專利名稱：一種快速鑒別文山三七與易混品屏邊三七的pcr-rflp方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及物種分子鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及限制性內(nèi)切酶(MluC I和Nla IV)對(duì)云南省道地藥材文山三七及其易混品屏邊三七的分子鑒別技術(shù)。
背景技術(shù)：
文山三七是五加科人參植物三七(Panax notoginseng(Burk)F.H.Chen)的干燥根，又名南國神草、田七，是我國重要的名貴中藥材之一，明代著名的藥學(xué)家李時(shí)珍將三七稱為“金不換”?！侗静菥V目拾遺》中記載:“人參補(bǔ)氣第一，三七補(bǔ)血第一，味同而功亦等，故稱人參三七，為中藥中之最珍貴者”。三七和人參(Panax ginseng C.A.Mey.)同為人參屬植物，但三七活性物質(zhì)種類比人參多，且含量高，因此被現(xiàn)代中藥藥物學(xué)家稱為“參中之王”?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)踐證明，三七對(duì)心腦血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)疾病有不同程度的治療功效，具有抗衰老、抗炎、抗腫瘤方面的藥理作用。以三七為原料的藥品有云南白藥、片仔癀、三七冠心寧、血塞通、七葉神安片、地奧心血康、復(fù)方丹參滴丸、東北紅藥等。除作為藥品外，三七也可用于生產(chǎn)保健品和化妝品。文山三七早已成為地理標(biāo)志(證明商標(biāo))而中外著名，文山三七指云南省文山壯族苗族自治州所產(chǎn)的三七。三七栽培地道性要求嚴(yán)格，在文山壯族苗族自治州以外栽培，其品質(zhì)和產(chǎn)量大為遜色。因此，文山三七除倍受我國國內(nèi)制藥行業(yè)喜愛外，還出口日本、新加坡、韓國、美國、英國、澳大利亞等國家，為我國出口創(chuàng)匯產(chǎn)生了較大的經(jīng)濟(jì)效益。在文山三七分布地區(qū)也有一些其他人參屬植物，如屏邊三七(P.stipuleanatusTsai et Feng)、竹節(jié)參(P.japonicus C.A.Meyer)等,其中屏邊三七是現(xiàn)存野生資源最多的人參屬植物，在云南省及其周邊省份均有分布，市場上常將屏邊三七作為文山三七銷售。屏邊三七的皂苷種類和含量均少于文山三七，因此，屏邊三七代替或者混入文山三七中會(huì)影響藥效。近年文山三七價(jià)格暴漲，出現(xiàn)了一些不法商人利用三七的同屬和其他屬植物的塊根冒充文山三七的現(xiàn)象，特別是用屏邊三七冒充文山三七(廣州市藥品檢驗(yàn)所.中藥材鑒別原色圖譜.廣州:廣東科技出版社，1988，10;揚(yáng)兆起等.中藥鑒別手冊(第三冊).北京:科學(xué)技術(shù)出版社，1994，I)。人參屬植物形態(tài)特征極為相似，僅根據(jù)干燥塊根形狀很難區(qū)別文山三七和屏邊三七。因此，急需建立快速、可靠的分子鑒別方法。近年來，隨著DNA分子技術(shù)的發(fā)展，基于PCR的DNA指紋圖譜和測序技術(shù)已經(jīng)成功地引用于中藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)研究領(lǐng)域(曹暉等.DNA分子標(biāo)記技術(shù):一種新的中藥分析方法，藥物分析雜志，1999，19(5):355-360)。植物核rDNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(int ernal transcribed spacer, ITS)包含被5.8SrDNA所分隔的ITSl和ITS2兩個(gè)片段，ITSl的長度為187 298bp，ITS2為187 252bp，PCR擴(kuò)增及測序簡單易行。ITS序列變異較快，可以提供較豐富的變異位點(diǎn)和信息位點(diǎn)，已經(jīng)應(yīng)用于許多被子植物科內(nèi)、近緣屬間及種間關(guān)系的研究。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)文山三七原料真?zhèn)胃泄勹b別困難、易混入屏邊三七等問題，提供一種可靠的文山三七與易混品屏邊三七的分子鑒別方法。