專利名稱：一種用畢赤酵母工程菌聯合降解植物的木質素的方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及構建和應用微生物工程菌的方法。具體是應用微生物工程菌降解植物原料的木質素的方法。
背景技術：
猛過氧化物酶(Manganese Peroxidase, MnP)、木質素過氧化物酶(LigninPeroxidase, LiP)和漆酶(Laccase)具有共同降解木質素的作用。植物資源不斷再生，十分豐富。植物的基本成分是纖維素、半纖維素和木質素。其中在制造沼氣和乙醇業中有用的成分是纖維素，次之是半纖維素。前者由葡萄糖構成，而后者由戊糖構成。這些糖都是轉化為乙醇和沼氣的物質。但是纖維素分子之間被木質素鑲嵌，被鑲嵌著的纖維素不能被水解。木質素是廣泛存在于植物體中的無定形的、分子結構中含有氧代苯丙醇或其衍生物結構單元的芳香性高聚物，形成纖維支架，結構十分穩定。欲利用纖維素則必須先降解木質素。當前用于降解木質素的方法有物理、化學和生物的方法。物理法主要是機械粉碎法、高溫熱解預處理以及輻射預處理等，但是物理法耗能大，并且需要特殊設備；化學法主要是酸或堿處理的方法。化學處理法具有工藝簡單的特點，但是處理后的纖維素和半纖維素損失大，并且產生大量的酸堿廢氣物污染環境。與化學法和物理法相t匕，當前應用的生物法主要是應用天然的表達分泌降解木質素的酶的白腐真菌與植物原料作用而降解植物原料中的木質素。應用白腐真菌降解植物的木質素的優勢在于，白腐真菌具有完整的降解木質素的酶系(錳過氧化物酶、木質素過氧化物酶和漆酶)，其不足之處是白腐真菌所含的錳過氧化物酶基因、木質素過氧化物酶基因和漆酶基因只是單拷貝，表達的酶的產量少，并且，白腐真菌生長緩慢，降解木質素的周期長。畢赤酵母(Pichia pastoris)是常用于生產重組蛋白的微生物。畢赤酵母營養要求低，能將表達的蛋白分泌到胞外，并且它具有組成型強啟動子:三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子(PGAP)。
發明內容
本發明構建含錳過氧化物酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌、含木質素過氧化物酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌和含漆酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌；用含錳過氧化物酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌、含木質素過氧化物酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌和含漆酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌與植物原料作用，通過工程菌分泌錳過氧化物酶、木質素過氧化物酶和漆酶而降解植物原料的木質素。本發明所采用的技術方案是:1.克隆基因:用反轉錄PCR技術或PCR技術從含錳過氧化物酶基因的微生物、含木質素過氧化物酶的微生物和含漆酶基因的微生物中分別克隆錳過氧化物酶、木質素過氧化物酶和漆酶基因。2.通過PCR擴增或DNA序列合成獲得構建表達載體所需的啟動子、信號肽、轉錄終止子和抗性基因表達框架的DNA序列。3.分別構建含錳過氧化物酶基因表達框架(巨大芽孢桿菌的磷酸甘油醛脫氫酶啟動子的DNA序列-信號肽的DNA序列-錳過氧化物酶基因的DNA序列-轉錄終止子的DNA序列)的畢赤酵母表達載體、含木質素過氧化物酶基因表達框架(巨大芽孢桿菌的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子的DNA序列-信號肽的DNA序列-木質素過氧化物酶基因的DNA序列-轉錄終止子的DNA序列)的畢赤酵母表達載體和含漆酶基因表達框架(巨大芽孢桿菌的磷酸甘油醛脫氫酶啟動子的DNA序列-信號肽的DNA序列-漆酶基因的DNA序列-轉錄終止子的DNA序列)的畢赤酵母表達載體。以上所構建的表達載體除了含有基因表達框架之外，還有大腸桿菌復制起點、G418基因表達框架和氨芐青霉素基因表達框架。3.通過電轉化方法將以上構建的3種畢赤酵母表達載體分別轉化畢赤酵母。根據G418抗性，篩選高拷貝重組了錳過氧化物酶基因表達框架的畢赤酵母重組子作為含錳過氧化物酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌；篩選高拷貝重組了含木質素過氧化物酶基因表達框架的畢赤酵母重組子作為含木質素過氧化物酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌；篩選高拷貝重組了漆酶基因表達框架的畢赤酵母重組子作為含漆酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌。4.