專利名稱：一種飼用高效復合益生菌劑及制備方法
技術領域：
本發明涉及一種飼料添加劑，尤其涉及一種由復合微生物組成的高效復合益生菌劑。
背景技術：
在現代飼養業中，飼料中添加抗生素始于五十年代，對防治疾病，促進生長，節省飼料，提高養殖經濟效益起到重要作用。但是，隨著飼料中長期大量地添加抗生素及化學合成藥物，在養殖生產中出現了動物體內病原微生物產生耐藥性，應用效果降低，生產成本加大；動物體內產生藥物依賴，自身的免疫機能抑制，免疫力和抗病力降低；動物體內有益菌被抑制，菌群失調，形成內源性感染；動物產品及排泄物藥物殘留，危及人體健康；動物體內耐藥菌的擴散，引起公共安全等重大問題，亟待解決。因此，從八十年代始，有關益生菌在養殖業的應用研究快速發展。目前，國內外益生菌研究涉列有益菌80余個品種。我國頒布的《飼料添加劑品種目錄(2006)》準予使用有益菌共16個。國內市場推廣的芽孢桿菌制劑有促菌生、整腸生、抑菌生、乳康生等；乳酸菌制劑以乳酸菌屬和雙歧桿菌屬為主。益生菌作為一種新型天然的生物活性添加劑，無毒，無抗藥性，無殘留，并具有增強免疫力，促進生長，提高飼料利用率的功效，替代抗生素應用養殖生產中。目前，益生菌制劑應用于養殖生產，但在制備技術方面尚存在諸多問題:(I)產品標準不統一，生產企業自行設立標準，缺乏科學依據，益生菌含量過高或過低，影響使用效果；(2)生產菌種來源不明，大多數企業生產用菌種相互轉接，沒有經過分離選育，菌種退化嚴重，生理活性降低；(3)菌種配伍缺乏科學依據，單一菌株，雙菌株，甚至多菌株隨意配t匕，不能說明菌株間配伍的合理性 ，達不到菌株優良性狀，通過合理配伍而互補，協同性差；生產工藝混亂，不能按菌種的不同生理特性區別培養，不少生產企業采用多菌種混合培養，不用發酵罐，甚者采用堆集發酵，致使益生菌生長少，雜菌叢生。
發明內容
為了解決以上益生菌制劑存在的配伍不科學、協同效果差的問題，本發明提供了一種配伍科學合理、相互協同作用效果好的高效復合益生菌制劑。本發明的另一個目的是提供所述高效復合益生菌制劑的制備方法。本發明所述的復合益生菌劑是由地衣芽孢桿菌Qkicillus licheniformis')、蹲熱乳酸鏈球菌 iStreptococcus釀酒酵母菌{Saccharomyces cerevisiae沿分別發酵培養后按比例混合而成。所述地衣芽孢桿菌劑制備方法如下:
(I)地衣芽孢桿菌制劑
地衣芽孢桿菌菌劑制備方法如下:
在滅菌液體培養基上，按2%接種量接入活化的地衣芽孢桿菌，37°C通氣發酵24小時，可得地衣芽孢桿菌制劑；
所述的液體培養基營養成分的質量體積比為:2%淀粉，1%豆餅水解液，2%玉米漿，1%麩皮，磷酸氫二鉀0.25%,磷酸二氫鉀0.1%，121°C滅菌30分鐘；
所述的地衣芽孢桿菌，好氧生長，培養適溫3(T31°C ;能分泌桿菌肽，具有廣譜抗菌活性，能殺滅動物腸道內大腸桿菌、沙門氏菌等病原菌；能夠分泌蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等，促進飼料中蛋白質等大分子物質的分解吸收；能夠耐熱、耐酸，在飼料加工過程中和在動物體內胃酸、膽汁酸鹽的環境下，能保持較高的生理活性，容易培養。( 2 )嗜熱乳酸鏈球菌制劑 嗜熱乳酸鏈球菌劑制備方法如下:
在滅菌的液體培養基中，以質量百分比5%接種量接入嗜熱乳酸鏈球菌，37°C靜止培養24小時，可得嗜熱乳酸鏈球菌制劑；
