專利名稱：一種瓊脂糖酶的固定化方法
技術領域：
本發明所屬酶工程研究開發技術領域。本發明涉及殼聚糖微球固定化瓊脂糖酶的方法研究,適合工業化生產。
背景技術：
瓊膠是一種重要的海藻多糖，主要由瓊膠糖和硫瓊膠組成。瓊膠酶降解瓊膠糖，根據其作用方式不同，可以把瓊膠酶分為兩類:α -瓊膠酶和β -瓊膠酶。α -瓊膠酶裂解瓊月父糖的α _1，3_糖苷鍵,生成以β-D-半乳糖為非還原性末端和以3,6_內醚-a-L-半乳糖為還原性末端的瓊寡糖列；β -瓊膠酶裂解瓊膠糖的β -1，4-糖苷鍵，生成以β -D-半乳糖為還原性末端和以3，6-內醚-a -L-半乳糖為非還原性末端的新瓊寡糖系列。瓊膠酶降解過程具有得率高、污染小和產物的安全性高等優點，是降解瓊膠糖最有潛力的方法。瓊膠酶降解瓊膠糖生產瓊寡糖產品已廣泛應用于食品業，化妝品業和醫藥工業，例如作為天然的防腐劑、淀粉老化抑制劑、功能性食品基料、抗氧化劑等。同時瓊膠酶在海藻的單細胞分離、酶解破壁制備原生質體等過程具有重要的使用價值，是一種海藻遺傳工程的工具酶；在分子生物學方面，利用瓊膠酶降解瓊膠糖從瓊膠糖凝膠中回收DNA和RNA，已經被證明是最好的方法之一；瓊膠酶也用于海藻多糖的結構研究，用瓊膠酶水解某些海藻的多糖，測定其水解產物的結構，進而推測多糖的結構，是行之有效的方法。但目前該酶的應用研究主要是對游離酶，但游離酶穩定性差，保質期短，重復利用率低，往往使應用成本增高而限制了其應用。所以在酶的應用研究中，固定化酶的研究是生物技術領域中新興的一門技術。酶的固定化是指用載體材料將酶限制于一定空間內進行催化反應，固定化酶可回收及反復連續利用的一類技術。固定化 酶保留了游離酶高效專一、溫和的催化性質，同時又克服了游離酶的缺點，具有高穩定性、易分離純化、回收使用、操作簡便等優點。然而，廣泛投入工業化應用的固定化酶卻不多。因此，進一步開發更經濟適用的固定化方法，使更多的酶取得工業上的廣泛應用，仍是科技工作者追求的目標。酶的固定化方法常用的是:吸附法、交聯法、共價結合和法包埋法。在此基礎上還出現了上述方法的結合法等酶固定化研究中，良好的載體是固定化酶成功的關鍵。所以在酶固定化領域，作為固定化載體的篩選和制備就成為了主要研究方向。甲殼素是由乙酰胺基葡萄糖以β_1，4鏈連接而成的天然線性高聚物，是自然界中僅次于纖維素的第二可再生資源。殼聚糖是甲殼素經脫乙酰化反應得到的產物，分子結構中含有豐富的游離氨基。選擇殼聚糖作為固定化載體是基于它來源豐富，具親水性，生物相容性以及抗微生物分解特性等。殼聚糖氨基與戊二醛基形成schifT堿，在膠囊表面形成一層致密的保護膜，可增加微膠囊球的強度，這就是吸附-交聯法固定化酶。由于目前瓊脂糖酶的固定化國內外還沒人研究，所以利用廉價的殼聚糖作為固定化載體固定瓊脂糖酶具有較大的理論和實踐意義。而本方法研究的目的是開發殼聚糖的應用領域，并可以增強瓊脂糖酶在工業、醫學、食品、環境保護等領域的應用。
發明內容
1.本發明涉及用殼聚糖固定化瓊脂糖酶的方法，其特征在殼聚糖固定化瓊脂糖酶的方法，包括以下過程:步驟(一):用1.5-2% (V/V)乙酸配制1: 20(W/V)的殼聚糖溶液，充分溶解；步驟(二):將步驟(一)的殼聚糖溶液逐滴滴入lmol/L氫氧化鈉溶液中，殼聚糖將凝聚成白色顆粒，過濾收集殼聚糖珠；步驟(三):將步驟(二)的殼聚糖珠用蒸餾水洗滌至中性；步驟(四):將步驟(三)的殼聚糖珠用0.2mol/L、pH7.6的磷酸緩沖溶液浸泡過夜；步驟(五):取步驟(四)中的殼聚糖珠載體2.5_5g，加入2.5%的戊二醛20-25ml，水浴振蕩0.5小時，室溫交聯5_6小時，磷酸緩沖液沖洗殼聚糖珠交聯載體；步驟(六):在步驟(五)中的殼聚糖珠交聯載體中加入10_15mL稀釋的瓊脂糖酶液，攪拌均勻，4°C固定2-3小時，用磷酸緩沖液沖洗；步驟(七):將步驟(六)中的固定化酶抽真空得到固定化瓊脂糖酶。2.根據本發明所述的制備固定化瓊脂糖酶的載體是殼聚糖微球。
圖1是pH值對酶活性的影響圖，圖2是溫度對酶活性的影響圖，圖3是游離酶和固定化酶的熱穩定性圖。
