抗人her2和人igf-ir的雙特異性抗體及其制備方法和用途

抗人her2和人igf-ir的雙特異性抗體及其制備方法和用途
【專利摘要】本發明提供一種抗人HER2和人IGF-IR的雙特異性抗體，包含特異性結合HER2的第一抗原結合域和特異性結合IGF-IR的第二抗原結合域，第一和第二抗原結合域都由一對抗體重鏈可變結構域(VH)和抗體輕鏈可變結構域(VL)組成；第一抗原結合域為可與HER2特異性結合的抗體可變區結構域；第二抗原結合域為可與IGF-IR特異性結合的抗體可變區結構域。制備方法主要包括：合成編碼所述抗體的cDNA序列；將cDNA序列插入工具載體，構建表達載體；將表達載體在宿主細胞中表達和分離純化表達的雙特異性抗體。本發明用于制備治療人類癌癥尤其是人類乳腺癌的藥品。
【專利說明】抗人HER2和人IGF-1R的雙特異性抗體及其制備方法和用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物制藥【技術領域】，具體涉及一種抗人類表皮生長因子受體2 (HER2)和人胰島素樣生長因子-1受體(IGF-1R或IFG-1R)的雙特異性抗體及其制備方法和用途。
【背景技術】
[0002]細胞表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)酪氨酸激酶受體家族共有四種受體，包括 erbBl (EGFR 或 HER1)、erbB2 (HER2/neu)、erbB3 (HER3)和 erbB4 (HER4)。這類受體是一種跨膜受體，其細胞外片段與配體結合后(除HER2以外)形成同源性二聚體或異源性二聚體而被激活，其細胞內片段具有酪氨酸激酶活性。細胞外片段有四個區域，I區和III區與配體結合，而富含半胱氨酸的II區與IV區參與受體的二聚化(Hynes NE & LaneHA.Nat Rev Cancer.2005 ；5(5):341-54.)。HER2的表達狀況直接影響上皮細胞的增殖、分化和存活。已有的臨床研究發現在正常乳腺組織中HER2呈低表達，但是約有20%~30%人類乳腺癌患者伴有HER2的過度表達。過度表達的HER2向細胞核發送很強的生長刺激信號，腫瘤中HER2越多，腫瘤的侵襲性越強。
[0003]赫賽汀(Herceptin, trastuzumab)是美國Genentech公司和UCLA聯合研發的HER2蛋白的人源化單克隆抗體，1998年9月FDA批準上市用于治療HER2陽性的轉移性乳腺癌。Herc印tin能結合到HER2/neu受體的細胞外片段參與受體二聚化的第四區域，它通過與HER2特異性結合，阻斷受體激活后的細胞信號傳遞，進而抑制依賴`HER2過度擴增的腫瘤細胞生長甚至使腫瘤消退(Nahta et al.Curr Pharmacogenomics Person Med.2009 ；7:263-274.)。Here印tin的早期臨床研究顯示，它能把晚期(轉移性)乳腺癌的總體存活率從20.3個月增加到25.1個月。可是，雖然Herc印tin對HER2有很大的親和性，而且Herc印tin毒性小可以大劑量使用，但是60-70 %的HER2陽性病人對單一 Herc印tin不起作用(Lu et al.J Natl Cancer Inst.2001 ；93 (24):1852-7.；Vogel et al.J ClinOncol.2002 ；20(3):719-26.)。事實上，幾乎所有的乳腺癌病人在接受Herceptin治療一年內都會對Herceptin產生耐藥性，使得腫瘤極具侵襲性而且更可能在全身擴散(BaselgaJ.Eur J Cancer.2001 ；37 (Suppll):18-24.)。耐藥的機理有多種，包括磷酸酶和張力蛋白同系物 PTEN (phosphatase and tension homo log)失活，或者存在變異的 HER2 (p95HER2,沒有細胞外區域)，或者通過激活其他酪氨酸激酶受體，例如IGF-1R。
[0004]膜島素樣生長因子(insulin-likegrowth factor-1, IGF-1 或 IFG-1)信號途徑不僅在乳腺的正常發育中起到一定作用，也能調節乳腺癌的發生、存活、發展和轉移以及藥物耐受性(Carboni et al.Cancer Res.2005 ；65 (9):3781-7 ;Dunn et al.CancerRes.1998 ；58 (15):3353-61 ;Nahta et al.Cancer Res.2005 ；65 (23):11118-28 ;Lu etal.J Natl Cancer Inst.2001 ;93 (24):1852-7.)。胰島素樣生長因子受體(IGF-1R 或IFG-1R)也是一種酪氨酸激酶受體，是一種由兩條多肽鏈組成的四聚體受體，每條肽鏈由細胞外的α-亞基和跨膜的亞基組成，胞外的α-亞基與配體結合，而胞內部分的的β-亞基具有酪氨酸激酶功能，α-亞基之間以及α-亞基與β-亞基之間有二硫鍵連接(Ullrich et al.EMBO J.1986 ；5(10):2503-12.)