專利名稱：一種棗樹ssr標記分子遺傳圖譜的構建方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子生物學、遺傳學和基因組學領域，特別是指一種棗樹SSR標記分子遺傳圖譜的構建方法。
背景技術：
棗樹屬于鼠李科棗屬，是原產(chǎn)我國的特有果樹，種質(zhì)資源極其豐富，遺傳背景復雜，迄今至少已有7000年的栽培歷史。在長期的自然演化和人工選擇過程中，形成了豐富的變異，至今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和記載的棗樹品種和優(yōu)良類型達880多種。但是由于缺乏大量的多態(tài)性分子標記，其遺傳學和基因組學方面的研究相對比較滯后。申蓮英構建了第一個率樹分子遺傳圖譜(申連英.2005.率(Ziziphus jujubaMill)遺傳連鎖圖譜構建及性狀的QTL定位研究)，包括分布在14個連鎖群的333個AFLP(amplified fragment length polymorphism限制性片段長度多態(tài)性標記)標記，覆蓋基因組長度1237.4cM，平均圖距為3.9cM。齊靖等(齊靖，董禎，毛永民，等.棗高密度遺傳圖譜的構建與樹干直徑的QTL分析.林業(yè)科學，2009，45 (8):44-49)對該圖譜進行加密至 388 個 AFLP 標記和 35 個 RAPD (random amplified polymorphic DNA 即隨機擴增多態(tài)性DNA標記)標記由15個連鎖群，覆蓋基因組總長度1309.4cM，標記間平均距離3.1cM0但該圖譜缺乏通用性的共顯性標記，相對難以進行整合。因此，以共顯性SSR標記構建框架遺傳圖譜，對棗樹分子育種的發(fā)展具有重要的意義。RAPD、AFLP 和 SRAP(Sequence-related amplified polymorphism 即相關序列擴增多態(tài)性)標記等被用于棗樹的品種分類和親緣關系分析。但這些標記由于顯性特點等原因，加上新的標記的出現(xiàn)，漸漸較少用于遺傳圖譜構建。SSR(Simple sequence repeat簡單重復序列)標記，又叫微衛(wèi)星(Microsatellites)標記,具有數(shù)量豐富、共顯性、重復性、實驗技術簡便等突出的優(yōu)點，因此越來越多的作為錨定標記被應用到眾多物種的遺傳圖譜構建，尤其是框架遺傳圖譜構建。此外，SSR還被廣泛應用于遺傳多樣性分析、指紋圖譜、遺傳圖譜的構建中。本發(fā)明人利用磁珠富集法開發(fā)了冬棗SSR標記引物240對，篩選其中的多態(tài)引物構建棗樹的分子遺傳圖譜，從而進行相關性狀的QTL定位，可以推動棗樹重要性狀的遺傳控制研究和分子標記輔助育種的進程。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種棗樹SSR標記分子遺傳圖譜的構建方法。一種棗樹SSR標記分子遺傳圖譜的構建方法，其特征在于，包括如下步驟:I) DNA的提取:提取待測棗樹親本和子代的基因組DNA ；2) SSR標記引物的篩選:以親本材料篩選SSR標記引物；3)PCR擴增:分別利用上述SSR標記引物，各自以待測棗樹親本和子代的基因組DNA為模版，進行PCR擴增；4)圖譜構建:利用生物學軟件分析PCR擴增結果，構建棗樹SSR標記分子遺傳圖P曰。其中，所述步驟I)中所述待測棗樹親本是以冬棗為母本，以映山紅為父本；所述子代為149株F1代的子代。