將以上構建的含錳過氧化物酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌、含木質素過氧化物酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌和含漆酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌進行混合而作為降解植物的木質素的畢赤酵母工程菌的混合菌。5.將以上所述的含錳過氧化物酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌、含木質素過氧化物酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌和含漆酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌的混合菌與植物原料作用，通過工程菌分泌錳過氧化物酶、木質素過氧化物酶和漆酶而聯合降解植物的木質素。
`
本發明構建含錳過氧化物酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌、含木質素過氧化物酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌和含漆酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌，并將這三種畢赤酵母工程菌進行混合應用，將這種混合菌與植物原料作用，聯合降解植物的木質素的優點體現于:由于工程菌的構建選擇了強的啟動子調控基因，生產性能好的微生物作為工程菌構建的對象，并且選擇高拷貝的重組子作為工程菌，所以，本發明構建的含錳過氧化物酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌、含木質素過氧化物酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌和含漆酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌的混合菌不僅具備畢赤酵母本身的營養要求低、生長繁殖迅速等特點，還具備工程菌的良好表達分泌降解木質素的酶系(錳過氧化物酶、木質素過氧化物酶和漆酶)的功能，這三種工程菌的混合應用對植物的木質素的降解作用強于當前應用于降解植物的木質素的天然的表達分泌木質素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶的天然的微生物。
附圖1.畢赤酵母表達載體I。Pgap.畢赤酵母的三磷酸甘油醒脫氫酶啟動子；S.MFa因子信號肽；genel.猛過氧化物酶基因；TT.轉錄終止子；G418.G418基因表達框架；ColEl.大腸桿菌復制起點；AMP.氨芐青霉素基因表達框架。附圖2.畢赤酵母表達載體2。Pgap.畢赤酵母的三磷酸甘油醒脫氫酶啟動子；S.MF α因子信號肽；gene2.木質素過氧化物酶基因；TT.轉錄終止子；G418.G418基因表達框架；ColEl.大腸桿菌復制起點；AMP.氨芐青霉素基因表達框架。附圖3.畢赤酵母表達載體3。Pgap.畢赤酵母的三磷酸甘油醒脫氫酶啟動子；S.MF α因子信號肽；gene2.漆酶基因；TT.轉錄終止子；G418.G418基因表達框架；ColEl.大腸桿菌復制起點；AMP.氨芐青霉素基因表達框架。附圖4.掃描電鏡拍的畢赤酵母工程菌1、畢赤酵母工程菌2和畢赤酵母工程菌3與水稻秸桿作用4天后的照片。附圖5.掃描電鏡拍的含錳過氧化物酶、木質素過氧化物酶和漆酶的白腐真菌與水稻秸桿作用4天后的照片。附圖6.掃描電鏡拍的畢赤酵母與水稻秸桿作用4天后的照片。
附圖7.掃描電鏡拍的氨水與水稻秸桿作用4天后的照片。附圖8.掃描電鏡拍的天然的水稻秸桿的照片。
具體實施例方式下面采用非限定性實施例對本發明作進一步說明。實施例一1.1獲得酶基因及構建表達載體所需的相關原件(I)PCR擴增畢赤酵母的磷酸甘油醛脫氫的啟動子序列用蝸牛酶裂解畢赤酵母的細胞壁，提取畢赤酵母基因組DNA，應用上游引物(5，TTTACGTAGGATCCTTTTTTGTAGAAATGT3 )和下游引物(5 GGGCATGCTGTGTTTTGATAGTTGTT3 )進行PCR擴增，PCR產物經序列測定和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是其三磷酸甘油醛脫氫酶基因的啟動子序列。(2) PCR擴增枯草芽孢桿菌的漆酶基因用蝸牛酶裂解枯草芽孢桿菌的細胞壁，提取枯草芽孢桿菌基因組DNA，應用上游引物(5’ AACCTAGGATGACACTTGAAAAATTTGTGGATGC3’ )和下游引物(5 AAGCGGCCGCCTATTTATGGGGATCAGTTATA3’ )進行PCR擴增，PCR產物經序列測定和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是枯草芽孢桿菌的漆酶基因序列。(3)應用反轉錄PCR擴增白腐真菌的木質素過氧化物酶基因和錳過氧化物酶基因應用RNA提取試劑盒提取白腐真菌菌(白腐真菌模式菌種-黃孢原毛平革菌)的總RNA，以總RNA為模板，應用cDNA合成試劑盒反轉錄成cDNA。