專利名稱：一種提取銀合歡葉片組織中總rna的方法
技術領域：
本發明屬于生物基因技術領域，尤其涉及一種提取銀合歡葉片組織中總RNA的方法。
背景技術：
銀合歡原產美洲，是一種重要的熱帶、亞熱帶木本豆科牧草和速生林樹種，可以用于飼料、綠肥、燃料、林木及植物修復、水土保持、培養食用菌、保健和藥用等，被聯合國糧農組織的飼料專家譽為干旱地區的“蛋白質倉庫”和“奇跡樹”。我國于1957年開始進行銀合歡引種栽培研究，并選育“熱研I號銀合歡”。目前，銀合歡異木虱已成為影響銀合歡種植和利用的最主要害蟲。銀合歡抗異木虱育種已成為急待解決的問題，然而，作為熱帶豆科木本牧草的銀合歡育種時間長，特別是僅憑表現型選擇親本具有不確定性。應用分子標記輔助育種，可以合理篩選親本、加速育種進程。從生物組織中提取高質量的總RNA對于分析基因的表達和調控、基因克隆及其功能鑒定、分子標記輔助育種等具有重要意義。不同生物組織，特別是高等植物，常常由于富含多酚氧化物、多糖、蛋白質等，使得其總RNA提取十分困難。銀合歡植物葉片中粗蛋白質含量為22 % 29 %、含羞草素2 % 5 %，其總RNA提取更加困難。本發明人查閱了大量的文獻，均未發現銀合歡葉片總RNA的提取報道。
發明內容
本發明提供了一種提取銀合歡葉片組織中總RNA的方法，旨在解決目前無法從銀合歡葉片提取總RNA的問題。本發明的目 的在于提供一種提取銀合歡葉片組織中總RNA的方法，該方法包括以下步驟:步驟一，將十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)提取液充分搖勻，取15mL提取液于50mL離心管中，并在65 °C水浴中預熱；步驟二，取2.0 3.0g銀合歡葉片在液氮中磨成細粉末，轉入盛有預熱的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)提取液的離心管中，并向離心管中加入0.SmL的β-巰基乙醇、
0.9 1.0g的交聯聚乙烯基吡咯烷酮(PVPP)粉末，旋渦混勻IOmin ；步驟三，在65°C下對離心管水浴20min，每5min上下振蕩離心管I次；步驟四，加入15mL配比為24: I的氯仿與異戊醇混合液，旋渦混勻lOmin，冰浴5min ；步驟五，加冰冷的5mol/L、pH為4.8的醋酸鉀(KAc) ImL,輕輕搖動離心管，使上面的液體混勻，冰浴30min ；步驟六,在4°C、18000r/min條件下離心15min,將上清液轉入另一支50mL的離心管中；步驟七，向盛有上清液的離心管中加入等體積的配比為25: 24: I的酚、氯仿、異戍醇混合液，旋潤混勻IOmin ；步驟八,在4°C、12000r/min條件下,離心IOmin,將上清液轉入另一支50mL的離心管中；步驟九，加入等體積的配比為24: I的氯仿與異戊醇混合液，旋渦混勻5min ；步驟十,在4°C、12000r/min條件下離心IOmin,將上清液轉入另一支50mL的離心管中，加入0.3mL的P -巰基乙醇，再加入相當于上清液體積1/3的8mol/L的LiCl溶液，在-30°C下放置8h ；步驟^^一，將離心管置于冰上解凍，在4°C、18000r/min條件下離心lOmin，棄上清液；步驟十二，將沉淀用lmL75%的乙醇沖洗，轉入1.5mL離心管中，在4°C、15000r/m條件下離心15min,棄上清液；步驟十三，用0.81^75%的乙醇洗漆沉淀,在4°C、13000r/min條件下離心5min,棄
上清液；步驟十四， 將試管置于超凈工作臺上，并倒放在滅菌濾紙上，涼干5 IOmin ；步驟十五，加入50 L經lg/L焦碳酸二乙酯(DEPC)處理過的去離子雙蒸水，將沉淀溶解后置_80°C保存備用。進一步，該方法所用到的塑料離心管、移液搶頭均用lg/L的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液浸泡過夜，然后高溫高壓滅菌，烘干備用；研缽及金屬藥匙用錫箔紙包好，并在180°C烘箱中烘烤8h。進一步，采用紫外分光光度計分別測定樣品在260nm、280n h處的OD值，通過計