其中，所述步驟I)中所述DNA的提取使用改良后的CTAB法，具體步驟如下:(I)取適量CTAB提取液放入65°C水浴鍋中預熱待用；(2)取棗樹葉片0.5g，放入研缽中，加入少量PVP-40，在液氮中迅速研磨成粉末狀，轉(zhuǎn)移至裝有l(wèi)ml65°C預熱的CTAB提取液(用前加2% β -巰基乙醇混勻)的離心管中(用前做滅菌處理)；(3)將所述離心管旋渦劇烈振蕩，充分混勻，放入65°C水浴鍋中，水浴50min，每隔IOmin上下翻動離心管助充分混勻；(4) I2OOOrpm 常溫下離心 IOmin ；(5)取上清液于新的離心管中(注意吸取時不要觸及分界面，以免帶入雜質(zhì))，加入等體積水飽和酚/氯仿/異戊醇混合液(25: 24: I)(現(xiàn)用現(xiàn)配)，輕輕顛倒混勻，室溫放置IOmin ；(6) I2OOOrpm 常溫下離心 I Omin ；(7)取步驟(6)所得上清液于新的離心管中，加入等體積氯仿/異戊醇(24: I)再次抽提；(8)取步驟(7)所得上清液于新的離心管中，加等體積異丙醇，輕輕顛倒混勻，放置于_20°C冰箱中沉淀20min ；(9)挑出DNA絮狀沉淀到2ml離心管中，用70%乙醇清洗沉淀2次，每次30min ；(10)在超凈工作臺中用無菌風吹干沉淀，加入100μ I TE緩沖液溶解DNA，于-20°C保存待用。其中，所述步驟2)中所述SSR引物的篩選基于磁珠富集法，開發(fā)冬棗SSR引物，利用母本冬棗和父本映山紅進行SSR引物篩選，挑選母本冬棗和父本中至少一方表現(xiàn)為雜合的引物作為核心引物。其中，所述步驟2)中所述SSR引物如表3中所示的240對引物。其中，所述步驟2)中所述SSR引物如表3中所示的170對核心引物。其中，所述步驟2)還包括檢測提取的DNA的質(zhì)量。其中，所述步驟3)PCR擴增采用的是三引物法，即由在正向引物的5’端加上M13尾巴序列、特異反向引物以及帶有熒光標記的通用型M13引物。其中，所述帶有熒光標記的通用型Ml3引物如表I中所示。其中，所述步驟3) PCR擴增之后還包括對PCR擴增后的結果進行檢測，采用毛細管電泳檢測。其中,所述步驟4)中所述生物學軟件為Genemarker V1.75軟件,讀取后的數(shù)據(jù)經(jīng)過FlexiBinv2程序矯正后用于后續(xù)分析。其中，所述步驟4)中分別對PCR擴增結果進行X 2檢驗，分析其是否符合孟德爾分離定律，在5%的顯著水平下找到偏分離標記并去除，分別將三種分離形式(I: 1、1: 2: 1、1:1:1:1)的標記類型轉(zhuǎn)化為統(tǒng)一的格式，選用全同胞群體遺傳圖譜構建軟件FslinkageMAP進行分子遺傳圖譜的構建。
本發(fā)明的有益效果如下:1、提供了棗樹的170對核心引物，建立了高效的棗樹SSR標記分析技術體系。2、采用FslinkageMAP作圖軟件,能夠利用Mapmaker和Joinmap不能利用的標記，提聞標記的利用效率。3、采用毛細管電泳SSR基因型分型技術，提高實驗的效率和準確性。4、SSR標記分析過程中采用8 μ I的PCR擴增體系，降低實驗成本。本發(fā)明利用磁珠富集法開發(fā)了冬棗SSR引物240對，篩選其中的SSR引物構建棗樹的遺傳圖譜，從而進行相關性狀的QTL定位，可以推動棗樹重要性狀的遺傳控制研究和分子標記輔助育種的進程。
圖1為本發(fā)明實施例的率樹SSR標記分子遺傳圖譜。
具體實施例方式為使本發(fā)明要解決的技術問題、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面將在具體實施例進行詳細描述。如果沒有特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域普通技術人員熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。本發(fā)明實施例提供的棗樹SSR標記分子遺傳圖譜的構建方法，包括:步驟I提取DNA所述棗樹的基因組DNA提取方法，采用改良后的CTAB法，具體步驟如下:步驟11取適量CTAB提取液放入65 °C水浴鍋中預熱待用；