以上述合成的cDNA為模板,應用引物 I (5 ’ AAGAATTCGCCACCTGTTCCAACGGCAAGACCGTC3 ’)和引物 2 (5 ’ AAGCGGCCGCCTAAGCACCCGGAGGCGGAGGGATGCG3’)進行PCR擴增，獲得的PCR產物經序列分析和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是白腐真菌的木質素過氧化物酶基因序列；以上述合成的cDNA為模板,應用引物 3 (5 ’ CCGAATTCGCGGTCTGCCCCGACGGCACCCGCGTCA3 ’)和引物 4 (5 ’ TTGCGGCCGCCTATGCGGGACCGTTGAACTGGACACC3’)進行PCR擴增，獲得的PCR產物經序列分析和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是白腐真菌的錳過氧化物酶基因序列(4)應用PCR擴增畢赤酵母的rDNA序列提取畢赤酵母基因組DNA，以基因組DNA為模板，應用上游引物(5’CCGGTACCaggttcacctacggaaaccttg3，)和下游引物(5，CCTTCGAAtgtctcaaagattaagccatgc3’)進行PCR擴增，獲得的PCR產物經序列分析和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是畢赤酵母基因組中的rDNA序列。說明:①畢赤酵母和枯草芽孢桿菌基因組DNA提取方法:將菌細胞加于9mg/ml的蝸牛酶溶液(蝸牛酶用lmol/L山梨醇溶解)于30°C振搖30分鐘，然后按照常規的細菌基因組DNA提取方法提取其基因組DNA。②引物5’端的8個堿基是酶切保護堿基(2個堿基)和DNA限制性內切酶識別位點(有下劃線的6個堿基).
(5)合成如下氨芐青霉素抗性基因表達框架序列[如下序列有下劃線的是酶切保護堿基(2個堿基)和DNA限制性內切酶識別位點(6個堿基)，沒有下劃線的是氨芐青霉素抗性基因序列]5， AAGGTACCTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCAT AGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTG CAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAG GGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAG CTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTGCAGGCATCGTGGTG TCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCC CCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGC AGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTT TCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTG CCCGGCGTCAACACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAAC GTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGC AAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATAAGCTTGG3>(6)合成如下G418抗性基因表達框架序列[如下序列有下劃線的是酶切保護堿基(2個堿基)和DNA限制性內切酶識別位點(6個堿基)，沒有下劃線的是G418抗性基因序列]CCATCGATCCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATAC CATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTAT CGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAA ATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGC CATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACG CGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATT TTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGG TGAGTAACCATGCATCAT CAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTA ACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGT CGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCC TCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATGGTACCAA⑦合成MFa因子信號肽[如下序列有下劃線的是酶切保護堿基(2個堿基)和DNA限制性內切酶識別位點(6個堿基)，沒有下劃線的是α因子信號肽序列]:TTGCATGCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACT ACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGC TGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAG AAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTACACTAGTGG⑧合成轉錄終止子序列[如下序列有下劃線的是酶切保護堿基(2個堿基)和DNA限制性內切酶識別位點出個堿基)，沒有下劃線的是轉錄終止子序列]:TTACTAGTCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTT TATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATC AGCCTATCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGGTAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTT CTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGTACAGAAGATTAAGTGAGAAGTTCGTTTGTGCAAGCTTATCGATGG1.2構建畢赤酵母表達載體(I)由專業的DNA序列合成公式合成大腸桿菌復制起點的兩條堿基互補的雙鏈，并且在每條DNA鏈序列的兩端形成粘性末端。通過T4DNA連接酶的作用使其環化，形成DNA克隆載體。將這克隆載體 命名為PQ。(2)構建畢赤酵母表達載體1、畢赤酵母表達載體2和畢赤酵母表達載體3。①構建畢赤酵母表達載體1:通過DNA內切酶的酶切作用和T4DNA連接酶的連接作用依次將氨芐青霉素基因表達框架、三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子、MFa因子信號肽、錳過氧化物酶基因、轉錄終止子和G418基因表達框架重組于PQ表達載體的多克隆位點，構建成畢赤酵母表達載體I (附圖
1)。在表達載體I中，三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子、MFa因子信號肽、錳過氧化物酶基因和轉錄終止子統稱為含錳過氧化物酶基因的表達框架，它們的位置是:三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子-MF α因子信號肽-錳過氧化物酶基因-轉錄終止子。②構建畢赤酵母表達載體2:通過DNA內切酶的酶切作用和T4DNA連接酶的連接作用先將氨芐青霉素基因表達框架、三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子、MFa因子信號肽、木質素過氧化物酶基因、轉錄終止子和G418基因表達框架重組于PQ表達載體的多克隆位點，構建成畢赤酵母表達載體2 (附圖
2)。在表達載體2中，三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子、MFa因子信號肽、木質素過氧化物酶基因和轉錄終止子統稱為含木質素過氧化物酶基因的表達框架，它們的位置是:三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子-MF α因子信號肽-木質素過氧化物酶基因-轉錄終止子。⑧構建畢赤酵母表達載體3:通過DNA內切酶的酶切作用和T4DNA連接酶的連接作用先將氨芐青霉素基因表達框架連接于PQ載體的多克隆位點、三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子、MF α因子信號肽、漆酶基因、轉錄終止子、G418基因表達框架和rDNA重組于PQ表達載體的多克隆位點，構建成畢赤酵母表達載體3(附圖3)。在表達載體3中，三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子、MFa因子信號肽、漆酶基因和轉錄終止子統稱為含漆酶基因的表達框架，它們的位置是:三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子-MFa因子信號肽-漆酶基因-轉錄終止子。1.3構建畢赤酵母工程菌用常規的氯化鈣方法制備大腸桿菌感受態，將以上構建的載體DNA轉化于大腸桿菌，提取質粒(載體)DNA。按照常規方法制備畢赤酵母感受態，用常規的電轉化方法分別將以上構建的畢赤酵母表達載體1、畢赤酵母表達載體2和畢赤酵母表達載體3分別轉化畢赤酵母，將經過轉化作用的畢赤酵母細胞涂布于含G418濃度為5000 μ g/ml的YPD瓊脂(2%蛋白胨，I %酵母提取物，2%葡萄糖，1.5%瓊脂粉)平板，30°C培養3天。