所述的液體培養基營養物質體積比為:40%麥芽水解液，10%大豆水解液，10%無機鹽溶液II，121。。滅菌30分鐘； 所述的無機鹽溶液II是指IOOOml溶液中含有醋酸鈉5g、檸檬酸銨2g、磷酸氫二鉀2g、硫酸鎂0.58g、硫酸錳0.25g ；
所述的嗜熱乳酸鏈球菌，厭氧或兼性好氧，生長溫度4(T42°C，pH值5.5飛.2 ;在動物體內利用腸道內營養生長繁殖，與病原菌競爭營養物質，抑制病原菌生長繁殖；能夠分泌乳鏈菌素，抑制和殺滅病原菌；代謝產生乳酸，乙酸，促進飼料中維生素D，鈣、鐵離子的吸收，增加營養。(3)釀酒酵母菌制劑
釀酒酵母菌菌劑制備方法如下:
在滅菌的固態培養基上，以10%接種量接入活化的釀酒酵母菌，3(T32°C固體發酵36^48小時，中間翻料2 3次，可得酵母菌制劑；
所述的固態培養基營養成分百分比為::40%蘋果渣，10%麩皮，40%麥芽根，10%無機鹽溶液I，適量的水，混合均勻，121°C滅菌30分鐘；
所述的無機鹽溶液I為:1000ml溶液中含有硫酸銨40g、磷酸氫二鉀0.2g、硫酸二氫鉀0.8g、氯化鈣0.02g、硫酸鎂0.08g ；
所述的釀酒酵母菌菌體蛋白質含量高，能夠耐受動物腸道內胃酸和膽汁酸鹽而存活；在動物腸道內能夠分泌嗜殺因子，殺滅腸道內的病原菌。(4)復合益生菌劑制備
復合益生菌劑制備方法為:地衣芽孢桿菌制劑3(Γ50份，嗜熱乳酸鏈球菌制劑3(Γ50份，釀酒酵母菌制劑1(Γ40份混合而成液體型菌劑；用麩皮或稻殼吸附，風干或4(T50°C干燥可得益生菌固體型菌劑。所述復合益生菌劑中有效微生物含量為8 120X IO9 CFU/mL或6 150 X IO9 CFU/g 所述復合益生菌劑可以0.Γ0.5%的劑量添加到畜禽飼料或飲用水中使用。本發明的優點在于:
(I)分離篩選的菌種生理活性高，菌株間配伍的科學合理，菌株優良性狀通過合理配伍而互補,協同性好,使動物體內有益微生物菌群平衡,能抑制和殺滅動物體內病原菌,逐漸取代飼料中添加的抗生素；(2)在動物體內益生菌分泌的桿菌肽、乳酸鏈球菌素及嗜殺因子，均為基因編碼的肽類，而非菌類培養的次生物，在動物體內通過代謝自行分解為氨基酸等被吸收，無毒、無殘留;
(3)根據每個菌株的生理特點，改進培養方法，培養過程中特別是地衣芽孢桿菌不容易感染噬菌體，適用工業化生產；
(4)促進動物消化吸收，減輕糞便臭味，改善飼養環境和生態環境。
具體實施例方式為了更好的理解本發明，下面結合具體實施例來進一步說明。實施例1:高效復合益生菌劑一液體型
(I)地衣芽孢桿菌菌劑的制備:
液體培養基(W/ν ):2%淀粉，1%豆餅水解液，2%玉米漿，1%麩皮，磷酸氫二鉀0.25%,磷酸二氫鉀0.1%，121。。滅菌30分鐘。在滅菌培養基上，2%接種量接入活化的地衣芽孢桿菌，37°C通氣發酵24小時，可得地衣芽孢桿菌制劑。(2)嗜熱乳酸鏈球菌劑的制備:
液體培養基( W/ν):40%麥芽水解液，10%大豆水解液，10%無機鹽溶液II (IOOOml溶液中含有醋酸鈉5g、檸檬酸銨2g、磷酸氫二鉀2g、硫酸鎂0.58g、硫酸錳0.25g)，121°C滅菌30分鐘。在滅菌的培養基中，以5% (重量百分比)接種量接入嗜熱乳酸鏈球菌，37°C靜止培養24小時，可得嗜熱乳酸鏈球菌制劑。(3)釀酒酵母菌菌劑的制備:
