細胞單層達到70%-80%匯合度所需時間最短(約為組織塊接種后16-24小時)；細胞貼壁緊，狀態好，生長壽命長達28±3天(圖2)。而Shimizu對蝦培養基和2XL-15培養基則分別需要72-96小時和48-60小時才能形成70%-80%匯合度的細胞單層，細胞壽命也短得多，分別為10±4天和15±3天。Shimizu對奸培養基的來源和配方:Shimizu等(2001)根據南美藍對奸血淋巴的營養組成所設計的對蝦細胞培養基，配制方法如下:在I升超純水中溶解2.74 g L-15培養基、16 g NaCl、l g葡萄糖、0.45 g KC1、0.014 g ZnCl2、0.85 g MgCl2U.22 g CaCl2,30 mLPBS,0.04 g 賴氨酸、0.1 g 谷氨酰胺、0.08 g 牛磺酸、0.08 g 脯氨酸、150 mL FBSU.0X105IU青霉素鈉和100 mg硫酸鏈霉素，20 μδ bFGF和20 μδ EGF, pH值7.3_7.5，滲透壓為697 ±20 mOsm/kg。2 X L-15培養基的配方:在I升超純水中溶解27.4 g L-15培養基、5 g NaClU g葡萄糖、I g NaHC03 、100 mL 蝦肌肉提取液、150 mL FBS,20 μδ bFGF,20 μδ EGF、1.0X IO5IU青霉素鈉和100 mg硫酸鏈霉素，pH值7.3-7.5，滲透壓為747 ±20 mOsm/kg。使用結果還表明，本發明的對蝦培養基可支持對蝦淋巴組織塊重復貼壁后細胞的生長和存活，提高了對蝦淋巴組織塊的利用率，從而可以更快地獲得較多的對蝦原代培養細胞(圖3)。另外，本發明的對蝦培養基中生長的對蝦原代培養淋巴細胞仍保留對對蝦白斑病毒(WSSV)的敏感性。結果發現，本發明所設計的對蝦培養基培養的對蝦原代培養淋巴細胞對WSSV具有敏感性，病毒接種后第4天可看到明顯的細胞病變效應，因而所培養的對蝦細胞可用于該病毒的相關研究(圖4)。
權利要求
1.一種對蝦細胞培養基的保存液，所述的保存液是以1.5XL-15培養基為基礎培養基，并添加如下終濃度的組分:體積比為10%的對蝦肌肉提取液、5 g/L NaCl,2 g/L葡萄糖、lg/L NaHCO3UO μ g/mL 牛磺酸、10 μ g/mL 脯氨酸、100 IU/mL 青霉素鈉和 100 yg/mL 硫酸鏈霉素；pH為7.3-7.5。
2.如權利要求1所述的保存液，其特征在于所述的對蝦肌肉提取液，是將對蝦肌肉用2.4% NaCl溶液作為緩沖液勻衆后,于60°C水浴I小時，然后轉移到離心管中，低溫離心收集上清，濾膜過濾除菌完成制備。
3.如權利要求2所述的保存液，其特征在于所述的對蝦肌肉和2.4% NaCl溶液的質量體積百分比為1:3。
4.如權利要求2所述的保存液，其特征在于所述的低溫離心為4°C，9000rpm離心1.5小時。
5.一種對蝦細胞培養基的工作液，其特征在于，所述的工作液是在權利要求1所述的保存液中添加有終濃度為15%的胎牛血清、20 ng/mL堿性成纖維細胞生長因子和20 ng/mL表皮生長因子。
6.權利要求1所述的保存液的配制方法如下:在I升超純水中溶解20.55 g L-15培養基、5 g NaCl>2 g葡萄糖、I g NaHCO3、0.01 g牛磺酸、0.01 g脯氨酸、100 mL奸肌肉提取液、1.0 X IO5 IU青霉素鈉和100 mg硫酸鏈霉素，調節pH值至7.3-7.5 ;在無菌條件下，用0.22 μπι 濾膜將培養基過濾除菌后完成保存液的制備。
全文摘要
本發明涉及一種新型對蝦細胞培養基配方，據此配方配制的培養基可用于對蝦細胞的體外培養。本發明所設計的對蝦細胞培養基可以很好地維持對蝦細胞在體外的存活和生長，細胞貼壁緊，外形舒展；用于對蝦淋巴器官的組織塊原代培養時，可啟動淋巴細胞在3小時內從組織塊中向外遷移，并在1-2天內形成連續性細胞單層；該培養基不破壞所培養對蝦細胞的病毒敏感性。
文檔編號C12N5/07GK103232969SQ20131016235
公開日2013年8月7日 申請日期2013年5月6日 優先權日2013年5月6日
發明者郭華榮, 韓倩 申請人:中國海洋大學