將在含G418濃度為700 μ g/ml的YPD瓊脂平板上生長的克隆轉種于G418濃度為20000 μ g/ml的YPD瓊脂平板上，30°C培養3天。挑選能在G418濃度為20000 μ g/ml的YPD瓊脂平板上生長的克隆進行搖瓶發酵表達，根據SDS-PAGE電泳初步分析目標蛋白的表達。用離子交換和分子篩層析方法分離純化各種目標蛋白，然后將分離純化的目標蛋白用蛋白印跡法進行驗證(說明.蛋白印跡:委托專業的多肽合成服務公司分別合成以上所述的錳過氧化物酶、木質素過氧化物酶和漆酶蛋白序列C端的35個氨基酸序列，將這些合成的多肽分別注射于家兔制備抗這些多肽的抗體而應用于蛋白印跡)證明以上所述的3種基因分別在3種畢赤酵母工程菌中表達和分泌到胞外。用常規方法進行酶活性測定，結果證明在畢赤酵母工程菌中表達分泌的重組漆酶具有漆酶活性、在畢赤酵母工程菌中表達分泌的重組木質素過氧化物酶具有木質素過氧化物酶活性和在畢赤酵母工程菌中表達分泌的重組錳過氧化物酶具有錳過氧化物酶活性。將重組了畢赤酵母表達載體I的重組子命名為畢赤酵母工程菌1，將重組了畢赤酵母表達載體2的重組子命名為畢赤酵母工程菌2，將重組了畢赤酵母表達載體3的重組子命名為畢赤酵母工程 菌3。1.4應用混合的將畢赤酵母工程菌1、畢赤酵母工程菌2和畢赤酵母工程菌3與植物作用，降解植物的木質素(I)將畢赤酵母工程菌1、畢赤酵母工程菌2和畢赤酵母工程菌3接種于YPD液體培養基(2%蛋白胨，I %酵母提取物，2%葡萄糖)中培養至0D_ = 6，取IOOOmL菌液接種于5000克(濕重)經過粉碎的水稻秸桿中，混勻，于30°C放置4天。用常規的硫酸法測定其經過三種畢赤酵母工程菌作用的水稻秸桿殘留木質素的含量為4.2%。(2)將具有分泌表達漆酶、木質素過氧化物酶和錳過氧化物酶的、通常應用于植物原料發酵沼氣和乙醇的預處理(降解木質素)的白腐真菌模式菌種-黃孢原毛平革菌接種于馬鈴薯培養基(20%馬鈴薯，2%葡萄糖)中培養至0D_ = 6，取IOOOmL菌液接種于5000克(濕重)經過粉碎的水稻秸桿中，混勻，于30°C放置4天，用常規的硫酸法測定其經過白腐真菌作用的水稻秸桿殘留木質素的含量為9.5%。(3)將畢赤酵母接種于YPD液體培養基中培養至0D_ = 6，取IOOOmL菌液接種于5000克(濕重)經過粉碎的水稻秸桿中，混勻，于30°C放置4天。用常規的硫酸法測定經過畢赤酵母作用的水稻秸桿殘留的木質素的含量為14.7%。(4)將2600g經過粉碎的水稻秸桿與3400mL5%氨水混勻，于30°C放置4天，用常規的硫酸法測定其經過氨水作用的水稻秸桿殘留木質素的含量為10.2%。(5)用常規的硫酸法測定沒有經過處理的秸桿的木質素的含量為15.0%。統計學分析結果表明，將畢赤酵母工程菌1、畢赤酵母工程菌2和畢赤酵母工程菌3混合應用降解的木質素的效果極顯著強于用畢赤酵母(P < 0.001)、極顯著強于白腐真菌(P < 0.001)和極顯著強于氨水(P < 0.001)的降解木質素的效果。實施例二2.1獲得酶基因及構建表達載體所需的相關原件(I)PCR擴增畢赤酵母的磷酸甘油醛脫氫的啟動子序列用蝸牛酶裂解畢赤酵母的細胞壁，提取畢赤酵母基因組DNA，應用上游引物(5，TTTACGTAGGATCCTTTTTTGTAGAAATGT3 )和下游引物(5 GGGCATGCTGTGTTTTGATAGTTGTT3 )進行PCR擴增，PCR產物經序列測定和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是其三磷酸甘油醛脫氫酶基因的啟動子序列。(2) PCR擴增枯草芽孢桿菌的漆酶基因
用蝸牛酶裂解枯草芽孢桿菌的細胞壁，提取枯草芽孢桿菌基因組DNA，應用上游引物(5’ AACCTAGGATGACACTTGAAAAATTTGTGGATGC3’ )和下游引物(5 AAGCGGCCGCCTATTTATGGGGATCAGTTATA3’ )進行PCR擴增，PCR產物經序列測定和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是枯草芽孢桿菌的漆酶基因序列。(3)應用反轉錄PCR擴增白腐真菌的木質素過氧化物酶基因和錳過氧化物酶基因應用RNA提取試劑盒提取白腐真菌菌屬的總RNA，以總RNA為模板，應用cDNA合成試劑盒反轉錄成cDNA。