步驟12取棗樹葉片0.5g，放入研缽中，加入少量PVP-40，在液氮中迅速研磨成粉末狀，轉(zhuǎn)移至裝有l(wèi)ml65°C預熱的CTAB提取液(用前加2% β -巰基乙醇混勻)的離心管中(用前做滅菌處理)；步驟13旋渦劇烈振蕩，充分混勻，放入65°C水浴鍋中，水浴50min，每隔IOmin上下翻動離心管助充分混勻；步驟1412000rpm 常溫下離心 IOmin ；步驟15取上清液于新的離心管中(注意吸取時不要觸及分界面，以免帶入雜質(zhì))，加入等體積水飽和酚/氯仿/異戊醇混合液(25: 24: I)(現(xiàn)用現(xiàn)配)，輕輕顛倒混勻，室溫放置IOmin ；步驟1612000rpm 常溫下離心 IOmin ；步驟17取步驟16所得上清液于新的離心管中，加入等體積氯仿/異戊醇(24: I)再次抽提；步驟18取步驟17所得上清液于新的離心管中，加等體積_20°C遇冷的異丙醇沉淀DNA，輕輕顛倒混勻，放置于_20°C冰箱中沉淀20min ；步驟19挑出DNA絮狀沉淀到2ml離心管中，用70%乙醇清洗沉淀2次，每次30min ；步驟20在超凈工作臺中用無菌風吹干沉淀，加入100μ I TE緩沖液溶解DNA，于-20°C保存待用。
用此方法提取以棗樹品種‘冬率’為母本的DNA，以‘映山紅’為父本的DNA，以及149株F1代的DNA，分別得到各自的DNA樣品液。步驟2檢測DNA分別取3 μ I步驟I所得的DNA樣品液，在超微量紫外分光光度計上測量其DNA含量(μ g/ml)、A260nm/A280nm的值及其在260nm處的吸收峰，檢測DNA的純度。分別取5μ I步驟I所得DNA樣品混合I μ 16 X Loading Buffer,在濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳中檢測DNA的完整性。步驟3篩選、擴增及檢測選擇本發(fā)明人利用磁珠富集法開發(fā)的240對‘冬率’ SSR標記引物，利用2個親本材料‘冬棗’和‘映山紅’進行SSR引物篩選，SSR標記引物(見表3:240對SSR引物信息表)由金唯智(北京)生物科技有限公司合成，挑選在‘冬棗’和‘映山紅’中至少一方表現(xiàn)為雜合的引物，并且隨機挑選子代DNA進行擴增檢測，挑選出擴增效果穩(wěn)定、無雜帶、信號較強的170對SSR核心引物(見表3所示)用于分子遺傳圖譜的構建。本發(fā)明利用三引物法PCR(即由在正向引物的5’端加上M13尾巴序列、特異反向引物以及帶有熒光標記的通用型M13引物，熒光標記的通用型M13引物見表1(M13熒光引物表)，利用毛細管電泳技術同時檢測不同熒光染料標記的多個SSR位點)擴增SSR位點。PCR反應體系包括:2xTaq PCR預混溶液(北京博邁德科技發(fā)展有限公司)4 μ 1，正向引物(1μΜ)0.32μ I,反向引物(I μ Μ) 1.28 μ 1，Μ13 引物(I μ Μ) 1.28 μ 1，模版DNA0.80 μ 1，ddH200.32 μ 1，總體積 8.00 μ I。PCR 擴增程序:步驟 I:94°C 5 分鐘；步驟 2:94°C 30 秒，55°C 40 秒，72°C 45 秒，共 30 循環(huán)；步驟 3 -MV 30 秒，53°C 40 秒，72°C 45 秒，共8循環(huán)；步驟4:72°C 10分鐘；步驟5:10°C保存。擴增結果送金唯智(北京)生物科技有限公司進行毛細管電泳檢測。步驟4結果處理利用Genemarker V1.75 (Soft Genetics LLC, USA)軟件讀取毛細管電泳原始數(shù)據(jù)，讀取后的數(shù)據(jù)經(jīng)過FlexiBinV2程序矯正后用于后續(xù)分析。