算OD26tZOD28tl的比值可對RNA質量進行檢測。進一步，純凈的RNA樣品0D26(i/0D28(i的比值應在1.7-2.0之間，否則表明樣品中有蛋白質或酚試劑的污染；OD26tlAD23tl的比值大于2.0則表明樣品中有小分子、鹽和DNA的污染；該方法所提取的銀合歡葉片組織總RNA的0D26(i/0D28(i的比值為1.8 2.0 ；RNA的濃度在9.0 11.0 ii g/ ii L，2.0 3.0g的銀合歡葉片可得到400 600 y g的總RNA。進一步，取部分RNA提取液進行1.5%瓊脂糖甲醛變性凝膠電泳檢測，通過分析帶型可判斷所提取RNA的完整性。進一步，該方法獲得的RNA提取液經1.5%瓊脂糖凝膠變性電泳檢測條帶清晰，且28S亮度為18S的1.9 2.1倍，完全可用于銀合歡分子生物學相關研究。進一步，該方法所選用的銀合歡植株的葉片為2 3月齡。進一步，該方法提取銀合歡葉片組織中總RNA時，采用UNIVERSAL32R型高速冷凍離心機進行離心處理。本發明提供的提取銀合歡葉片組織中總RNA的方法，在提取銀合歡葉片組織中總RNA過程中，通過加入了 0.9 1.0g的交聯聚乙烯基吡咯烷酮(PVPP)粉末全面去除多糖、蛋白質和粘稠透明不溶物；該方法所提取的銀合歡葉片組織總RNA的OD26tlAD28tl的比值為1.8 2.0，所得RNA的純度及產量較高，同時該方法獲得的RNA提取液經1.5%瓊脂糖凝膠變性電泳檢測時，條帶清晰，RNA的完整性好，所提取RNA完全可用于銀合歡分子生物學相關研究，對于分析銀合歡基因的表達和調控、基因克隆及其功能鑒定、分子標記輔助育種具有重要意義，實用性強，具有較強的推廣與應用價值。
圖1是本發明實施例提供的提取銀合歡葉片組織中總RNA的方法的實現流程圖；圖2是本發明實施例提供的所提取葉片總RNA經1.5%瓊脂糖凝膠變性電泳檢測的結果示意圖。
具體實施例方式為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步的詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定發明。圖1示出了本發明實施例提供的提取銀合歡葉片組織中總RNA的方法的實現流程。該方法包括以下步驟:在步驟SlOl中，將十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)提取液充分搖勻，取15mL提取液于50mL離心管中，并在65 °C水浴中預熱；在步驟S102中，取2.0 3.0g銀合歡葉片在液氮中磨成細粉末，轉入盛有預熱的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)提取液的離心管中，并向離心管中加入0.8mL的β-巰基乙醇、0.9 1.0g的交聯聚乙烯基吡咯烷酮(PVPP)粉末，旋渦混勻IOmin ；在步驟S103中，在65°C下對離心管水浴20min，每5min上下振蕩離心管I次；在步驟S104中，加入15mL配比為24: I的氯仿與異戊醇混合液，旋渦混勻lOmin，冰浴5min ；在步驟S105中，加冰冷的5mol/L、pH為4.8的醋酸鉀(KAc) 7mL，輕輕搖動離心管，使上面的液體混勻，冰浴30min ；在步驟S106中，在4°C、18000r/min條件下離心15min,將上清液轉入另一支5OmL的離心管中；在步驟S107中，向盛有上清液的離心管中加入等體積的配比為25: 24: I的酚、氯仿、異戊醇混合液，旋渦混勻IOmin ；在步驟S108中，在4°C、12000r/min條件下，離心lOmin，將上清液轉入另一支50mL的離心管中；在步驟S109中，加入等體積的配比為24: I的氯仿與異戊醇混合液，旋渦混勻5min ；在步驟SllO中，在4°C、12000r/min條件下離心lOmin，將上清液轉入另一支50mL的離心管中，加入0.3mL的β -巰基乙醇，再加入相當于上清液體積1/3的8mol/L的LiCl溶液，在_30°C下放置8h ；在步驟SI 11中，將離心管置于冰上解凍，在4°C、18000r/min條件下離心lOmin，棄
