專利名稱：一種新的歐米伽3的合成基因、含有合成基因的大腸菌及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因技術(shù)和微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及微生物制藥領(lǐng)域中的基因工程菌株大腸菌sHJPR)2。
背景技術(shù)：
歐米伽3脂肪酸的學(xué)名叫做Ω - 3脂肪酸，其功用在20世紀(jì)20年代就逐漸被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時(shí)被稱為“維生素F”，近30年內(nèi)的研究表明，歐米伽3是人體正常生長發(fā)育和新陳代謝必需的不飽和脂肪酸，主要含有DHA、EPA和DPA這三種極為重要的生理物質(zhì)。歐米伽3主要具有以下功效:維護(hù)視網(wǎng)膜功能和延緩腦的衰老；促進(jìn)嬰幼兒智力開發(fā)和智商提高，增強(qiáng)記憶力；預(yù)防心腦血管疾??；抗炎、抑制過敏反應(yīng)。EPA最重要的功能是具有抗血栓形成、調(diào)節(jié)血脂、降血壓等作用，從而具有預(yù)防心血管疾歐米伽3病的作用；DHA俗稱腦黃金，最重要的功能是參與腦細(xì)胞的形成和發(fā)育，添加DHA對促進(jìn)出生后腦容量發(fā)育具有重要意義；DPA的功效是DHA的十倍以上，且DPA對幼兒的生長是至關(guān)重要的。加拿大政府最近向25-49歲的國民建議每日應(yīng)服用1.5-3克的歐米伽3 ；2004年美國FDA批準(zhǔn)歐米伽3脂肪酸治療高甘油三脂血癥的成人患者；最近美國衛(wèi)生部已同意每日對歐米伽3的吸取量應(yīng)增加為3克；世界衛(wèi)生組織(WHO)最近建議成年人歐米伽3每天增加3克的吸收量(必須補(bǔ)充)。2010年歐米伽3的全球市場銷售額約38億美元，大部分來自于海洋魚類提取法，以深海魚油的形式出售，其余來自于微生物發(fā)酵法，主要是作為食品添加劑加入嬰幼兒奶粉、牛奶和其它 食品之中。本發(fā)明提供了 3個(gè)歐米伽3的合成基因和一株生產(chǎn)歐米伽3的基因工程菌株大腸桿菌sHJPR)2，該菌株遺傳性狀穩(wěn)定，可以生產(chǎn)EPA和DPA，培養(yǎng)和發(fā)酵條件適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的
提供了 3個(gè)歐米伽3的合成基因和一株生產(chǎn)歐米伽3的基因工程菌株大腸桿菌SHJPF02,該菌株遺傳性狀穩(wěn)定，可以生產(chǎn)EPA和DPA，培養(yǎng)和發(fā)酵條件適合于工業(yè)化生產(chǎn)。技術(shù)方案
歐米伽3的合成基因I，其核苷酸序列為SEQ ID N0.1。歐米伽3的合成基因2，其核苷酸序列為SEQ ID N0.2。歐米伽3的合成基因2，其核苷酸序列為SEQ ID N0.3。該菌株通過將歐米伽3的合成酶基因1-3利用生物工程的方法導(dǎo)入大腸桿菌BL21得到，可以生產(chǎn)EPA和DPA，命名為sHJPR)2，分類名為大腸埃希氏菌，coli,該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)保藏日:2013年3月20日，保藏登記號:CGMCC N0.7338，保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中科院微生物研究所。一株生產(chǎn)歐米伽3的基因工程菌株構(gòu)建的方法，將具有SEQ ID N0.1序列的DNA克隆到質(zhì)粒pETDeut-1中得到質(zhì)粒pHJPR)l ;將具有SEQ ID N0.2序列的DNA克隆到質(zhì)粒pACY⑶eut-1中得到質(zhì)粒pHJPR)2 ;將具有SEQ ID N0.3序列的DNA克隆到質(zhì)粒pCOLADeut-1 中得到質(zhì)粒pHJPR)4 ^fpHJPR)l、pHJPF02和pHJPF04 同時(shí)導(dǎo)入大腸桿菌BL21得到一株基因工程菌株sHJPR)2，該菌株可以生產(chǎn)EPA和DPA。本發(fā)明的有益效果:提供了一株生產(chǎn)歐米伽3的基因工程菌株，該菌株生產(chǎn)EPA的產(chǎn)量穩(wěn)定在1.0 g/L左右，DPA的產(chǎn)量穩(wěn)定在0.3 g/L左右，相比于歐米伽3的原始生產(chǎn)菌株，該菌株生長速度快，歐米伽3的產(chǎn)量高，遺傳性狀穩(wěn)定，適合于在工業(yè)化生產(chǎn)歐米伽3。該菌株命名為sHJPR)2，分類名為大腸埃希氏菌，Escherichia coli,該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)保藏日:2013年3月20日，保藏登記號=CGMCC N0.7338，保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中科院微生物研究所。
圖1是質(zhì)粒pHJPFOl的構(gòu)建示意圖(A)、質(zhì)粒pHJPF02的構(gòu)建示意圖(B)和pHJPR)4的構(gòu)建示意圖(C)。圖2是質(zhì)粒pHJPR)l用限制性內(nèi)切酶Mfcl/ZAol消化的電泳圖(A)、質(zhì)粒pHJPR)2用限制性內(nèi)切酶M/el/ZAol消化的電泳圖(B)和質(zhì)粒pHJPF04用限制性內(nèi)切酶Mfcl/ZAol消化的電泳圖(C)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說明。實(shí)施例中所使用的液體LB培養(yǎng)基成分:蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%, pH 7.0，所述百分含量均為質(zhì)量百分含量。實(shí)施例中所使用的固體LB培養(yǎng)基成分，在液體LB培養(yǎng)基中加入1.5%瓊脂(質(zhì)量百分含量)。實(shí)施例1 3個(gè)歐米伽3的合成基因的獲得