本發(fā)明所提供的一種快速鑒別文山三七與易混品屏邊三七的PCR-RFLP方法，由待鑒別樣本的總DNA提取、PCR擴(kuò)增、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化、酶切反應(yīng)、瓊脂糖凝膠電泳、分析鑒別步驟組成，所述的PCR擴(kuò)增采用的引物是ITS引物，所述的ITS引物由正向引物和反向引物組成，所述的正向引物的堿基序列如SEQ ID NO:1所示，反向引物的堿基序列如SEQ IDNO:2所示；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，將純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分成樣品I和樣品2兩等份并均進(jìn)行酶切反應(yīng)，樣品I中加入限制性內(nèi)切酶MluC I，樣品2中加入限制性內(nèi)切酶Nla IV，兩個(gè)酶切反應(yīng)產(chǎn)物分別用2%瓊脂糖凝膠電泳得MluC I酶切圖譜和Nla IV酶切圖譜，對(duì)酶切圖譜進(jìn)行分析，在MluC I酶切圖譜中，如果樣品I有三條帶，大小分別約為450bp、200bp和lOObp，且在Nla IV酶切圖譜中，如果樣品2被切為兩條帶，大小分別約為500bp和lOObp，則待鑒別樣本為文山三七；在組冗I酶切圖譜中，如果樣品I只有約450bp的一條帶，且在Nla IV酶切圖譜中，如果樣品2不能被Nla IV酶切開，其電泳條帶與用堿基序列如SEQ IDNO:1所示的正向引物和堿基序列如SEQ ID NO:2所示的反向引物擴(kuò)增的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物帶大小一樣，約為750bp，則待鑒別樣本為屏邊三七。本發(fā)明還提供MluC I酶和Nla IV酶在用PCR-RFLP方法鑒別文山三七與屏邊三七中的應(yīng)用。本發(fā)明的有意效果是:本發(fā)明通過用ITS引物對(duì)文山三七和屏邊三七樣品DNA的PCR擴(kuò)增，經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)首次篩選出MluC I酶、Nla IV酶酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，MluC I酶切圖譜中，文山三七有三條帶，大小分別約為450bp、200bp和lOObp，而屏邊三七只有約450bp的一條帶，因此能夠鑒別樣品是否為文山三七；Nla IV酶切圖譜中，屏邊三七不能被Nla IV酶切開，其電泳條帶與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小一樣，在 750bp左右；而文山三七被切為兩條帶，大小分別為500bp和IOObp左右，因此能夠鑒別樣品中是否混有屏邊三七。本發(fā)明首次成功建立了文山三七、屏邊三七的限制性內(nèi)切酶(Nla IV和MluC I)酶切圖譜，可以準(zhǔn)確鑒別文山三七和屏邊三七。本發(fā)明克服了感官評(píng)審難以鑒別文山三七原料的真?zhèn)螁栴}。采用本發(fā)明方法鑒定需要6-8h時(shí)間，達(dá)到了快速、準(zhǔn)確鑒定的目的。
圖1是PCR-RFLP方法鑒別文山三七與屏邊三七的MluC I酶切圖譜。圖中，M:DL2000 DNA ladder ;1_3:文山三七葉片;4_5:文山三七根;6_10:屏邊三七葉片;11_17:屏邊三七根。圖2是PCR-RFLP方法鑒別文山三七與屏邊三七的Nla IV酶切圖譜。圖中，M: DL2000DNA ladder ；ck:引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；1~2:屏邊三七葉片；3-4:屏邊三七根；5-9:文山三七葉片；10-13:文山三七根。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明主要儀器:PCR儀(CFX Manager)、日立臺(tái)式離心機(jī)、核酸蛋白分析儀(GeneQuant pro)、水浴鍋、冰箱、電泳儀(DYY-6C)、凝膠成像分析系統(tǒng)(ImageQuant300)。以下操作無特別說明為常規(guī)方法。1.樣本DNA的提取文山三七葉片和根采自云南省文山壯族苗族自治州苗鄉(xiāng)三七科技示范園種植三年生植株；屏邊三七葉片和根采自云南省文山壯族苗族自治州馬關(guān)縣古林箐鄉(xiāng)文山三七科技示范園，分別取文山三七及屏邊三七的葉片和根，分別提取DNA。DNA提取按照CTAB法(鄒喻蘋等編著。