上清液；在步驟S112中，將沉淀用lmL75%的乙醇沖洗，轉入1.5mL離心管中，在4°C、15000r/m條件下離心15min,棄上清液；
在步驟SI 13中，用0.8mL75%的乙醇洗滌沉淀，在4°C、13000r/min條件下離心5min,棄上清液；在步驟S114中，將試管置于超凈工作臺上，并倒放在滅菌濾紙上，涼干5 IOmin ；在步驟S115中，加入50iiL經lg/L焦碳酸二乙酯(DEPC)處理過的去離子雙蒸水，將沉淀溶解后置_80°C保存備用。在本發明實施例中，該方法所用到的塑料離心管、移液搶頭均用lg/L的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液浸泡過夜，然后高溫高壓滅菌，烘干備用；研缽及金屬藥匙用錫箔紙包好，并在180°C烘箱中烘烤8h。在本發明實施例中，采用紫外分光光度計分別測定樣品在260n m、280n m處的OD值，通過計算0D26(i/0D28(i的比值可對RNA質量進行檢測。在本發明實施例中，純凈的RNA樣品0D26(i/0D28(i的比值應在1.7 2.0之間，否則表明樣品中有蛋白質或酚試劑的污染；0D26(i/0D23(i的比值大于2.0則表明樣品中有小分子、鹽和DNA的污染；該方法所提取的銀合歡葉片組織總RNA的0D26(i/0D28(i的比值為1.8 2.0 ；RNA的濃度在9.0 11.0 ii g/ ii L，2.0 3.0g的銀合歡葉片可得到400 600 y g的總RNA。在本發明實施例中，取部分RNA提取液進行1.5%瓊脂糖甲醛變性凝膠電泳檢測，通過分析帶型可判斷所提取RNA的完整性。在本發明實施例中，該方法獲得的RNA提取液經1.5%瓊脂糖凝膠變性電泳檢測條帶清晰，且28S亮度為18S的1.9 2.1倍，完全可用于銀合歡分子生物學相關研究。在本發明實施例中，該方法所選用的銀合歡植株的葉片為2 3月齡。在本發明實施例中，該方法提取銀合歡葉片組織中總RNA時，采用UNIVERSAL32R型高速冷凍離心機進行離心處理。下面結合附圖及具體實施例對本發明的應用原理作進一步描述。用于試驗的植物材料:銀合歡植株的葉片(2 3月齡)；化學試劑:液氮、lg/L的焦碳酸二乙酯(DEPC)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)提取液、P -巰基乙醇、交聯聚乙烯基吡咯烷酮(PVPP)、5mol/L醋酸鉀(KAc)、8mol/L的氯化鋰(LiCl)、酚/氯仿/異戊醇(25: 24: I)混合液、氯仿/異戊醇(24: I)混合液、10 XMOPS電極緩沖液、瓊脂糖； 儀器設備:超凈工作臺、UNIVERSAL32R型高速冷凍離心機、紫外分光光度計(3300)、微量移液槍、DDY-6C型電泳儀、Alphalmager2200型凝膠成像系統。銀合歡葉片組織中總RNA提取的技術方案如下:第一步:凡用到的塑料離心管、移液搶頭均用lg/L的DEPC水溶液浸泡過夜，然后高溫高壓滅菌，烘干備用；研缽及金屬藥匙用錫箔紙包好 并在180°C烘箱中烘烤8h以上以備用；第二步:將CTAB提取液充分搖勻，取15mL提取液于50mL離心管中，65°C水浴中預熱；第三步:取2.0 3.0g銀合歡葉片在液氮中磨成細粉末，轉入預熱的CTAB提取液中；加入0.8mL的β -巰基乙醇、0.9 1.0g的PVPP粉末，旋渦混勻IOmin ；第四步:65°C水浴20min，每5min上下振蕩試管I次；第五步:加15mL氯仿:異戍醇(24: I),旋潤混勻lOmin,冰浴5min ;第六步:加冰冷的5mo I/L的KAc (pH4.8) 7mL，輕輕搖動試管，使上面的液體混勻，冰浴30min ；第七步:在4°C、18000r/min條件下離心15min，將上清液轉入另一支50mL的離心管中；第八步:加等體積的酚:氯仿:異戊醇(25: 24: I)，旋渦混勻IOmin ；第九步:40C、12000r/min,離心lOmin，將上清液轉入另一支50mL的離心管中；第十步:加等體積氯仿 :異戊醇(24: I)，旋渦混勻5min ；第^^一步:在4°C、12000r/min條件下離心lOmin，將上清液轉入另一支50mL的離心管中，力口