固體培養基(W/W):40%蘋果渣，10%麩皮，40%麥芽根，10%無機鹽溶液I (1000ml溶液中含有硫酸銨40g、磷酸氫二鉀0.2g、硫酸二氫鉀0.8g、氯化鈣0.02g、硫酸鎂0.08g)，適量的水，混合均勻，121 °C滅菌30分鐘。在滅菌的培養基上，以10%接種量接入活化的釀酒酵母菌，3(T32°C固體發酵36^48小時，中間翻料2 3次，可得酵母菌制劑。將上述培養好的活菌制劑，按照地衣芽孢桿菌40份、嗜熱乳酸鏈球菌40份、釀酒酵母菌20份的比例混合，即得液體劑型益生菌劑，有效活菌數達到74X IO8 CFU/mL。實施例2:高效復合益生菌劑一固體型
按實施例1方法制得液體型復合益生菌菌劑，和麩皮1:3混合，45°C干燥后即得固體型益生菌制劑，有效活菌數達到67X 108 CFU/mL。實施例3:肉雞飼喂試驗
實驗選用I日齡AA肉仔雞23158只，隨機分為試驗組、對照組兩組。雞群基礎日糧相同，按正常程序免疫接種。對照組11610只，飼喂基礎日糧中按常規添加抗生素，試驗組11548只，基礎日糧中添加lwt%實施例1制得的高效益生菌制劑。整個試驗于21日齡、42日齡分別秤重統計。試驗結果為:試驗組仔雞成活率92.21%，對照組為90.99%，成活率提高
1.22% ;平均料重比，試驗組2.027，對照組2.161，料重比下降0.134，試驗組飼料轉化率提聞。
實施例4:小豬飼喂試驗
實驗選用保育出欄的杜X長X大三元小豬120頭，根據性別比例、體重相近的原則，分成A、B、C、D四個組。其中A組為對照組，試驗豬30頭，不設重復，B、C、D組為試驗組，各設兩個重復，每組15頭，公母各半，分頭編號。各組基礎日糧營養水平一致，試驗期30天。A組飼喂基礎日糧并按常規添加抗生素，B組在基礎日糧中添加0.2wt%實施例2發酵培養得到的釀酒酵母菌，C組在基礎日糧中添加0.4wt%實施例2發酵培養得到的嗜熱乳酸鏈球菌劑，D組在基礎日糧中添加1%實施例2制備的高效益生菌制劑。試驗結果表明，平均日增重分別為，A組581克，B組604克，C組617克，D組658克，試驗組D、C、B組分別比對照組A組多77克、36克、23克，D組對A組差異顯著(P〈0.05)。實施例5:奶牛飼喂試驗 試驗選用年齡、胎次、產奶日齡、產奶量相近的荷斯坦奶牛83頭，隨機分為兩組，實驗組42頭，對照組41頭，基礎日糧一致，預試期7天，試驗期42天，飼喂方式和管理方法一致。對照組飼喂基礎日糧，試驗組在所喂基礎日糧中添加lwt%實施例1制備的高效益生菌制劑，稱量記錄每頭牛的每天泌乳量。試驗結果表明，對照組全期平均每頭牛每天產奶量30.20公斤，試驗組為31.27。
權利要求
1.一種飼用高效復合益生菌劑及制備方法，其特征在于復合益生菌劑是由地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、嗜熱乳酸鏈球菌(Streptococcus thermophilus)、釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae Hansen)分別發酵培養后按比例混合而成。
2.如權利要求1所述的復合益生菌劑，其特征在于，所述地衣芽孢桿菌制劑制備方法如下: 在滅菌液體培養基上，按2%接種量接入活化的地衣芽孢桿菌，37°C通氣發酵24小時，可得地衣芽孢桿菌制劑； 所述的液體培養基營養成分的質量體積比為:2%淀粉，1%豆餅水解液，2%玉米漿，1%麩皮，磷酸氫二鉀0.25%,磷酸二 氫鉀0.1%，121 °C滅菌30分鐘； 所述的地衣芽孢桿菌，好氧生長，培養適溫3(T31°C ;能分泌桿菌肽，具有廣譜抗菌活性，能殺滅動物腸道內大腸桿菌、沙門氏菌等病原菌；能夠分泌蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等，促進飼料中蛋白質等大分子物質的分解吸收；能夠耐熱、耐酸，在飼料加工過程中和在動物體內胃酸、膽汁酸鹽的環境下，能保持較高的生理活性，容易培養。