。與其配體 IGF-1 結合后，IGF-1R 引起胰島素受體底物I(IRS-1)磷酸化，從而介導激活多種下游的信號網絡，包括促進細胞分裂的信號通路(Ras/Raf/MAPK)和抗細胞凋亡/生存通路(PI3K_Akt/mT0R)。這些信號通路的激活具有促進細胞分裂、分化和防止細胞凋亡的作用，還能促進血管新生和腫瘤細胞的侵潤，在多種癌癥如乳腺癌、前列腺癌和肺癌的發病機理過程中起著很重要的作用。同時IGF-1R的抗細胞凋亡作用使得癌癥細胞能抵抗化療藥物或者放療的殺腫瘤細胞作用。在乳腺癌方面，IGF-1R的高表達發生在大約40%的病人中；當用了 EGFR抑制劑如erlotinib或者HER2抗體Herc印tin來抑制EGFR/HER2的信號通路以后，IGF-1R參與形成異源性二聚體，允許EGFR/HER2信號通路在存在EGFR/HER2抑制劑的情況下重新被激活，從而使腫瘤細胞對EGFR/HER2抑制劑產生抗藥，這個過程被稱之為HER和IGF-1R之間的串話(cross-talk)(Jin & Esteva.JMammary Gland Biol Neoplasia.2008 ; 13 (4):485-98.)。Lu 等利用兩種人乳腺癌細胞系MCF-7/HER2-18和SKBR3，證明了 IGF-1R在Herc印tin耐藥性中的重要作用。在共同過度表達HER2/neu受體和IGF-1R的MCF-7/HER2-18細胞上，Herc印tin只有在IGF-1R信號傳導被抑制的情況下才有明顯的抑制細胞生長作用。而在主要過度表達HER2/neu受體但很少表達IGF-1R的SKBR3細胞上，Herceptin的抑制細胞生長作用非常明顯，且不受IGF-1濃度的影響。當SKBR3細胞的基因被改變而高表達IGF-1R，并且與IGF-1 —起培養時，Herc印tin則失去了抑制細胞生長的作用。培養液中加入IGF-結合蛋白_3后，Herceptin 又恢復了抑制作用(Lu et al.J Natl Cancer Inst.2001 ；93 (24):1852-7.)。因此IGF信號途徑的抑制已逐漸成為乳腺癌治療的一個重要靶點，這些藥物可以直接用來治療乳腺癌，也可以幫助逆轉Herceptin的耐藥性，如輝瑞研發的一種抗IGF-1R的單克隆抗體Figitumumab (也叫CP-751871)，被開發用于治療多種癌癥例如腎上腺皮質癌和非小細胞型肺癌(NSCLC) (Gualberto A & Karp DD.Clinical lung cancer 2009 ； 10 (4):273-80.),和 Amgen研發的 IGF-1R單克隆抗體 ganitumab (AMG479) (Tap et al.Journal ofClinical Oncology, 2012 ；30:1849-1856.)，目前也在臨床試驗中與 Herceptin 合用治療HER2陽性的轉移性乳腺癌；ImClone研發的Cixutumumab (IMC-A12)與Iapatinib在臨床試驗中聯合使用用于治療轉移性乳腺癌；Merck研發的Dalotuzumab (MK-0646, h7C10)也是一個IGF-1R單克隆抗體,也在不同的臨床試驗中。所以可以用抗IGF-1R的抗體和Herceptin結合使用來克服Herceptin的耐藥性。
[0005]同時靶向IGF-1R和HER2是一種很有希望的改善抗HER2藥物用于治療HER2陽性的晚期乳腺癌療效的策略。⑴IGF-1R能與HER2相互作用并激活HER2，IGF-1R信號系統的增強與 Herceptin 的耐藥性有關(Lu et al.J Natl Cancer Inst.2001 ；93 (24):1852-7.)。(2)在耐受trastuzumab和gef itinib的乳腺癌細胞上有IGF-1R和HER2的異源性二聚體的存在(Jones et al.Endocr Relat Cancer.2004 ；11 (4):793-814.；Nahta etal.Cancer Res.2005 ；65(23):11118-28.)。(3)抗 IGF-1R 藥物如 TKI (AG538)能恢復耐受trastuzumab 細胞對 trastuzumab 的敏感性，并減少活力(Nahta et al.CancerRes.2005 ；65(23):11118-28.)。(4) IGF-結合蛋白 3 (IGFBP3)通過阻斷 IGF-1 介導的 IGF-1R 的激活，而抑制耐受 trastuzumab 的細胞的生長(Lu et al.JNatl Cancer Inst.2001 ；93 (24):1852-7.), IGFBP3 也能恢復耐受 trastuzumab 的細胞對 trastuzumab 的敏感性(Jeromeet al.Cancer Res.2006 ；66 (14):7245-52.)。