以上述合成的cDNA為模板，應用引物I (5 AAGAATTCGCCACCTGTTCCAACGGCAAGACCGTC3’ )和引物 2(5’ AAGCGGCCGCCTAAGCACCCGGAGGCGGAGGGATGCG3，)進行 PCR擴增，獲得的PCR產物經序列分析和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是白腐真菌(白腐真菌模式菌種-黃孢原毛平革菌)的木質素過氧化物酶基因序列；以上述合成的cDNA為模板,應用引物 3 (5 ’ CCGAATTCGCGGTCTGCCCCGACGGCACCCGCGTCA3 ’)和引物 4 (5 ’ TTGCGGCCGCCTATGCGGGACCGTTGAACTGGACACC3’)進行PCR擴增，獲得的PCR產物經序列分析和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是白腐真菌的錳過氧化物酶基因序列(4)應用PCR擴增畢赤酵母的rDNA序列提取畢赤酵母基因組DNA，以基因組DNA為模板，應用上游引物(5’ CCGGTACCaggttcacctacggaaaccttg3，)和下游引物(5，CCTTCGAAtgtctcaaagattaagccatgc3’ )進行 PCR擴增，獲得的PCR產物經序列分析和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是畢赤酵母基因組中的rDNA序列。說明:①畢赤酵母和枯草芽孢桿菌基因組DNA提取方法:將菌細胞加于9mg/ml的蝸牛酶溶液(蝸牛酶用lmol/L山梨醇溶解)于30°C振搖30分鐘，然后按照常規的細菌基因組DNA提取方法提取其基因組DNA。②引物5’端的8個堿基是酶切保護堿基(2個堿基)和HDNA限制性內切酶識別位點(有下劃線的6個堿基).
(5)合成如下氨芐青霉素抗性基因表達框架序列[如下序列有下劃線的是酶切保護堿基(2個堿基)和DNA限制性內切酶識別位點(6個堿基)，沒有下劃線的是氨芐青霉素抗性基因序列] 5，AAGGTACCTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCAT AGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTG CAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAG GGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAG CTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTGCAGGCATCGTGGTG TCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCC CCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGC AGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTT TCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTG CCCGGCGTCAACACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAAC GTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGC AAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATAAGCTTGG3>(6)合成如下G418抗性基因表達框架序列[如下序列有下劃線的是酶切保護堿基(2個堿基)和DNA限制性內切酶識別位點(6個堿基)，沒有下劃線的是G418抗性基因序列]CCATCGATCCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATAC CATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTAT CGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAA ATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGC CATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACG CGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATT TTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCAT CAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTT·AGTCTGACCATCTCATCTGTA ACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGT CGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCC TCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATGGTACCAA⑦合成MFa因子信號肽[如下序列有下劃線的是酶切保護堿基(2個堿基)和DNA限制性內切酶識別位點(6個堿基)，沒有下劃線的是α因子信號肽序列]:TTGCATGCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACT ACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGC TGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAG AAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTACACTAGTGG⑧合成轉錄終止子序列[如下序列有下劃線的是酶切保護堿基(2個堿基)和DNA限制性內切酶識別位點出個堿基)，沒有下劃線的是轉錄終止子序列]:TTACTAGTCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTT TATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATC AGCCTATCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGGTAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTT CTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGTACAGAAGATTAAGTGAGAAGTTCGTTTGTGCAAGCTTATC GATGG2.2構建畢赤酵母表達載體
(I)由專業的DNA序列合成公式合成大腸桿菌復制起點的兩條堿基互補的雙鏈，并且在每條DNA鏈序列的兩端形成粘性末端。通過T4DNA連接酶的作用使其環化，形成DNA克隆載體。將這克隆載體命名為PQ。(2)構建畢赤酵母表達載體1、畢赤酵母表達載體2和畢赤酵母表達載體3。①構建畢赤酵母表達載體1:通過DNA內切酶的酶切作用和T4DNA連接酶的連接作用依次將氨芐青霉素基因表達框架、三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子、MFa因子信號肽、錳過氧化物酶基因、轉錄終止子和G418基因表達框架重組于PQ表達載體的多克隆位點，構建成畢赤酵母表達載體I (附圖
1)。在表達載體I中，三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子、MFa因子信號肽、錳過氧化物酶基因和轉錄終止子統稱為含錳過氧化物酶基因的表達框架，它們的位置是:三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子-MF a因子信號肽-錳過氧化物酶基因-轉錄終止子。②構建畢赤酵母表達載體2:通過DNA內切酶的酶切作用和T4DNA連接酶的連接作用先將氨芐青霉素基因表達框架、三磷酸甘油醛脫氫 酶啟動子、MFa因子信號肽、木質素過氧化物酶基因、轉錄終止子和G418基因表達框架重組于PQ表達載體的多克隆位點，構建成畢赤酵母表達載體2 (附圖
2)。在表達載體2中，三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子、MFa因子信號肽、木質素過氧化物酶基因和轉錄終止子統稱為含木質素過氧化物酶基因的表達框架，它們的位置是:三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子-MF a因子信號肽-木質素過氧化物酶基因-轉錄終止子。③構建畢赤酵母表達載體3:通過DNA內切酶的酶切作用和T4DNA連接酶的連接作用先將氨芐青霉素基因表達框架連接于PQ載體的多克隆位點、三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子、MF a因子信號肽、漆酶基因、轉錄終止子、G418基因表達框架和rDNA重組于PQ表達載體的多克隆位點，構建成畢赤酵母表達載體3(附圖3)。在表達載體3中，三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子、MFa因子信號肽、漆酶基因和轉錄終止子統稱為含漆酶基因的表達框架，它們的位置是:三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子-MF a因子信號肽-漆酶基因-轉錄終止子。2.3構建畢赤酵母工程菌用常規的氯化鈣方法制備大腸桿菌感受態，將以上構建的載體DNA轉化于大腸桿菌，提取質粒(載體)DNA。按照常規方法制備畢赤酵母感受態，用常規的電轉化方法分別將以上構建的畢赤酵母表達載體1、畢赤酵母表達載體2和畢赤酵母表達載體3分別轉化畢赤酵母，將經過轉化作用的畢赤酵母細胞涂布于含G418濃度為5000 μ g/ml的YPD瓊脂(2%蛋白胨，I %酵母提取物，2%葡萄糖，1.5%瓊脂粉)平板，30°C培養3天。將在含G418濃度為700 μ g/ml的YPD瓊脂平板上生長的克隆轉種于G418濃度為20000 μ g/ml的YPD瓊脂平板上，30°C培養3天。挑選能在G418濃度為20000 μ g/ml的YPD瓊脂平板上生長的克隆進行搖瓶發酵表達，根據SDS-PAGE電泳初步分析目標蛋白的表達。用離子交換和分子篩層析方法分離純化各種目標蛋白，然后將分離純化的目標蛋白用蛋白印跡法進行驗證(說明.