專利名稱：一種腫瘤細胞轉移能力評價方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物醫藥領域，特別涉及一種腫瘤細胞轉移能力評價方法。
背景技術：
在過去的幾十年里，抗腫瘤藥的篩選主要是考察其對快速生長細胞的毒性作用。隨著腫瘤生物學研究的發展，人們認識到:腫瘤細胞不僅具有旺盛的增殖能力，而且還具有破壞自身組織、浸潤相鄰組織以及浸潤血管或淋巴管并隨著血液或淋巴液轉移到其他組織的能力。腫瘤和正常組織的相互作用與腫瘤的血管生成、侵襲和轉移等特性有很大的關系。腫瘤轉移已成為近年來的研究熱點之一，現有腫瘤轉移的研究主要包括體外或體內模型。體內模型主要采用免疫功能低下的小鼠或大鼠來研究，主要包括:1.自發模型；
2.基因工程模型；3.腫瘤移 植模型。其中，自發模型的模型低重復性和基因工程模型的高價格以及高技術要求使得這兩種模型更多的應用于腫瘤病因和藥物預防研究中。可移植腫瘤模型以其良好的相似性和重復性廣泛應用于抗腫瘤藥的臨床前篩選，但該模型有重要的缺陷，即皮下移植很少轉移，侵襲力也很弱，不適合用于針對原發灶的自發轉移進行新藥篩選。另外，抗腫瘤轉移的臨床藥效學評價，最直接的支持依據應該是對轉移灶的影響結果。但在對轉移灶出現的時間、部位、病理類型，尤其是微小轉移灶的檢測方面，目前存在有相當大的困難。因此很難獲得抗腫瘤轉移的直接指標。通常的采用的腫瘤緩解率、增長速度、輔助性的腫瘤轉移生化指標等，難以為抗腫瘤轉移作用提供客觀的直接依據，更難以將抗腫瘤轉移作用與抗腫瘤作用區別開來。這些都給受試藥物抗腫瘤轉移作用的判斷帶來了挑戰。體外模型主要集中于單個分子的機制研究和侵襲轉移能力的檢測，現有測試方法不僅不方便，而且僅考慮單個分子，造成測試結果不準確。在任何國家新藥研發都是一個高投入，高風險耗時長但一旦成功便會有巨大效益的艱苦過程。如何在較短的研發周期內研發出高效、安全的抗腫瘤藥物是一個世界性難題。特別是我國長期以仿制國外藥品為主，由于研究經費短缺，技術、設備落后、供篩樣品過少等原因，使新藥篩選與相關基礎研究成為新藥研究系統工程中最薄弱的環節。因此，本專利涉及的用于評價抑制腫瘤細胞生長和轉移的抗腫瘤藥物的方法在抗腫瘤藥物研發領域有著廣闊的推廣應用前景。
發明內容
發明目的:本發明的第一目的是提供一種工藝簡單、效率高的腫瘤細胞轉移能力評價方法。本發明的第二目的是提供了利用上述方法篩選的轉移能力強的腫瘤細胞。本發明的第三目的是提供了上述轉移能力強的腫瘤細胞在抗腫瘤轉移藥物篩選中的應用。技術方案:本發明提供的一種腫瘤細胞轉移能力評價方法，包括以下步驟:
(I)腫瘤細胞的采集與培養:采集待評價腫瘤細胞得細胞懸液，培養細胞懸液；(2)腫瘤細胞轉移能力評價:將培養后的細胞懸液于聚丙烯酰胺培養基底上繼續培養，給予抗腫瘤細胞轉移藥物后，觀察細胞形態，定量分析細胞層的面積、細胞與聚丙烯酰胺培養基底連接的強度、細胞間連接的強度并作為腫瘤細胞轉移能力評價標準，藥物刺激后Colo205細胞面積大于20 μ m2、細胞間強度變化10倍以上者即判定為有效體。步驟(I)中，腫瘤細胞的采集方法為:取待評價腫瘤細胞進行單克隆化，并制成細胞懸液；優選地，本發明采用以下方法，以進一步提高篩選精度:取待評價腫瘤細胞進行單克隆化得待評價腫瘤細胞的單克隆細胞，以10 μ M Staurosporin對單克隆細胞進行刺激誘導單克隆細胞之間恢復細胞連接，選取刺激前后細胞面積變化最大的單克隆細胞制成細胞懸液；更進一步優選地，所述腫瘤細胞為Colo205細胞，腫瘤細胞的采集方法為:取Colo205細胞進行單克隆化，以ΙΟμΜ Staurosporin對單克隆細胞進行刺激誘導恢復細胞連接,選取刺激前后細胞面積變化最大的克隆為實驗對象，并制備細胞懸液。步驟(I)中，腫瘤細胞的培養方法為:離心細胞懸液，沉淀加入DMEM10%血清培養基于C02培養箱中培養，培養溫度為37°C，培養時間24-48h，pH為7.0-7.2，CO2濃度為5%。步驟(2)中，抗腫瘤轉移藥物為Nocodazole、Staurosporin。步驟(2)中，細胞形態、細胞層面積的測定方法為:通過細胞膜免疫熒光染色、生物顯微鏡成像來對細胞形態，細胞層面積進行測定。