0.3mLi3 -巰基乙醇，再加入相當于上清液體積1/3的8mol/L的LiCl溶液，_30°C條件下放置8h ；第十二步:離心管置于冰上解凍，在4°C、18000r/min條件下離心lOmin，棄上清液；第十三步:沉淀用lmL75%的乙醇沖洗，轉入1.5mL離心管中，在4°C、15000r/m條件下離心15min,去上清液；第十四步:用0.811^75%的乙醇洗漆沉淀,在4°C、13000r/min條件下離心5min,去上清液；第十五步:試管置于超凈臺上，并倒放在滅菌濾紙上，涼干5 IOmin ；第十六步:力口50 μ L經DEPC處理過的去離子雙蒸水(dd H2O)將沉淀溶解，置_80°C保存備用。本發明技術方案帶來的有益效果RNA質量的檢測:用紫外分光光度計分別測定樣品在260n m、280n m處的OD值，計算0D26Q/0D28Q的比值。純凈的RNA樣品0D26Q/0D28Q的比值應在1.7-2.0之間，否則表明樣品中有蛋白質或酚試劑的污染；OD26(i/OD23(i的比值大于2.0則表明樣品中有小分子、鹽和DNA的污染。本發明所提取的銀合歡葉片組織總RNA的OD26tZOD28tl的比值為1.8 2.0 ;RNA的濃度在9.0 IL O μ g/ μ L，2.0 3.0g的材料可得到400 600 μ g的總RNA。同時，取部分RNA提取液進行1.5%瓊脂糖甲醛變性凝膠電泳檢測，分析帶型以判斷所提RNA的完整性。經1.5%瓊脂糖凝膠變性電泳檢測條帶清晰，且28S亮度為18S的
1.9 2.1倍(如圖2所示)，本方法所提取的RNA質量完全可用于銀合歡分子生物學相關研究。本發明實施例提供的提取銀合歡葉片組織中總RNA的方法，在提取銀合歡葉片組織中總RNA過程中，通過加入了 0.9 1.0g的交聯聚乙烯基吡咯烷酮(PVPP)粉末全面去除多糖、蛋白質和粘稠透明不溶物；該方法所提取的銀合歡葉片組織總RNA的OD26tlAD28tl的比值為1.8 2.0，所得RNA的純度及產量較高，同時該方法獲得的RNA提取液經1.5%瓊脂糖凝膠變性電泳檢測時，條帶清晰，RNA的完整性好，所提取RNA完全可用于銀合歡分子生物學相關研究，對于分析銀合歡基因的表達和調控、基因克隆及其功能鑒定、分子標記輔助育種具有重要意義，實用性強，具有較強的推廣與應用價值。
以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種提取銀合歡葉片組織中總RNA的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: 步驟一，將十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)提取液充分搖勻，取15mL提取液于5OmL離心管中，并在65 °C水浴中預熱； 步驟二，取2.0 3.0g銀合歡葉片在液氮中磨成細粉末，轉入盛有預熱的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)提取液的離心管中，并向離心管中加入0.8mL的P -巰基乙醇、0.9 1.0g的交聯聚乙烯基吡咯烷酮(PVPP)粉末，旋渦混勻IOmin ； 步驟三，在65°C下對離心管水浴20min，每5min上下振蕩離心管I次； 步驟四，加入15mL配比為24: I的氯仿與異戍醇混合液,旋潤混勻IOmin,冰浴5min ;步驟五，加冰冷的5mol/L、pH為4.8的醋酸鉀(KAc) 7mL，輕輕搖動離心管，使上面的液體混勻，冰浴30min ； 步驟六，在4°C、18000r/min條件下離心15min,將上清液轉入另一支50mL的離心管中； 步驟七，向盛有上清液的離心管中加入等體積的配比為25: 24: I的酚、氯仿、異戊醇混合液，旋潤混勻IOmin ； 步驟八，在4°C、12000r/min條件下,離心IOmin,將上清液轉入另一支50mL的離心管中； 步驟九，加入等體積的配比為24: I的氯仿與異戊醇混合液，旋渦混勻5min; 