蛋白印跡:委托專業的多肽合成服務公司分別合成以上所述的錳過氧化物酶、木質素過氧化物酶和漆酶蛋白序列C端的35個氨基酸序列，將這些合成的多肽分別注射于家兔制備抗這些多肽的抗體而應用于蛋白印跡)證明以上所述的3種基因分別在3種畢赤酵母工程菌中表達和分泌到胞外。用常規方法進行酶活性測定，結果證明在畢赤酵母工程菌中表達分泌的重組漆酶具有漆酶活性、在畢赤酵母工程菌中表達分泌的重組木質素過氧化物酶具有木質素過氧化物酶活性和在畢赤酵母工程菌中表達分泌的重組錳過氧化物酶具有錳過氧化物酶活性。將重組了畢赤酵母表達載體I的重組子命名為畢赤酵母工程菌1，將重組了畢赤酵母表達載體2的重組子命名為畢赤酵母工程菌2，將重組了畢赤酵母表達載體3的重組子命名為畢赤酵母工程菌3。2.4應用混合的將畢赤酵母工程菌1、畢赤酵母工程菌2和畢赤酵母工程菌3與植物作用，降解植物的木質素(I)將畢赤酵母工程菌1、畢赤酵母工程菌2和畢赤酵母工程菌3接種于YPD液體培養基(2%蛋白胨，I %酵母提取物，2%葡萄糖)中培養至OD6tltl = 6，取IOOOmL菌液接種于5000克(濕重)經過粉碎的水稻秸桿中，混勻，于30°C放置4天。掃描電鏡觀察展示，水稻秸桿的細胞壁結構已經發生明顯的改變，大部分木質素已經被降解，纖維素裸露(附圖4)。(2)將具有分泌表達漆酶、木質素過氧化物酶和錳過氧化物酶的、通常應用于植物原料發酵沼氣和乙醇的預處理(降解木質素)的白腐真菌模式菌種-黃孢原毛平革菌接種于馬鈴薯培養基(20%馬鈴薯，2%葡萄糖)中培養至0D_ = 6，取IOOOmL菌液接種于5000克(濕重)經過粉碎的水稻秸桿中，混勻，于30°C放置4天。掃描電鏡觀察展示，水稻秸桿的細胞壁的結構僅部分發生改變，沒有明顯的纖維素裸露的現象(附圖5)。(3)將畢赤酵 母接種于YPD液體培養基中培養至0D_ = 6，取IOOOmL菌液接種于5000克(濕重)經過粉碎的水稻秸桿中，混勻，于30°C放置4天。掃描電鏡觀察展示，水稻秸桿的細胞壁結構完整(附圖6)。(4)將5000克(濕重)經過粉碎的水稻秸桿與1000mL5%氨水混勻，于30°C放置4天，掃描電鏡觀察展示，水稻秸桿的細胞壁結構比較完整(附圖7)。(5)掃描電鏡觀察展示，沒有經過處理的秸桿結構完整(附圖8)。
權利要求
1.一種用畢赤酵母工程菌聯合降解植物的木質素的方法，其特征在于:通過分子生物學技術從微生物中克隆錳過氧化物酶基因、木質素過氧化物酶基因和漆酶基因；構建含錳過氧化物酶基因表達框架的畢赤酵母表達載體、含木質素過氧化酶基因表達框架的畢赤酵母表達載體和含漆酶基因表達框架的畢赤酵母表達載體；分別將上述構建的畢赤酵母表達載體轉化畢赤酵母，并通過G418抗性篩選獲得表達載體高拷貝重組的含錳過氧化物酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌、含木質素過氧化物酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌和含漆酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌；將以上所述的三種畢赤酵母工程菌混合應用，通過表達和分泌錳過氧化物酶、木質素過氧化物酶和漆酶而聯合降解植物的木質素。
2.根據權利要求1所述一種用畢赤酵母工程菌聯合降解植物的木質素的方法，其特征在于:利用權利要求1所述的方法制備降解植物的木質素的含錳過氧化物酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌、含木質素過氧化物酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌和含漆酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌的 混合菌的產品。
全文摘要
本發明公開了一種用畢赤酵母工程菌聯合降解植物的木質素的方法。屬生物技術領域。從微生物中克隆錳過氧化物酶基因、木質素過氧化物酶基因和漆酶基因；構建含錳過氧化物酶基因的畢赤酵母表達載體、含木質素過氧化物酶基因的畢赤酵母表達載體和含漆酶基因的畢赤酵母表達載體。分別將以上所述的三種表達載體轉化畢赤酵母，用G418抗性篩選而獲得含錳過氧化物酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌、含木質素過氧化物酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌和含漆酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌。將這三種工程菌與植物原料作用而聯合降解植物的木質素。本發明的優點體現于這三種畢赤酵母工程菌對木質素的降解作用強于當前應用于降解植物的木質素的天然的微生物。
文檔編號C12N15/53GK103233025SQ20131013463
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月3日 優先權日2013年4月3日
發明者張愛聯, 符仙, 楊穗珊, 尹慧祥 申請人:中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所