(5)聯合使用 trastuzumab 和轉染顯性陰性IGF-1R能協同抑制MCF7/HER18細胞的生長，這種細胞同時高表達HER2和IGF-1R(Camirandet al.Med Sci Monit.2002 ；8(12):BR521_6.)。(6)抗 IGF-1R 單克隆抗體 alpha_IR3能破壞HER2/IGF-1R的相互作用，恢復耐受trastuzumab的細胞對trastuzumab的敏感性(Nahta et al.Cancer Res.2005 ；65(23):11118-28.)。(7)去甲二氫化愈創木酸(Nordihydroguaiaretic acid, NDGA),—種從石炭酸灌木中提取的強抗氧化劑，是一種IGF-1R 和 HER2 的雙重抑制劑(Youngren et al.Breast Cancer Res Treat.2005 ；94 (I):37-46.)，NDGA能引起MCF_7/neo細胞和高表達HER2的MCF-7/HER2-18細胞的細胞周期停止，生長抑制和凋亡(Zavodovskaya et al.J Cell Biochem.2008 ; 103 (2):624-35.),也能引起對trastuzumab敏感的細胞和耐受trastuzumab的細胞的凋亡，同時使用NDGA和 trastuzumab 恢復耐受 trastuzumab 的細胞對 trastuzumab 的敏感性(Rowe et al.MolCancer Ther.2008 ；7 (7): 1900-8.)。[0006]所以把IGF-1R的單克隆抗體和HER2單克隆抗體Herc印tin結合，進行雙抗體結合治療，可以有效降低Herceptin耐藥性,顯著提高Herceptin對乳腺癌的療效。新近(2012年6月)FDA批準的由羅氏制藥公司開發的帕妥珠單抗(Perjeta)與曲妥珠單抗合用用于治療HER2陽性轉移性乳腺癌，就是一個雙抗體結合治療成功的例子。但是雙抗體結合治療將會價格昂貴，也受限于兩種抗體的供應和更為復雜、漫長和和代價大的審批過程，難以在臨床上普及應用。

【發明內容】

[0007]本發明的目的是:克服現有技術的不足，提供一種抗人HER2和人IGF-1R的雙特異性抗體，并提供其制備方法，以用于制備治療人類癌癥特別是人類治療乳腺癌的藥品。抗HER2和IGF-1R的雙特異性抗體國內外未見報道。
[0008]本發明的技術方案是:本發明的抗HER2和IGF-1R的雙特異性抗體，包含特異性結合HER2的第一抗原結合域和特異性結合IGF-1R的第二抗原結合域，其結構特點是:
[0009]上述第一抗原結合域和第二抗原結合域都由一對抗體重鏈可變結構域VH和抗體輕鏈可變結構域VL組成；
[0010]上述的第一抗原結合域為可與HER2特異性結合的抗體可變區結構域；第二抗原結合域為可與IGF-1R特異性結合的抗體可變區結構域。
[0011]進一步的方案是:上述的第一抗原結合域為序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中的任一序列。
[0012]進一步的方案是:上述的第二抗原結合域為序列SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9 以及 SEQ ID NO:10 中的任一序列。
[0013]進一步的方案是:上述的第一抗原結合域的序列為已經公開的其它任何可與HER2特異性結合的抗體的可變區結構域的序列，如CN200680029687.5中列出的序列；第二抗原結合域的序列為已經公開的其它任何可與IGF-1R特異性結合的抗體的可變區結構域的序列。
[0014]進一步的方案是:上述的第一抗原結合域和第二抗原結合域為通過將鼠來源的抗體人源化獲得或完全人源獲得。
[0015]進一步的方案還有:上述的抗體是二價的或多價的。
[0016]一種上述的抗HER2和IGF-1R的雙特異性抗體的制備方法，包括以下步驟:
[0017]①合成編碼上述抗體的cDNA序列；
[0018]②將cDNA序列插入工具載體，構建可在宿主細胞中表達的表達載體；
[0019]③將上述的表達載體在宿主細胞中表達；
[0020]④分離純化表達的雙特異性抗體。
[0021]進一步的方案是:上述的步驟②中的工具載體為市售商業化載體或自行構建的可供表達的載體。
[0022]進一步的方案是:上述的步驟②和步驟③中的宿主細胞為如大腸桿菌、酵母、哺乳動物細胞、植物細胞、昆蟲細胞的常見表達宿主。
[0023]一種上述的抗HER2和IGF-1R的雙特異性抗體，用于制備治療人類癌癥尤其是人類乳腺癌的藥品。
[0024]本發明的積極效果:本發明與單一的抗HER2抗體或者抗IGF-1R抗體相比有以下優點:本發明將特異性識別HER2和IGF-1R的抗體可變區域構建在同一抗體分子中，使其具有能同時特異性結合兩個抗原的特性，該雙特異性抗體能同時阻斷這兩種抗原介導的細胞信號傳遞，抑制依賴HER2的腫瘤細胞生長，使腫瘤消退，同時消除IGF-1引發的耐藥性，有效降低乳腺癌的侵襲性和全身擴 散；本發明的抗HER2和IGF-1R的雙特異性抗體，可用于制備治療人類癌癥特別是治療人類乳腺癌的藥品。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1-1至圖1-8為本發明的scFv結構類型的特異性識別HER2和IGF-1R的雙特異性抗體的結構示意圖，圖中抗原I為HER2，相應地抗原2則為IGF-1R，其中:
[0026]圖1-1:連接方式:VL1-接頭-VHl-接頭-VL2-接頭-VH2 ；
[0027]圖1-2:連接方式:VH1-接頭-VLl-接頭-VH2-接頭-VL2 ；
[0028]圖1-3:連接方式:VL2_接頭-VH2-接頭-VL1-接頭-VHl ；
[0029]圖1-4:連接方式:VH2_接頭-VL2-接頭VHl-接頭-VLl ；
[0030]圖1-5:連接方式:VL1-接頭-VH2-接頭-VL2-接頭-VHl ；
[0031 ] 圖1-6:連接方式:VH1-接頭-VL2-接頭-VH2-接頭-VLl ；
[0032]圖1-7:連接方式:VL2_接頭-VHl-接頭-VL1-接頭-VH2 ；
[0033]圖1-8:連接方式:VH2_接頭-VL1-接頭-VHl-接頭-VL2 ；
[0034]圖2-1至圖2-4為本發明的scFab結構類型的特異性識別HER2和IGF-1R的雙特異性抗體的結構示意圖，圖中抗原I為HER2，相應地抗原2則為IGF-1R，其中:
[0035]圖2-1: [VL-CL-接頭-VH-CH1]抗原 1-接頭-[VL-CL-接頭-VH-CH1]抗原 2 ；
[0036]圖2-2: [VH-CHl-接頭-VL-CL]抗原 1-接頭-[VH-CH1-接頭-VL-CL]抗原 2 ；
[0037]圖2-3: [VL-CL-接頭-VH-CH1]抗原 2_ 接頭-[VL-CL-接頭-VH-CH1]抗原 I ;
[0038]圖2-4: [VH-CHl-接頭-VL-CL]抗原 2_ 接頭-[VH-CH1-接頭-VL-CL]抗原 I ;
[0039]圖3-1至圖3-4為本發明的具全長抗體并含有額外的scFv的四價的特異性識別HER2和IGF-1R的雙特異性抗體 的結構示意圖，圖中抗原I為HER2，相應地抗原2則為IGF-1R，其中:[0040]圖3-1:結合IGF-1R的scFv連接到全長抗HER2抗體的輕鏈C端；
[0041]圖3-2:結合IGF-1R的scFv連接到全長抗HER2抗體的Fe的C端；
[0042]圖3-3:結合HER2的scFv連接到全長抗IGF-1R抗體的輕鏈的C端；
[0043]圖3-4:結合HER2的scFv連接到全長抗IGF-1R抗體的Fe的C端；
[0044]圖4-1至圖4-4為本發明的具全長抗體并含有額外的scFab的四價的特異性識別HER2和IGF-1R的雙特異性抗體的結構示意圖，圖中抗原I為HER2，相應地抗原2則為IGF-1R，其中:
[0045]圖4-1:結合IGF-1R的scFab連接到全長抗HER2抗體的輕鏈的C端；
[0046]圖4-2:結合IGF-1R的scFab連接到全長抗HER2抗體的Fe的C端；
[0047]圖4-3:結合HER2的scFab連接到全長抗IGF-1R抗體的輕鏈的C端；
[0048]圖4-4:結合HER2的scFab連接到全長抗IGF-1R抗體的Fe的C端。
[0049]氨基酸序列描述
[0050]SEQ ID NO:1針對HER2的抗體結合可變區域I
[0051]SEQ ID NO:2針對HER2的抗體結合可變區域2
[0052]SEQ ID NO:3針對IGF-1R的抗體結合可變區域I
[0053]SEQ ID NO:4針對IGF-1R的抗體結合可變區域2
[0054]SEQ ID NO:5針對IGF-1R的抗體結合可變區域3
[0055]SEQ ID NO:6針對IGF-1R的抗體結合可變區域4
[0056]SEQ ID NO:7針對IGF-1R的抗體結合可變區域5
[0057]SEQ ID NO:8針對IGF-1R的抗體結合可變區域6
[0058]SEQ ID NO:9針對IGF-1R的抗體結合可變區域7
[0059]SEQ ID NO:10針對IGF-1R的抗體結合可變區域8
[0060]SEQ ID NO:11針對IGF-1R的抗體結合可變區域9
[0061]SEQ ID NO:12針對IGF-1R的抗體結合可變區域10。
【具體實施方式】
[0062]下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明作進一步詳細的描述。
[0063](實施例1)
[0064]見圖1-1至圖4-4，本實施例的抗人HER2和人IGF-1R的雙特異性抗體，至少包含結合人HER2的第一抗原結合域和結合人IGF-1R的第二抗原結合域，前述每個抗原結合域又包含一對功能性的抗體重鏈可變結構域和抗體輕鏈可變結構域。
[0065]前述針對人HER2和人IGF-1R的雙特異性抗體分子組成包含但不限于結合HER2的第一抗原結合域和結合IGF-1R的第二抗原結合域，還包括有助于前述雙特異性抗體維持空間結構以實現正常功能或增強抗體功能的其它肽段或分子。