步驟十，在4° C、12000r/min條件下離心lOmin，將上清液轉入另一支50mL的離心管中，加入0.3mL的P -巰基乙醇，再加入相當于上清液體積1/3的8mol/L的LiCl溶液，在_30°C下放置8h ； 步驟i^一，將離心管置于冰上解凍，在4°C、18000r/min條件下離心lOmin，棄上清液；步驟十二，將沉淀用lmL75%的乙醇沖洗，轉入1.5mL離心管中，在4°C、15000r/m條件下離心15min,棄上清液； 步驟十三,用0.81^75%的乙醇洗漆沉淀,在4°C、13000r/min條件下離心5min,棄上清液； 步驟十四，將試管置于超凈工作臺上，并倒放在滅菌濾紙上，涼干5 IOmin ； 步驟十五，加入50 經lg/L焦碳酸二乙酯(DEPC)處理過的去離子雙蒸水，將沉淀溶解后置-80°C保存備用。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該方法所用到的塑料離心管、移液搶頭均用lg/L的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液浸泡過夜，然后高溫高壓滅菌，烘干備用；研缽及金屬藥匙用錫箔紙包好，并在180°C烘箱中烘烤8h。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，采用紫外分光光度計分別測定樣品在260nm 、280nm處的OD值，通過計算0D26(l/0D28(l的比值可對RNA質量進行檢測。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，純凈的RNA樣品OD26tlAD28tl的比值應在1.7-2.0之間，否則表明樣品中有蛋白質或酚試劑的污染；OD26tlAD23tl的比值大于2.0則表明樣品中有小分子、鹽和DNA的污染； 該方法所提取的銀合歡葉片組織總RNA的0D26(i/0D28(i的比值為1.8 2.0 ；RNA的濃度在9.0 11.0 ii g/ ii L，2.0 3.0g的銀合歡葉片可得到400 600 y g的總RNA。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，取部分RNA提取液進行1.5%瓊脂糖甲醛變性凝膠電泳檢測，通過分析帶型可判斷所提取RNA的完整性。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，該方法獲得的RNA提取液經1.5%瓊脂糖凝膠變性電泳檢測條帶清晰，且28S亮度為18S的1.9 2.1倍，完全可用于銀合歡分子生物學相關研究。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該方法所選用的銀合歡植株的葉片為2 3月齡。
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該方法提取銀合歡葉片組織中總RNA時，采用UNIVERSAL32R型高速 冷凍離心機進行離心處理。
全文摘要
本發明公開了一種提取銀合歡葉片組織中總RNA的方法，在提取銀合歡葉片組織中總RNA過程中，通過加入了0.9～1.0g的交聯聚乙烯基吡咯烷酮(PVPP)粉末全面去除多糖、蛋白質和粘稠透明不溶物；該方法所提取的銀合歡葉片組織總RNA的OD260/OD280的比值為1.8～2.0，所得RNA的純度及產量較高，同時該方法獲得的RNA提取液經1.5％瓊脂糖凝膠變性電泳檢測時，條帶清晰，RNA的完整性好，所提取RNA完全可用于銀合歡分子生物學相關研究，對于分析銀合歡基因的表達和調控、基因克隆及其功能鑒定、分子標記輔助育種具有重要意義，實用性強，具有較強的推廣與應用價值。
文檔編號C12N15/10GK103232997SQ20131013446
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月18日 優先權日2013年4月18日
發明者鄒冬梅, 蔣昌順, 申建斌, 吳成貢 申請人:中國熱帶農業科學院分析測試中心