步驟(2)中，細胞與聚丙烯酰胺培養基底連接的強度的測定方法為:對細胞與基底部連接的蛋白標識物分子Vinculin的信號數量進行定量測定。步驟⑵中，細胞間連接的強度:通過對細胞間連接分子E-cadherin蛋白質進行免疫染色，繼而進行定量測定。本發明還給出了 上述的腫瘤細胞轉移能力評價方法在抗腫瘤轉移藥物篩選中的應用，以腫瘤細胞轉移能力評價的結果作為抗腫瘤轉移藥物篩選的依據進行抗腫瘤轉移藥物篩選。有益效果:本發明提供的腫瘤細胞轉移能力評價方法成本低廉、操作簡便、結果易判、快速準確。本發明利用上述方法，以分子生物學以及細胞生物學手段為基礎，篩選出轉移性較強腫瘤細胞，并建立體外癌細胞轉移模型，能夠高效篩選出對癌癥細胞的轉移具有潛在抑制作用的藥物，為高通量藥物篩選提供簡單易行的方法，縮短新藥的開發周期，該方法具有成本低廉、操作簡便、結果易判、快速準確的特點。傳統新藥開發方法通常需要確定化合物、研發、臨床一二三期，通常需要經歷10-15年才能開發出新的藥物，采用本方法利用轉移能力強的腫瘤細胞可直接高通量篩選現有藥物，篩選后僅需進行臨床三期評價即可得到抗腫瘤轉移新藥，開發周期大大縮短。
:圖1為藥物刺激前后大腸癌上皮細胞Colo205的變化。圖2為藥物刺激前后大腸癌上皮細胞Colo205的變化；圖中存在綠色的E-cadherin免疫熒光染色。
圖3為藥物刺激前后大腸癌上皮細胞CaCo2的變化；圖中存在綠色的E-cadherin免疫熒光染色。圖4為進行藥物篩選的96孔板。圖5為利用本發明轉移能力強的腫瘤細胞篩選抗腫瘤轉移藥物流程圖。
具體實施方式
:根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結果僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。本發明所用試劑及其來源為:Staurosporiin S4400Sigma-AldrichNocodazole ml404Sigma-AldrichDMEM 培養基 I2491-Ol5InvitrogenE-cadherin 抗體 abl416AbcamVinculin 抗體 V4319Sigma-Aldrich本發明所用軟件及其來源為:本項目所采用軟件來源為imagej軟件進行定量分析。參考:http: //rsb.1nfo, nih.gov/i i/實施例1利用腫瘤細胞轉移能力評價方法篩選轉移能力強的腫瘤細胞對腫瘤細胞Colo205、CaCo2評價其轉移能力，包括以下步驟:(I)腫瘤細胞的采集與培養:取Colo205、CaCo2細胞進行單克隆化，以10M Staurosporin對單克隆細胞進行刺激誘導恢復細胞連接，選取刺激前后細胞面積變化最大的克隆為實驗對象，并制備細胞懸液；也可以采用下述方法采集腫瘤細胞:取待評價腫瘤細胞進行單克隆化，并制成細胞懸液；或，取待評價腫瘤細胞進行單克隆化得待評價腫瘤細胞的單克隆細胞，以Staurosporin對單克隆細胞進行刺激誘導單克隆細胞之間恢復細胞連接,選取刺激前后細胞面積變化最大的單克隆細胞制成細胞懸液；離心細胞懸液，沉淀加入DMEM10%血清培養基于CO2培養箱中培養，培養溫度為37°C，培養時間為 24-48h, pH 為 7.0-7.2，CO2 濃度為 5%。(2)腫瘤細胞轉移能力評價:將細胞懸液于聚丙烯酰胺培養基底上培養，給予抗腫瘤細胞轉移藥物后，觀察細胞形態，定量分析細胞層的面積、細胞與聚丙烯酰胺培養基底連接的強度、細胞間連接的強度，所述抗腫瘤細胞轉移藥物可選擇Nocodazole或Staurosporin中的一種，具體而言:a.細胞形態和細胞層面積的測定方法為:通過細胞膜免疫熒光染色、生物顯微鏡DIC成像來對細胞形態，細胞層面積進行測定；當細胞層面積小于20 μ m2即認為其對細胞細胞連接無影響。細胞面積測定方法:http://rsb.1nfo, nih.gov/ii/plugins/cell-counter, html