[0066]術語“價”指結合位點在抗體分子上存在的具體數量。比如:術語“二價”，“四價”，和“六價”指在抗體分子上分別存在兩個結合位點，四個結合位點，六個結合位點。根據本實施例的雙特異性抗體至少是“二價”的，并且可以是“多價”的(例如“三價”，“四價”等)。優選地，本實施例的雙特異性抗體是二價的，四價的。對于具有超過兩個抗原結合域的抗體，有些結合域可以是相同的，只要前述抗體至少具有對于兩種抗原J1ER2和IGF-IR的兩個 特異性結合域。
[0067]優選地，本實施例的雙價的雙特異性抗體結構類型包括scFv型和scFab型。scFv 是由抗體重鏈可變結構域（VH)和抗體輕鏈可變結構域（VL)和肽段接頭組成的多肽。具體 的，前述scFv型雙特異性抗體（如附圖1所示）具有從N端到C端方向的下列順序之一：
[0068](1) VLHEE2-接頭 ~VHER2_ 接頭 VL
IGF-IE_
接頭-VH
IGF-IR，
[0069](2) VHHEE2-接頭接頭 VHIGF—IR_ 接頭-VL
IGF-IR，
[0070](3) VLigf_ie-接頭-VHicf_ik-接頭-VLhek_2_ 接頭 _VHhek_2,
[0071 ]⑷ VHigf_ir_ 接頭 _vligf_ir-接頭 VHher_2_ 接頭 _VLhf_2,
[0072](5) VLhek_2_ 接頭-VHkf_ik_ 接頭-VLrcF_IK_ 接頭 _VHhek_2，
[0073](6)VHhek_2-接頭-VL
IGF-IR-
接頭_VH
IGF-IR- 接頭-VL
HER-2，
[0074](7) VLigf_ie-接頭-VHhek_2_ 接頭-VLhek_2_ 接頭 _VHrcF_IK，或
[0075]⑶VHkf_ik_ 接頭-VLhek_2_ 接頭-VHhek_2_ 接頭 _VLrcF_IK。
[0076]scFab是由抗體重鏈可變結構域（VH),抗體重鏈恒定結構域1 (CH1),抗體輕鏈可 變結構域（VL)和抗體輕鏈恒定區（CL)和肽段接頭組成的多肽，前述scFab型雙特異性抗 體（如附圖2所示）具有從N端到C端方向的下列順序之一：
[0077](1) [VL-CL-接頭-VH-CH1]臓-接頭-[VL-CL-接頭-VH-CH1] IGF_IK，
[0078](2) [VH-CH1-接頭-VL-CL]麗_2_ 接頭-[VH-CH1-接頭-VL-CL] IGF_IK，
[0079](3) [VL-CL-接頭-VH-CH1] IGF_IK_ 接頭-[VL-CL-接頭-VH_CH1]hek_2，或
[0080](4) [VH-CH1-接頭-VL_CL]igf_ik-接頭-[VH-CH1-接頭-VL-CL]臓_2，
[0081]本實施例的采用scFv結構的雙特異性抗體中，第一和第二抗原結合域之間以及 每個抗原結合域內部的VH和VL之間的肽段接頭為（Gly4Ser) n，n應滿足最大程度保證抗體 分子的正確裝配以實現結合抗原的功能，優選地，n在1-6之間。本實施例的采用scFab結 構的雙特異性抗體中，第一和第二抗原結合域之間以及每個抗原結合域內部的重鏈和輕鏈 之間均由肽段接頭（Gly4Ser)n* (Gly4Ser)nGm連接，n和m應滿足最大程度保證抗體分子 的正確裝配以實現抗原結合的功能，優選地，n在1-6之間，m在1-4之間。
[0082]優選地，本實施例的四價的雙特異性抗體結構包括在抗HER2全長抗體的兩個輕 鏈C端各自連接一個抗IGF-IR的scFv或scFab結構域（如附圖3_1、附圖4_1所示），或 者在抗IGF-IR全長抗體的兩個輕鏈C端各自連接一個抗HER2的scFv或者scFab結構域 (如附圖3-3、附圖4-3所示）；還包括在抗HER2全長抗體Fc部分的兩個C末端各自連接 一個抗IGF-IR的scFv或scFab結構域（如附圖3_2、附圖4_2所示），或者在抗IGF-IR全 長抗體Fc部分的兩個C末端各自連接一個抗HER2的scFv或scFab結構域（如附圖3_4、 附圖4-4所示）。因此前述的四價的雙特異性抗體均包含兩個HER2特異性結合域和兩個 IGF-IR特異性結合域。
[0083]本實施例的四價的雙特異性抗體結構中，全長抗體和Fab之間以及Fab內部重鏈 和輕鏈之間也采用肽段接頭（Gly4Ser)n* (Gly4Ser)nGm連接，n和m應滿足最大程度保證 抗體分子的正確裝配以實現抗原結合的功能，優選地，n在1-6之間，m在1-4之間。
[0084]本實施例的四價的雙特異性抗體，因具有人類來源的IgG，優選地IgGl亞類的恒 定區域，因而除可封閉HER2和IGF-IR介導的信號傳遞之外，還可激發抗體依賴性的細胞毒作用(ADCC)和/或補體依賴的細胞毒性(CDC)。
[0085]本實施例的各種結構類型的抗人HER2和人IGF-1R的雙特異性抗體的設計與制備如下述。
[0086]1、scFv結構類型的識別HER2和IGF-1R的雙特異性抗體如(VLhek2-L inker 1-VHkf-1E-Linker2-VLIGF_IE-linker3-VHHEE2)的設計與制備:
[0087]①抗HER2和IGF-1R的雙特異性抗體的核酸序列設計與合成:
[0088]獲得分別特異性結合HER2和IGF-1R的抗體的氨基酸序列，截取VL和VH序列，按照 VLHEK2-Linkerl-VHICF_IK-Linker2-VLreF_IK-linker3-VHHEK2[如圖 1-5,按 N 端至 C 端方向排列，其中Iinkerl和linker3序列都為(Gly4Ser)1, linker2序列為(Gly4Ser)3]方式連接，為便于純化在N端引入6XHis標簽，并在6XHis標簽和抗體分子之間插入腸激酶切割位點(DDDDK)，得到分子A。然后將分子A融合到人IgGl信號肽C端，得到分子B，再在分子B編碼序列的5’和3’端分別引入酶切位點EcoR I和Xba I，得到分子C，將分子C的序列委托南京金斯瑞公司進行序列密碼子優化獲得易于在CHO細胞中表達的核酸序列，并合成。
[0089]②表達載體的構建、轉化及穩定表達株篩選:
[0090]將測序正確的序列通過雙酶切EcoR I和Xba I雙酶切連接到pCIneo載體中，經 DNA測序分析,與設計完全一致。然后按照Invitrogen操作手冊的方法轉染CH0-DG44貼壁細胞。添加G418加壓，并通過有限稀釋方法分離穩定表達株。通過Western方法篩選到產量較高的細胞，產量> 5mg/L。
[0091]③雙特異性抗體的分離與純化:
[0092]收集培養液上清，按順序用兩次N1-NTA親和層析和一次DEAE-S印harose FF (GE產品)離子交換層析進行分離。具體的說，將培養基上清800g離心lOmin，留上清。然后上樣到用溶液I (20mM磷酸鹽緩沖液+200mM NaCl，pH8.0)預平衡的N1-NTA親和層析柱，以溶液I洗滌5-10個柱體積，然后以溶液II (20mM磷酸鹽緩沖液+200mM NaCl+200mM咪唑，pH8.0)梯度洗脫，收集洗脫峰。按腸激酶說明書方法將洗脫液采用腸激酶酶切以去除組氨酸標簽，切割后樣品以溶液I稀釋10倍后上N1-NTA層析柱，腸激酶因和未被切割的抗體分子結合到層析柱上，而被切除組氨酸標簽的抗體分子直接流穿。然后收集流穿部分，將其以上樣至溶液III (50mM磷酸鹽緩沖液，pH 8.0)預處理過的DEAE-S印harose FF層析柱，再用溶液IV (500mM NaCl+50mM磷酸鹽緩沖液，pH 8.0)梯度洗脫，收集目的流出峰。BCA方法進行定量。SDS-PAGE檢測純度> 95%。
[0093]2、scFab結構類型的識別人HER2和人IGF-1R的雙特異性抗體如(LHEK2_L inker 1-HHEE2-Linker2-LIGF_IE-linker3-HIGF_IE)的設計與制備:
[0094]①獲得分別特異性結合HER2和IGF-1R的抗體的氨基酸序列，截取Fab區序列，按照 LHEK2_Linker 1-HHEK2-Linker2-LIGF_IK-1 inker3-HIGF_IK [按 N 端至 C 端方向排列，其中 I inker I和linker3序列都為(Gly4Ser)6GG, linker2序列為(Gly4Ser)1]方式連接,為便于純化在N端引入6XHis標簽，并在組氨酸標簽和抗體分子之間插入腸激酶切割位點(DDDDK)，得到分子D。然后將分子D融合到人IgGl信號肽C端，得到分子E，再在分子E編碼序列的5’和3’端分別引入酶切位點EcoR I和Xba I，得到分子F，將分子F的序列委托南京金斯瑞公司進行序列密碼子優化獲得易于在CHO細胞中表達的核酸序列，并合成。
[0095]②表達載體的構建、轉化及穩定表達株篩選:[0096]將測序正確的序列通過雙酶切EcoR I和Xba I雙酶切連接到pCIneo載體中，經DNA測序分析,與設計完全一致。然后按照Invitrogen操作手冊的方法轉染CH0-DG44貼壁細胞。添加G418加壓，并通過有限稀釋方法分離穩定表達株。通過Western方法篩選到產量較高的株細胞，產量> 3mg/L。
[0097]③雙特異性抗體的分離與純化:
[0098]收集培養液上清，按順序用兩次N1-NTA親和層析和一次DEAE-S印harose FF (GE產品)離子交換層析進行分離。具體的說，將培養基上清800g離心lOmin，留上清。然后上樣到用溶液A(20mM Tris-Cl+200mM NaCl，pH 8.5)預平衡的N1-NTA親和層析柱，以溶液A洗滌5-10個柱體積，然后以溶液B (20mM Tris-Cl+200mM NaCl+200mM咪唑，pH 8.5)洗脫，收集洗脫峰。按腸激酶說明書方法將洗脫液采用腸激酶酶切以去除組氨酸標簽，切割后樣品以溶液A稀釋20倍后上N1-NTA，腸激酶因和未被切割的抗體分子結合到層析柱上，而被切割的抗體分子直接流穿。然后收集流穿部分，將其以上樣至溶液C(50mM Tr1-Cl,pH8.5)預處理過的DEAE-S印harose FF層析柱，以溶液C洗滌5_10個柱體積，再用溶液D (600mMNaCl+50mM Tris_Cl，pH 8.5)梯度洗脫，收集目的流出峰。BCA方法進行定量。SDS-PAGE檢測純度> 95%。