歐米伽3的合成基因1-3，其核苷酸序列分別為SEQ ID N0.1_3。由上海生工生物工程公司合成。實(shí)施例2 sHJPR)2的獲得
SEQ ID N0.1的DNA序列通過DNA人工合成得到，合成后的5’端帶有I粘性末端，3’端帶有通ol粘性末端，把SEQ ID N0.1的DNA克隆到質(zhì)粒pETDuet-1 (購自Novagen公司)的MM/ZAol位點(diǎn)之中得到質(zhì)粒pHJPR)l (圖1A、圖2A) ；SEQ ID N0.2的DNA序列通過DNA人工合成得到，合成后的5’端帶有粘性末端，3’端帶有通ol粘性末端，把SEQ ID N0.2的DNA克隆到pACYCDuet-1 (購自Novagen公司)的M/el/ZAol位點(diǎn)之中得到質(zhì)粒pHJPR)2 (圖1B、圖2B) ；SEQ ID N0.3的DNA序列通過DNA人工合成得到，合成后的5’端帶有粘性末端，3’端帶有ZAoI粘性末端，把SEQ ID N0.3的DNA克隆到質(zhì)SpCOLADuet-1 (購自Novagen公司)的Afafel/JAoI位點(diǎn)之中得到質(zhì)粒pHJPF04 (圖1C、圖2C);把質(zhì)粒pHJPFOl轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (購自上海浩然生物技術(shù)有限公司)中得到菌株sBLFOl，把質(zhì)粒pHJPF02轉(zhuǎn)化到sBLFOl中得到菌株sHJPR)l，把質(zhì)粒pHJPF04轉(zhuǎn)化到大腸桿菌sHJPR)l中得到sHJPR)2，其分類名為大腸埃希氏菌，Escherichia coli,該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏日:2013年3月20日，保藏登記號:CGMCC N0.7338。實(shí)施例3 SHJPF02發(fā)酵生產(chǎn)EPA和DPA
將SHJPF02接種到含有100 μ g/L氨芐青霉素、50 μ g/L氯霉素和50 μ g/L卡那霉素的固體LB培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)箱中過夜；挑選sHJPR)2的單克隆接種到含有100 μ g/L氨芐青霉素、50 μ g/L氯霉素和50 μ g/L卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37 °C，200rpm，培養(yǎng)16小時(shí)；再接種至含有100 μ g/L氨芐青霉素、50 μ g/L氯霉素和50 μ g/L卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，接種量 1%，30 V，200rpm,培養(yǎng)24小時(shí)，8小時(shí)后每隔2小時(shí)取樣分析EPA和DPA的產(chǎn)量。取sHJPR)2的發(fā)酵菌液1ml，離心收集菌體；菌體加入2 ml含有2M HCl的甲醇溶液，100 °C加熱I小時(shí)，真空下抽干甲醇；抽干后的固體加入I ml乙酸乙酯和Iml 5 MNaCl，充分混合后，離心取上清液；上清液通過氣相色譜分析其中的EPA和DPA的含量。實(shí)施例4 SHJPF02的生產(chǎn)EPA和DPA的穩(wěn)定性
SHJPF02在含有100 μ g/L氨芐青霉素、50 μ g/L氯霉素和50 μ g/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 °C，200rpm，培養(yǎng)16小時(shí)；菌液加入無菌甘油至甘油終濃度為20%，_80°C保存0-6個(gè)月，EPA的產(chǎn)量穩(wěn)定在1.0 g/L左右，DPA的產(chǎn)量穩(wěn)定在0.3 g/L左右。
權(quán)利要求
1.歐米伽3的合成基因I，其核苷酸序列為SEQID N0.1。
2.歐米伽3的合成基因2，其核苷酸序列為SEQID N0.2。
3.歐米伽3的合成基因2，其核苷酸序列為SEQID N0.3。
4.含有權(quán)利要求1-3所述的合成基因的工程菌株sHJPR)2，該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏日:2013年3月20日，保藏登記號:CGMCC N0.7338;保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院，中科院微生物研究所。
5.一種構(gòu)建權(quán)利要求4所述的歐米伽3的工程菌株的方法，將具有SEQ ID N0.1序列的DNA克隆到質(zhì)粒pETDeut-Ι中得到質(zhì)粒pHJPR)l ;將具有SEQ ID N0.2序列的DNA克隆到質(zhì)粒pACY⑶eut-Ι中得到質(zhì)粒pHJPR)2 ;將具有SEQ ID N0.3序列的DNA克隆到質(zhì)粒pCOLADeut-Ι 中得到質(zhì)粒 pHJPF04 JfpHJPR)l、pHJPF02 和 pHJPF04 同時(shí)導(dǎo)入大腸桿菌BL21得到一株基因工 程菌株sHJPR)2。
全文摘要
一種新的歐米伽3的合成基因、含有合成基因的大腸菌及其構(gòu)建方法。本發(fā)明涉及基因技術(shù)和微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及微生物制藥領(lǐng)域中的基因工程菌株大腸菌sHJPF02，該菌株通過將歐米伽3合成酶基因?qū)氪竽c桿菌BL21得到，保藏登記號為CGMCCNo.7338，具有SEQIDNO.1-3的核苷酸序列。本發(fā)明提供的菌株可以生產(chǎn)EPA和DPA，可在工業(yè)化生產(chǎn)歐米伽3中應(yīng)用。
文檔編號C12N1/21GK103173445SQ20131012777
公開日2013年6月26日 申請日期2013年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月15日
發(fā)明者江輝 申請人:南京江輝生物科技有限公司