系統(tǒng)與進(jìn)化植物學(xué)中的分子標(biāo)記，提取總DNA見第16頁)。文山三七葉片和根以及屏邊三七葉片和根均可通過商業(yè)渠道購買到。2.1TS引物的設(shè)計(jì)ITS引物自行設(shè)計(jì)，合成于昆明碩陽科技有限公司。所述的ITS引物由正向引物和反向引物組成，所述的正向引物的堿基序列如SEQ ID NO:1所示，反向引物的堿基序列如SEQ ID NO:2 所示。4.PCR 擴(kuò)增60 μ L PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系:10 XPCR Buffer (含 Mg2+):6 μ L ；2.5mM dNTPs mixture(2.5mM each):4.8μ L ;引物(SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO: 2):各 2 μ L( IOD 引物溶入 400 μ LddH20 中)；10ng/y L基因組 DNA:3μ L ;ddH20:17.8μ L ;EasyTaq DNA polymerase3U0 PCR試劑購買于北京全式金生物技術(shù)有限公司。PCR 擴(kuò)增用 2720Themal Cycler PCR 儀(Invitrogen, Applied Biosystems)進(jìn)行。PCR擴(kuò)增程序如下:94°C預(yù)變性5min，94°C變性lmin，51°C退火2min，72°C延伸2min，共30個(gè)循環(huán)，72°C延伸10min，4°C保存。5.PCR產(chǎn)物純化將所得的PCR產(chǎn)物利用北京百泰克生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的多功能DNA純化回收試劑盒進(jìn)行純化，操作步驟為:(I)每100 μ IPCR擴(kuò)增體系加入500 μ I溶液/結(jié)合液DB，充分混勻。(PCR體系不足100 μ I者，用雙蒸水調(diào)至100 μ I)。(2)將上步所得混合物溶液加入吸附柱AC中，室溫放置2 3min，12000rpm離心2min，倒掉收集管中的廢液。(3)加入700 μ I漂洗液WB (已加入無水乙醇)，12000rpm離心2min,棄掉廢液。(4)加入500 μ I漂洗液WB12000rpm離心2min,棄掉廢液。(5)吸附柱AC放回空收集管中12000rpm離心5min，盡量除去漂洗液。(6)取出吸附柱AC，放于一個(gè)干凈離心管中，在吸附膜中間部位加入60μ I洗脫液EB (EB提前放于65-70°C水浴中加熱)，室溫放置2min，12000rpm離心2min。注:洗脫液EB分兩次加入，每次30 μ I。6.限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)上述樣本純化后的PCR產(chǎn)物均分成兩等份，其中一等份進(jìn)行MluC I酶切反應(yīng)，另一等份進(jìn)行Nla IV酶切反應(yīng)。限制性內(nèi)切酶MluC I和Nla IV購于美國New EnglandBiolabs公司，酶切反應(yīng)按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。MluC I酶切反應(yīng):15 μ I (包括10ΧΝΕΒ緩沖液1.5 μ 1，內(nèi)切酶I μ 1，PCR純化產(chǎn)物 12.5μ 1)，37°C溫浴 3h。
Nla IV酶切反應(yīng):15 μ I (包括 10 XNEB 緩沖液 1.5 μ I，100 XBSA0.15 μ I，內(nèi)切酶
Iμ 1，PCR 純化產(chǎn)物 12.35μ 1)，37°C溫浴 3h。7.瓊脂糖凝膠電泳配2%瓊脂糖凝膠，I XTAE緩沖液，電壓120V，電流200mh，電泳Ih,將電泳圖片放于凝膠成像分析系統(tǒng)拍照。8.數(shù)據(jù)處理和分析將電泳圖片進(jìn)行處理后，對(duì)比樣本的酶切情況，通過酶切位點(diǎn)大小和位點(diǎn)數(shù)即可鑒定出樣本。9.結(jié)果分析從圖1MluC I酶切圖譜可以看出，文山三七(泳道1-5)有三條帶，大小分別約為450bp、200bp和lOObp，而屏邊三七(泳道6-17)只有約450bp的一條帶。文山三七的MluC I酶酶切條帶與屏邊三七的MluC I酶酶切條帶明顯不同，因此能夠鑒別樣品是否為文山三七。