[0099]3、四價結構類型的識別IGF-1R的全長抗體重鏈C端連接識別HER2的scFv的雙特異性抗體:
[0100]①獲得分別特異性結合HER2和IGF-1R的抗體的氨基酸序列，設計結合HER2的單價scFv分子VLhek2-Linker 1-VHhek2 [按N端至C端方向排列，其中I inker I序列為(Gly4Ser) 3]，將其N端通過(Gly4Ser) 3連接到IGF-1R全長抗體的重鏈的C端，然后將其融合到人IgGl信號肽C端，再在所得融合蛋白編碼序列的5’和3’端分別引入酶切位點EcoRI和Xba I，將所設計分子的序列委托南京金斯瑞公司進行序列密碼子優化獲得易于在CHO細胞中表達的核酸序列，并合成。
[0101]另將IGF-1R抗體輕鏈部分融合到人IgGl信號肽3’端，再在5’和3’端分別引入酶切位點EcoR I和Xba I，將設計的分子的編碼序列委托南京金斯瑞公司進行序列密碼子優化獲得易于在CHO細胞中表達的核酸序列，并合成。
[0102]②表達載體的構建、轉化及穩定表達株篩選:
[0103]將測序正確的兩段序列通過雙酶切EcoR I和Xba I雙酶切各自連接到pCIneo載體中，經DNA測序分析，與設計完全一致。然后按照Invitrogen操作手冊的方法，將兩個載體按1:1比例共轉染CH0-DG44貼壁細胞。添加G418加壓，并通過有限稀釋方法分離穩定表達株。通過Western方法篩選到產量較高的株細胞，產量> 5.5mg/L。
[0104]③雙特異性抗體的分離與純化:
[0105]收集培養液上清，按順序用Protein A親和層析和S-200 (GE產品)排阻層析進行分離。具體的說，將培養基上清800g離心lOmin，留上清。然后上樣到用平衡溶液(20mMTris-Cl+250mM NaCl, pH 8.0)預平衡的Protein A親和層析柱，以平衡溶液洗漆5-10個柱體積，然后以洗脫液(0.1M檸檬酸鹽緩沖液，pH 2.8)洗脫，將包含蛋白的收集液用IMTris-Cl,pH 8.0中和。用Millipore超濾裝置(截留分子量30kD)將其濃縮，并上樣到用平衡液(20mM組氨酸，150mM NaCl,pH 6.0)平衡的S-200層析柱。將雙特異性抗體部分收集。BCA方法進行定量。SDS-PAGE檢測純度> 95%。[0106]4、四價結構類型的識別IGF-1R的全長抗體重鏈C端連接識別HER2的scFab的雙特異性抗體:
[0107]①獲得分別特異性結合HER2和IGF-1R的抗體的氨基酸序列，設計結合HER2的單價scFab分子VLHEK2-CL-Linkerl-VHHEK2-CH1 [按N端至C端方向排列,其中Iinkerl序列為(Gly4Ser)6GG],將其N端通過(Gly4Ser) 3連接到IGF-1R全長抗體的重鏈的C端，然后將其融合到人IgGl信號肽C端，再在所得融合蛋白編碼序列的5’和3’端分別引入酶切位點EcoR I和Xba I，將所設計分子的序列委托南京金斯瑞公司進行序列密碼子優化獲得易于在CHO細胞中表達的核酸序列，并合成。
[0108]另將IGF-1R抗體輕鏈部分融合到人IgGl信號肽3’端，再在5’和3’端分別引入酶切位點EcoR I和Xba I，將設計的分子的編碼序列委托南京金斯瑞公司進行序列密碼子優化獲得易于在CHO細胞中表達的核酸序列，并合成。
[0109]②表達載體的構建、轉化及穩定表達株篩選:
[0110]將測序正確的兩段序列通過雙酶切EcoR I和Xba I雙酶切各自連接到pCIneo載體中，經DNA測序分析，與設計完全一致。然后按照Invitrogen操作手冊的方法，將兩個載體按1:1比例共轉染CH0-DG44貼壁細胞。添加G418加壓，并通過有限稀釋方法分離穩定表達株。通過Western方法篩選到產量較高的株細胞，產量> 2.8mg/L。
[0111]③雙特異性抗體的分離與純化:
[0112]收集培養液上清，按順序用Protein A親和層析和S-200 (GE產品)排阻層析進行分離。具體的說，將培養基上清800g離心lOmin，留上清。然后上樣到用平衡溶液(20mMTris-Cl+250mM NaCl, pH 8.0)預平衡的Protein A親和層析柱，以平衡溶液洗漆5-10個柱體積，然后以洗脫液(0.1M檸檬酸鹽緩沖液，pH 2.8)洗脫，將包含蛋白的收集液用IMTris-Cl,pH 8.0中和。用Millipore超濾裝置(截留分子量30kD)將其濃縮，并上樣到用平衡液(20mM組氨酸，150mM NaCl,pH 6.0)平衡的S-200層析柱。將雙特異性抗體部分收集。BCA方法進行定量。SDS-PAGE檢測純度> 96%。
[0113]本實施例的識別HER2和IGF-1R雙特異性抗體的初步活性檢測:
[0114]分別用前述4種方法所獲得的4種結構的雙特異性抗體與HER2陽性細胞系、IGF-1R陽性細胞系和HER2/IGF-1R雙陽性細胞，以及HER2/IGF-1R雙陰性細胞系進行相互作用分析，結果表明上述三種HER2/IGF-1R雙特異性抗體都能與HER2陽性細胞系，IGF-1R陽性細胞系和HER2/IGF-1R雙陽性細胞結合，而不與HER2/IGF-1R雙陰性細胞系結合，說明HER2/IGF-1R雙特異性抗體具有與HER2和IGF-1R特異性結合的能力。
[0115]本實施例的各種結構類型的抗人HER2和人IGF-1R的雙特異性抗體通過藥學可接受的載體用于人類，合適的藥物載體為本領域熟知，包括但不限于生理鹽水、磷酸緩沖液、水、脂質體、納米載體等。含有此類載體的雙特異性抗體或抗體組合物通過眾所周知的常規方法制備。
[0116]本實施例的各種結構類型的抗人HER2和人IGF-1R的雙特異性抗體可以通過各種給藥途徑用于人類，給藥途徑包括但不限于靜脈注射、靜脈滴注、肌肉注射、皮下注射、口月艮、舌下給藥、噴霧等。`
[0117]本實施例的各種結構類型的抗人HER2和人IGF-1R的雙特異性抗體可以應用上述的藥物載體，通過上述的給藥途徑單獨使用或者與其它藥物合用或者與其它藥物偶聯后用于人類。所述的藥物包括但不限于細胞毒素、放射性同位素、脂質體、抗體等。
[0118]綜上，本實施例將特異性識別人HER2和人IGF-1R的抗體可變區域構建在同一抗體分子中，使其具有能同時特異性結合兩個抗原的特性，該雙特異性抗體能同時阻斷這兩種抗原介導的細胞信號傳遞，抑制依賴HER2的腫瘤細胞生長，使腫瘤消退，同時消除IGF-1弓丨發的耐藥性，有效降低乳腺癌的侵襲性和全身擴散；本實施例的抗HER2和IGF-1R的雙特異性抗體，可用于制備治療人類癌癥特別是治療人類乳腺癌的藥品。
[0119]以上實施例是對本發明的【具體實施方式】的說明，而非對本發明的限制，有關【技術領域】的技術人員在不脫離本發明的精神和范圍的情況下，還可以做出各種變換和變化而得到相對應的等同的技術方案， 因此所有等同的技術方案均應該歸入本發明的專利保護范圍。
【權利要求】
1.一種抗人HER2和人IGF-1R的雙特異性抗體，包含特異性結合HER2的第一抗原結合域和特異性結合IGF-1R的第二抗原結合域，其特征在于: 所述第一抗原結合域和第二抗原結合域都由一對抗體重鏈可變結構域(VH)和抗體輕鏈可變結構域(VL)組成； 所述的第一抗原結合域為可與HER2特異性結合的抗體可變區結構域；第二抗原結合域為可與IGF-1R特異性結合的抗體可變區結構域。
2.根據權利要求1所述的抗人HER2和人IGF-1R的雙特異性抗體，其特征在于:所述的第一抗原結合域為序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中的任一序列。
3.根據權利要求1所述的抗HER2和IGF-1R的雙特異性抗體，其特征在于:所述的第二抗原結合域為序列 SEQ ID N0:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9 以及 SEQ ID NO:10 中的任一序列。
4.根據權利要求1所述的抗人HER2和人IGF-1R的雙特異性抗體，其特征在于:所述的第一抗原結合域的序列為已經公開的其它任何可與HER2特異性結合的抗體的可變區結構域的序列；所述的第二抗原結合域的序列為已經公開的其它任何可與IGF-1R特異性結合的抗體的可變區結構域的序列。
5.權利要求1所述的抗人HER2和人IGF-1R的雙特異性抗體，其特征在于:所述的第一抗原結合域和第二抗原結合域為通過將鼠來源的抗體人源化獲得或完全人源獲得。
6.根據權利要求1~5任一項所述的抗人HER2和人IGF-1R的雙特異性抗體，其特征在于:所述的抗體是二價的或多價的。
7.一種權利要求1~5任一項所述的抗人HER2和人IGF-1R的雙特異性抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步 驟: ①合成編碼所述抗體的cDNA序列； ②將cDNA序列插入工具載體，構建可在宿主細胞中表達的表達載體； ③將所述的表達載體在宿主細胞中表達； ④分離純化表達的雙特異性抗體。
8.根據權利要求7所述的抗人HER2和人IGF-1R的雙特異性抗體的制備方法，其特征在于:所述的步驟②中的工具載體為市售商業化載體或自行構建的可供表達的載體。
9.根據權利要求7所述的抗人HER2和人IGF-1R的雙特異性抗體的制備方法，其特征在于:所述的步驟②和步驟③中的宿主細胞為如大腸桿菌、酵母、哺乳動物細胞、植物細胞、昆蟲細胞的常見表達宿主。
10.一種權利要求1~5任一項所述的抗人HER2和人IGF-1的雙特異性抗體，其特征在于:用于制備治療人類癌癥尤其是人類乳腺癌的藥品。
【文檔編號】C12N15/63GK103509117SQ201310160996
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年5月6日 優先權日:2013年5月6日
【發明者】包建新, 樓亞平, 鄧洪淵, 姜有為 申請人:江蘇匡亞生物醫藥科技有限公司