3.如權利要求1所述的復合益生菌劑，其特征在于，所述嗜熱乳酸鏈球菌制劑制備方法如下: 在滅菌的液體培養基中，以質量百分比5%接種量接入嗜熱乳酸鏈球菌，37°C靜止培養24小時，可得嗜熱乳酸鏈球菌制劑； 所述的液體培養基營養物質體積比為:40%麥芽水解液，10%大豆水解液，10%無機鹽溶液II，121℃滅菌30分鐘； 所述的無機鹽溶液II是指IOOOml溶液中含有醋酸鈉5g、檸檬酸銨2g、磷酸氫二鉀2g、硫酸鎂0.58g、硫酸錳0.25g ； 所述的嗜熱乳酸鏈球菌，厭氧或兼性好氧，生長溫度4(T42°C，pH值5.5飛.2 ;在動物體內利用腸道內營養生長繁殖，與病原菌競爭營養物質，抑制病原菌生長繁殖；能夠分泌乳鏈菌素，抑制和殺滅病原菌；代謝產生乳酸，乙酸，促進飼料中維生素D、鈣、鐵離子的吸收，增加營養。
4.如權利要求1所述的復合益生菌劑，其特征在于，所述釀酒酵母菌菌制劑備方法如下: 在滅菌的固態培養基上，以10%接種量接入活化的釀酒酵母菌，3(T32°C固體發酵36^48小時，中間翻料2 3次，可得酵母菌制劑； 所述的固態培養基營養成分百分比為::40%蘋果渣，10%麩皮，40%麥芽根，10%無機鹽溶液I，適量的水，混合均勻，121°C滅菌30分鐘； 所述的無機鹽溶液I為:1000ml溶液中含有硫酸銨40g、磷酸氫二鉀0.2g、硫酸二氫鉀0.8g、氯化鈣0.02g、硫酸鎂0.08g ； 所述的釀酒酵母菌菌體蛋白質含量高，能夠耐受動物腸道內胃酸和膽汁酸鹽而存活；在動物腸道內能夠分泌嗜殺因子，殺滅腸道內的病原菌。
5.如權利要求1所述的復合益生菌劑，其特征在于，所述復合益生菌劑中益生菌比例為:地衣芽孢桿菌制劑3(Γ50份，嗜熱乳酸鏈球菌制劑3(Γ50份，釀酒酵母菌制劑1(Γ40份混合而成液體型菌劑；用麩皮或稻殼吸附，風干或4(T50°C干燥可得益生菌固體型菌劑。
6.如權利要求書I所述的復合益生菌劑，其特征在于，所述復合益生菌劑中有效微生物含量為 8 120 X IO8 CFU/mL*6 150X 108 CFU/g。
7.如權利要求書I所述的復合益生菌劑，其特征在于，所述復合益生菌劑可以0.Γ0.5%的劑量添加 到畜禽飼料或飲用水中使用。
全文摘要
本發明公開了一種飼用高效復合益生菌劑及制備方法，屬于生物技術領域。所述的復合益生菌劑由地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、嗜熱乳酸鏈球菌(Streptococcusthermophilus)、釀酒酵母菌(SaccharomycescerevisiaeHansen)分別發酵培養后按比例混合而成，有效微生物數目達到8～120×108CFU/mL；所述復合益生菌劑菌株間配伍科學合理，能殺死或抑制動物體內的病原菌，促進飼料的消化吸收，能大大減少飼料中抗生素的使用。
文檔編號C12N1/20GK103211085SQ201310141668
公開日2013年7月24日 申請日期2013年4月23日 優先權日2013年4月23日
發明者冠冰, 施安輝, 胥九兵, 孔健, 李克文, 劉海玉, 李方華 申請人:保齡寶生物股份有限公司