具體實施例方式本發明所述的涉及殼聚糖微球固定化瓊脂糖酶方法包括以下實施例，下面的實施例可進一步說明本發明，但不以任何方式限制本發明。實施例1:pH值對酶活性的影響平行取制備好的殼聚糖固定化酶0.5g和相應的游離酶，在不同pH(4.0-9.0)條件下分別加底物與游離酶及固定化酶作用，分別測定其酶活力，結果如圖1所示。圖1表明,游離酶的最適pH值為8.0，隨著pH值的升高酶活性下降；對固定化酶而言，在本實驗條件下，當PH值達到8.5的時候酶活性達到最大值，固定化使酶的最適pH往堿性方面升高0.5個單位，符合酶和載體結合后的基本規律。實施例2:溫度對酶活性的影響平行取制備好的殼聚糖固定化酶0.5g和相應的游離酶，在不同溫度(30°C -80°C )條件下分別加底物與游離酶及固定化酶作用，分別測定其酶活力，結果如圖2所示。由圖2可知，游離瓊脂酶在40°C下表現出最高活力，隨溫度升高，活力急劇下降，酶開始失活，但對固定化酶而言，在40-60°C范圍內均有較大酶活，50°C時酶活力達最大值，固定化酶耐熱性顯著提高。實施例3:游離酶和固定化酶的熱穩定性平行取制備好的殼聚糖固定化酶0.5g和相應的游離酶，在不同溫度(20°C -80°C )條件下保溫0.5h，然后加底物與其作用，分別測定其酶活力，結果如圖3所示。由圖3可知，酶液在40°C以下短暫保溫對酶活影響較小，溫度進一步提升至50°C時對游離酶活性影響增加，損失約為27.36%，而對固定化酶活力影響仍較小。在60°C時，游離酶的活性很低，而固定化酶活約為50%，70°C時酶基本都已完全沒有活性，說明固定化酶的熱穩定性高于游離酶。實施例4:固定化酶的操作穩定性取固定化酶0.5g，加0.5%瓊脂糖底物1.5ml與之反應，連續操作6次，分別測定6次反應后的酶活力大小,結果如表I。表I固定化瓊脂酶的操作穩定性
權利要求
1.本發明涉及用殼聚糖固定化瓊脂糖酶的方法，其特征在殼聚糖固定化瓊脂糖酶的方法，包括以下過程: 步驟(一):用1.5-2% (V/V)乙酸配制1: 20(W/V)的殼聚糖溶液，充分溶解； 步驟(二):將步驟(一)的殼聚糖溶液逐滴滴入lmol/L氫氧化鈉溶液中，殼聚糖將凝聚成白色顆粒，過濾收集殼聚糖珠； 步驟(三):將步驟(二)的殼聚糖珠用蒸餾水洗滌至中性； 步驟(四):將步驟(三)的殼聚糖珠用0.2mol/L、pH7.6的磷酸緩沖溶液浸泡過夜；步驟(五):取步驟(四)中的殼聚糖珠載體2.5-5g，加入2.5%的戊二醛20-251111，水浴振蕩0.5小時,室溫交聯5-6小時,磷酸緩沖液沖洗殼聚糖珠交聯載體； 步驟(六):在步驟(五)中的殼聚糖珠交聯載體中加入10-15mL稀釋的瓊脂糖酶液，攪拌均勻，4°C固定2-3小時，用磷酸緩沖液沖洗； 步驟(七):將步驟(六)中的固定化酶抽真空得到固定化瓊脂糖酶。
2.根據本發 明所述的制備固定化瓊脂糖酶的載體是殼聚糖微球。
全文摘要
本發明所屬酶工程研究開發技術領域。本發明涉及一種瓊脂糖酶的固定化方法研究。用1.5-2％(V/V)乙酸配制1∶20(W/V)的殼聚糖溶液，充分溶解；溶解后的殼聚糖溶液逐滴滴入1mol/L氫氧化鈉溶液中，過濾收集殼聚糖珠；用蒸餾水洗滌至中性，再用0.2mol/L、pH7.6的磷酸緩沖溶液浸泡過夜；取浸泡的殼聚糖珠載體2.5-5g，加入2.5％的戊二醛20-25ml，水浴振蕩0.5小時，室溫交聯5-6小時，磷酸緩沖液沖洗殼聚糖珠交聯載體；在殼聚糖珠交聯載體中加入10-15mL稀釋的瓊脂糖酶液，攪拌均勻，4℃固定2-3小時，用磷酸緩沖液沖洗；抽真空得到固定化瓊脂糖酶。本發明制備固定化酶的方法，載體廉價易得，工藝簡單，條件溫和，對酶活性損失小，酶活回收率可達到77.6％。
文檔編號C12N11/10GK103232988SQ201310128450
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月4日 優先權日2013年4月4日
發明者朱啟忠, 張瑞, 張揚 申請人:山東大學(威海)