b.細胞與聚丙烯酰胺培養基底連接的強度的測定方法為:對細胞與基底部連接的蛋白標識物分子Vinculin的信號數量進行定量測定。測定細胞與聚丙烯酰胺培養基底連接的強度測定方法:http://rsb.1nfo, nih.gov/ii/plugins/particle-analyzer.htmlc.細胞與細胞間連接的強度:通過對細胞間連接分子E-cadherin蛋白質進行免疫染色，以細胞連接處與細胞質中E-cadherin的免疫熒光強度之比作為細胞連接的強度指標，繼而進行定量測定。細胞連接強度測定方法:http://rsb.1nfo, nih.gov/ii/plugins/radial-profiIe.html測定結果(表一):
權利要求
1.一種腫瘤細胞轉移能力評價方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)腫瘤細胞的采集與培養:采集待評價腫瘤細胞得細胞懸液，培養細胞懸液； (2)腫瘤細胞轉移能力評價:將培養后的細胞懸液于聚丙烯酰胺培養基底上繼續培養，給予抗腫瘤細胞轉移藥物后，觀察細胞形態，定量分析細胞層的面積、細胞與聚丙烯酰胺培養基底連接的強度、細胞間連接的強度并作為腫瘤細胞轉移能力評價標準。
2.根據權利要求1所述的一種腫瘤細胞轉移能力評價方法，其特征在于:步驟(I)中，腫瘤細胞的采集方法為:取待評價腫瘤細胞進行單克隆化，并制成細胞懸液。
3.根據權利要求1所述的一種腫瘤細胞轉移能力評價方法，其特征在于:步驟(I)中，腫瘤細胞的采集方法為:取待評價腫瘤細胞進行單克隆化得待評價腫瘤細胞的單克隆細胞，以ΙΟμΜ Staurosporin對單克隆細胞進行刺激誘導單克隆細胞之間恢復細胞連接,選取刺激前后細胞面積變化最大的單克隆細胞制成細胞懸液。
4.根據權利要求1所述的一種腫瘤細胞轉移能力評價方法，其特征在于:步驟(I)中，所述腫瘤細胞為Colo205細胞，腫瘤細胞的采集方法為:取Colo205細胞進行單克隆化，以10 μ M Staurosporin對單克隆細胞進行刺激誘導恢復細胞連接,選取刺激前后細胞面積變化最大的克隆為實驗對象，并制備細胞懸液。
5.根據權利要求1所述的一種腫瘤細胞轉移能力評價方法，其特征在于:步驟(I)中，腫瘤細胞的培養方法為:離心細胞懸液，沉淀加入DMEM10%血清培養基于培養箱中培養，培養溫度為370C，培養時間為24-48h，pH為7.0-7.2，CO2濃度為5%。
6.根據權利要求1所述的一種腫瘤細胞轉移能力評價方法，其特征在于:步驟(2)中，細胞形態和細胞層面積的測定方法為:通過細胞膜免疫熒光染色、生物顯微鏡成像對細胞形態、細胞層面積進行測定。
7.根據權利要求1所述的一種腫瘤細胞轉移能力評價方法，其特征在于:步驟(2)中，細胞與聚丙烯酰胺培養基底連接的強度的測定方法為:對單位細胞的基底部連接的蛋白標識物分子Vinculin的信號數量進行定量測定。
8.根據權利要求1所述的一種腫瘤細胞轉移能力評價方法，其特征在于:步驟(2)中，細胞間連接的強度:通過對細胞間連接分子E-cadherin進行熒光免疫染色，繼而進行定量分析。
9.權利要求1所述的腫瘤細胞轉移能力評價方法在抗腫瘤轉移藥物篩選中的應用，其特征在于:以腫瘤細胞轉移能力評價的結果作為抗腫瘤轉移藥物篩選的依據進行抗腫瘤轉移藥物篩選。
全文摘要
本發明提供了一種腫瘤細胞轉移能力評價方法，包括以下步驟腫瘤細胞的采集與培養采集待評價腫瘤細胞得細胞懸液，培養細胞懸液；腫瘤細胞轉移能力評價給予抗腫瘤細胞轉移藥物后，檢測細胞形態、細胞層面積、細胞與聚丙烯酰胺培養基底連接的強度、細胞間連接的強度，并作為腫瘤細胞轉移能力評價標準。本發明提供的腫瘤細胞轉移能力評價方法具有成本低廉、操作簡便、結果易判、快速準確的特點。本發明利用上述方法，以分子生物學以及細胞生物學手段為基礎，篩選出轉移性較強癌細胞，并建立體外癌細胞轉移模型，能夠高效篩選出對腫瘤細胞轉移具有潛在抑制作用的藥物，為高通量藥物篩選提供簡單易行的方法，縮短新藥的開發周期。
文檔編號C12Q1/02GK103184263SQ20131013384
公開日2013年7月3日 申請日期2013年4月17日 優先權日2013年4月17日
發明者孟文翔, 滕文臣 申請人:孟文翔