從圖2NlaIV酶切圖譜可以看出，屏邊三七(泳道1-4)與對(duì)照(ck，引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)相同，有750bp左右的一條帶，說明屏邊三七PCR產(chǎn)物不能被Nla IV酶切開；文山三七(泳道5-13)有兩條帶，第一條500bp左右，第二條IOObp左右，表明:屏邊三七和文山三七的Nla IV酶酶切圖譜完全不同，因此可以鑒別樣品中是否混入了屏邊三七。MluC I酶切圖譜和Nla IV酶切`圖譜清楚表明:在MluC I酶切圖譜中，如果樣品有三條帶，大小分別約為450bp、200bp和IOObp，且在Nla IV酶切圖譜中，如果相同樣品被切為兩條帶，大小分別約為500bp和lOObp，則待鑒別樣本為文山三七；在組冗I酶切圖譜中，如果樣品只有約450bp的一條帶，且在Nla IV酶切圖譜中，如果相同樣品不能被Nla IV酶切開，其電泳條帶與引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(ck)帶大小一樣，約為750bp，則待鑒別樣本為屏邊三七。
權(quán)利要求
1.一種快速鑒別文山三七與易混品屏邊三七的PCR-RFLP方法，由待鑒別樣本的總DNA提取、PCR擴(kuò)增、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化、酶切反應(yīng)、瓊脂糖凝膠電泳、分析鑒別步驟組成，其特征在于:所述的PCR擴(kuò)增采用的引物是ITS引物，所述的ITS引物由正向引物和反向引物組成，所述的正向引物的堿基序列如SEQ ID NO:1所示，反向引物的堿基序列如SEQ ID NO:2所示；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，將純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分成樣品I和樣品2兩等份并均進(jìn)行酶切反應(yīng),樣品I中加入限制性內(nèi)切酶MluC I，樣品2中加入限制性內(nèi)切酶Nla IV，兩個(gè)酶切反應(yīng)產(chǎn)物分別用2%瓊脂糖凝膠電泳得MluC I酶切圖譜和Nla IV酶切圖譜，對(duì)酶切圖譜進(jìn)行分析，在MluC I酶切圖譜中，如果樣品I有三條帶，大小分別約為450bp、200bp和IOObp，且在Nla IV酶切圖譜中，如果樣品2被切為兩條帶，大小分別約為500bp和IOObp，則待鑒別樣本為文山三七；在組冗I酶切圖譜中，如果樣品I只有約450bp的一條帶，且在Nla IV酶切圖譜中，如果樣品2不能被Nla IV酶切開，其電泳條帶與用SEQ ID ΝΟ:1所示的正向引物和SEQ ID NO:2所示的反向引物擴(kuò)增的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物帶大小一樣，約為750bp，則待鑒別樣本為屏邊三七。
2.MluC I酶和N la IV酶在用PCR-RFLP方法鑒別文山三七與屏邊三七中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速鑒別文山三七與易混品屏邊三七的PCR-RFLP方法，該方法的PCR擴(kuò)增采用的引物是由ITS正向引物和反向引物組成，所述的正向引物的堿基序列如SEQ ID NO1所示，反向引物的堿基序列如SEQ ID NO2所示；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，分別用限制性內(nèi)切酶MluC Ⅰ、限制性內(nèi)切酶Nla Ⅳ酶切，在MluC Ⅰ酶切圖譜和NlaⅣ酶切圖譜中，文山三七與屏邊三七酶切圖譜完全不同，可鑒別樣品是否為文山三七、是否混入了屏邊三七。本發(fā)明首次成功建立了文山三七、屏邊三七的限制性內(nèi)切酶酶切圖譜，可以準(zhǔn)確鑒別文山三七和屏邊三七且快速，克服了感官評(píng)審難以鑒別文山三七原料的真?zhèn)螁栴}。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103173563SQ201310128370
公開日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2013年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月15日
發(fā)明者張廣輝, 楊生超, 楊云, 陳軍文, 李翠婷, 陳中堅(jiān), 朱書生, 何霞紅 申請(qǐng)人:云南農(nóng)業(yè)大學(xué)