專利名稱：節(jié)桿菌谷氨酰胺合成酶基因、其編碼蛋白及其克隆方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細菌的谷氨酰胺合成酶基因、其編碼蛋白及其克隆方法，特別是一種節(jié)桿菌谷氨酰胺合成酶基因、其編碼蛋白及其克隆方法。
背景技術(shù)：
氮元素是生物體從環(huán)境中吸收量最多的礦物質(zhì)元素，用于合成生物體所需的氨基酸和核苷酸及多種不同的含氮化合物。氮利用在農(nóng)作物生產(chǎn)中占重要地位。目前我國已成為世界氮肥的第一生產(chǎn)和消費國，且使用量仍呈每年遞增態(tài)勢，氮肥利用率低及過量施用氮肥造成水環(huán)境污染的問題是世界性難題。正因為如此，需要降低氮肥的使用量，并尋找氮利用率更高的植物基因型。更高的氮利用率可以保證農(nóng)作物在產(chǎn)量不下降的前提下，減少氮肥的使用量，從而減少因施肥造成地表水富營養(yǎng)化等問題的發(fā)生。對于生物體的生長和發(fā)育而言，氮素的同化是個十分重要的生理過程，無機氮必須同化為谷氨酰胺形式的有機氮才能被生物體所吸收和利用。谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)是氮同化路徑上的關(guān)鍵酶,在ATP功能的情況下,催化NH4+同化成谷氨酰胺，而谷氨酰胺又在谷氨酸合酶的催化下，將其酰胺轉(zhuǎn)移到α -酮戊二酸上，從而生成兩分子的谷氨酸。谷氨酰胺在生物體內(nèi)含氮有機物的生物合成中作為氮供體，而外界的無機氮元素也通過這個途徑進入生物體內(nèi)的整個氮素循環(huán)。因此谷氨酰胺合成酶在生物體氮同化過程中起到了十分重要的作用。細菌的谷氨酰胺合成酶涵蓋了目前所發(fā)現(xiàn)的三大類谷氨酰胺合成酶GS1、GSII和GSIII，相比高等植物的谷氨酰胺合成酶基因而言，有種類多和容易克隆的優(yōu)越性。節(jié)桿MiArthrobacter sp.)是土壤中常見的一種革蘭氏陽性細菌類群，其谷氨酰胺合成酶基因的克隆及功能鑒定對于改善逆境下農(nóng)作物的生理性狀有重要的應用前景。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供了一種節(jié)桿菌谷氨酰胺合成酶基因。本發(fā)明的目的之二在于提供了該基因的編碼蛋白。本發(fā)明的目的之三在于提供該基因的克隆方法。為達到以上目的，本發(fā)明通過下述方案實現(xiàn):
一種節(jié)桿菌谷氨酰胺合成酶基因，其特征在于該基因的序列為SEQ ID N0.1所示的堿基序列。一種上述的基因編碼的蛋白，其特征在于該蛋白的序列為SEQ ID N0.2所示的氨
基酸序列。一種重組表達載體，該重組載體含有上述的基因。一種宿主細胞，該宿主細胞含有上述的重組載體。
一種克隆上述的節(jié)桿菌谷氨酰胺合成酶基因的方法，其特征在于該方法的具體步驟為:參考NCBI數(shù)據(jù)庫中的節(jié)桿菌屬細菌的谷氨酰胺合成酶基因序列，設計兼并引物，再從土壤微生物宏基因組DNA中PCR擴增出了一個谷氨酰胺合成酶基因；所述的兼并引物為:Ar2F: 5’ -ATGTTYAAGACTGCGGACGA-3’ 和 Ar2R: 5’ -CTAGACGCCGTAGTAGAGCT-3 ’。上述的方法，其特征在于所述的PCR擴增的條件為:94°C 5分鐘；94°C 50秒，54°C 50秒，72 °C I分30秒，25個循環(huán)；72°C 8分鐘。本發(fā)明的互補實驗驗證了谷氨酰胺合成酶基因JriAr0J 所編碼的谷氨酰胺合成酶能夠在大腸桿菌中發(fā)揮谷氨酰胺合成酶的功能，能恢復大腸桿菌突變體合成谷氨酰胺的能力，同時也預示了它在其他生物氮高效利用方面的應用價值。
圖1和2為本發(fā)明的谷氨酰胺合成酶基因編碼的蛋白亞細胞定位預測圖，表明該編碼蛋白定位在細胞質(zhì)的可能性很大；
圖3為本發(fā)明的谷氨酰胺合成酶基因編碼的蛋白的進化分析圖，表明該編碼蛋白屬于谷氨酰胺合成酶家族；
圖4為本發(fā)明的谷氨酰胺合成酶基因在大腸桿菌突變體ET6017 (Genotype:F-, [araD139]B/r, Δ (argF-lac)169, flhD5301, Δ (fruK-yeiR)725(fruA25), relAl, rpsLl50 (strR), Δ (glnG-glnA) 229，ha-10, deoCl)中的功能互補分析圖。培養(yǎng)基中添加谷氨酰胺，轉(zhuǎn)入和未轉(zhuǎn)入心的菌株均可以正常生長； 圖5為本發(fā)明的谷氨酰胺合成酶基因在大腸桿菌突變體ET6017 (Genotype:F-, [araD139]B/r, Δ (argF-lac)169, flhD5301, Δ (fruK-yeiR)725(fruA25), relAl, rpsLl
50(strR), Δ (glnG-glnA) 229，ha-10, deoCl)中的功能互補分析圖。培養(yǎng)基中未添加谷氨酰胺，只有轉(zhuǎn)入XriAroJ 的菌株可以正常生長。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克隆(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.)》，或按照制造廠商所建議的條件。實施例一 -.Arthr02基因全長編碼區(qū)的克隆與分析:
通過參考NCBI數(shù)據(jù)庫中的節(jié)桿菌(Arthrobacter spp.)屬細菌的谷氨酰胺合成酶基因序列，設計了兼并引物:Ar2F: 5，-ATGTTYAAGACTGCGGACGA-3’和Ar2R:5’ -CTAGACGCCGTAGTAGAGCT-3’，從土壤微生物宏基因組DNA中PCR擴增出了一個谷氨酰胺合成酶基因，命名為Arthro2。將該基因插入克隆載體pMD 18-T，挑選相應的陽性克隆，對該基因進行了全長DNA測序，獲得了含有該基因完整ORF的DNA序列。測序結(jié)果表明的ORF全長1425bp。DNAstar軟件的分析結(jié)果顯示:該基因編碼一個含474個氨基酸的蛋白，蛋白分子量大小約為53kDa，等電點為4.7。利用Cell-PLoc網(wǎng)站的Gpos-PLoc 2.0以及Softberry網(wǎng)站的ProtComp Version 9.0軟件對AriAroJ 基因編碼的蛋白進行亞細胞定位預測，預測數(shù)據(jù)顯示該蛋白定位在細胞質(zhì)的可能性很大，參見圖1和2，這與其它物種中的谷氨酰胺合成酶的定位信息相符。進化分析表明，JriAr0J 基因編碼的蛋白屬于谷氨酰胺合成酶家族，參見圖3。
實施例二在大腸桿菌突變體中的功能分析
通過DNA測序分析，挑選JriAroJ 基因ORF轉(zhuǎn)錄方向與載體pMD18_T上乳糖啟動子轉(zhuǎn)錄方向一致的克隆,抽提該克隆的質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)入大腸桿菌突變體ET6017 (Genotype:F-, [araD139]B/r, Δ (argF-lac)169,flhD5301, Δ (fruK-yeiR)725 (fruA25),relAl,rpsL150 (strR)，Δ (glnG-glnA) 229，ha_10, deoCl)中。請參見文獻:Merida, A., Flores E.,Florencio F.J., Regulation of Anabaena sp.strain PCC7120 glutamine synthetaseactivity in a Synechocystis sp.strain PCC6803 derivative strain bearing theAnabaena glnA gene and a mutated host glnA gene.J Bacteriol, 1992, 174(2):650-654.。該突變體由于缺失編碼谷氨酰胺合成酶的基因，所以在不添加谷氨酰胺的培養(yǎng)基中無法正常生長。該菌株購買于E.coli Genetic Stock Center, Yale University。由圖4和圖5說明Arthro2能夠互補大腸桿菌突變體ET6017的谷氨酰胺合成酶缺失表型。Arthro2的表達，使得大腸桿菌突變體ET6017在不添加谷氨酰胺的培養(yǎng)條件下生長。該互補實驗在大腸桿菌中驗證了基因JriAr0J 所編碼的谷氨酰胺合成酶能夠在大腸桿菌中發(fā)揮谷氨酰胺合成酶的功能，證明該基因能夠恢復大腸桿菌突變體合成谷氨酰胺的能力，同時也預示了它在其他生物氮高效利用方面的應用價值。盡管本發(fā)明描述了具體的例子，但是有一點對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是明顯的，即在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的前提下可對本發(fā)明作各種變化和改動。因此，所附權(quán)利要求覆蓋了所有這些在本發(fā)明范圍內(nèi)的變動。`
權(quán)利要求
1.一種節(jié)桿菌谷氨酰胺合成酶基因，其特征在于該基因的序列為SEQ ID N0.1所示的堿基序列。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因編碼的蛋白，其特征在于該蛋白的序列為SEQ IDN0.2所示的氨基酸序列。
3.—種重組表達載體，該重組載體含有根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因。
4.一種宿主細胞,該宿主細胞含有根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組載體。
5.一種克隆根據(jù)權(quán)利要求1所述的節(jié)桿菌谷氨酰胺合成酶基因的方法，其特征在于該方法的具體步驟為:參考NCBI數(shù)據(jù)庫中的節(jié)桿菌屬細菌的谷氨酰胺合成酶基因序列，設計兼并引物，再從土壤微生物宏基因組DNA中PCR擴增出了一個谷氨酰胺合成酶基因；所述的兼并引物為:Ar2F: 5’ -ATGTTYAAGACTGCGGACGA-3’和Ar2R:5， -CTAGACGCCGTAGTAGAGCT-3，。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述的PCR擴增的條件為:94°C5分鐘；94°C 50 秒，54°C 50 秒，72 °C I 分 30 秒，25 個循環(huán)；72°C 8 分鐘。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種節(jié)桿菌谷氨酰胺合成酶基因、其編碼蛋白及其克隆方法。本發(fā)明的基因來源于節(jié)桿菌屬細菌，為SEQIDNO1所示的堿基序列。該基因具有編碼谷氨酰胺合成酶的功能，能夠顯著提高模式生物大腸桿菌合成谷氨酰胺的能力。這預示了所公開的全長基因及氨基酸序列，在提高生物體的氮利用效率和增加生物體氮元素含量的基因工程方面具有應用價值。
文檔編號C12N15/52GK103205440SQ20131012790
公開日2013年7月17日 申請日期2013年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月15日
發(fā)明者朱晨光, 王偉, 沈春磊, 李朝斌, 俞頔, 唐遠平, 梅冰, 宋任濤 申請人:上海大學