在240對SSR引物的篩選過程中，共挑選出170對擴增穩(wěn)定、基本無雜帶并且信號較強的SSR核心引物用于后續(xù)的分子圖譜構建。步驟5偏分離標記檢測分別對170個擴增結果的子代分離情況進行X 2檢驗，分析其是否符合孟德爾分離定律，在5 %的顯著水平下找到偏分離標記，有57對標記在5 %的顯著水平下確定為偏分離標記，偏分離比率為33.5%，在構建分子遺傳連鎖圖譜時將偏分離標記去除。步驟6分子遺傳圖譜的構建分別將113個所擴增出的分離形式的類型(1: 1、1: 2: 1、1:1:1:1)轉(zhuǎn)化為統(tǒng)一的格式，用全同胞群體遺傳圖譜構建軟件FslinkageMAP構建的棗樹分子遺傳圖 圖1為本發(fā)明實施例的棗樹SSR標記分子遺傳圖譜，左邊數(shù)據(jù)表示兩個標記之間的相對距離，右邊表示所用標記編號。根據(jù)圖譜結果，作圖的113個標記，有106個標記被定位在圖譜上，標記利用率為93.8%，構建出一張包含16個連鎖群，總長為579.86cM的遺傳連鎖圖譜，平均圖距為5.47cM，最長的連鎖群包含15個標記，總長為91.66cM，平均圖距為6.llcM(參見表2:SSR標記在圖譜上的分布)；最短的連鎖群包含4個標記，總長為3.90cM，平均圖距為0.98cM。表2顯示的是詳細的圖譜信息。表I
權利要求
1.一種棗樹SSR標記分子遺傳圖譜的構建方法，其特征在于，包括如下步驟: 1)DNA的提取:提取待測棗樹親本和子代的基因組DNA ； 2)SSR標記引物的篩選:以親本材料篩選SSR標記引物； 3)PCR擴增:分別利用上述SSR標記引物，各自以待測棗樹親本和子代的基因組DNA為模版，進行PCR擴增； 4)圖譜構建:利用生物學軟件分析PCR擴增結果，在5%的顯著水平下下找到偏分離標記并去除,構建棗樹SSR標記分子遺傳圖譜。
2.根據(jù)權利要求1所述的棗樹SSR標記分子遺傳圖譜的構建方法，其特征在于，所述步驟I)中所述待測棗樹親本是以冬棗為母本，以映山紅為父本；所述子代為149株F1代的子代。
3.根據(jù)權利要求1所述的棗樹SSR標記分子遺傳圖譜的構建方法，其特征在于，所述步驟I)中所述DNA的提取使用改良后的CTAB法，具體步驟如下: (1)取適量CTAB提取液放入65°C水浴鍋中預熱待用； (2)取棗樹葉片0.5g，放入研缽中，加入少量PVP-40，在液氮中迅速研磨成粉末狀，轉(zhuǎn)移至裝有l(wèi)ml65°C預熱的CTAB提取液的離心管中； (3)旋渦劇烈振蕩，充分混勻，放入65°C水浴鍋中，水浴50min，每隔IOmin上下翻動離心管，充分混勻； (4)12000rpm 常溫下離心 IOmin ； (5)取上清液于新的離心 管中，加入等體積水飽和酚/氯仿/異戊醇混合液，其配比為25:24:1，輕輕顛倒混勻，室溫放置IOmin ； (6)12000rpm 常溫下離心 IOmin ； (7)取步驟(6)所得上清液于新的離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇混合液，其配比為24:1，再次抽提； (8)取步驟(7)所得上清液于新的離心管中，加等體積異丙醇，輕輕顛倒混勻，放置于_20°C冰箱中沉淀20min ； (9)挑出DNA絮狀沉淀到2ml離心管中，用70%乙醇清洗沉淀2次，每次30min； (10)在超凈工作臺中用無菌風吹干沉淀，加入100μ I TE緩沖液溶解DNA，于-20°C保存待用。
4.根據(jù)權利要求2所述的棗樹SSR標記分子遺傳圖譜的構建方法，其特征在于，所述步驟2)中所述SSR標記引物為表3中所示的240對引物；所述步驟2)中所述SSR標記引物的篩選基于磁珠富集法，開發(fā)冬棗SSR引物，利用母本冬棗和父本映山紅進行SSR標記引物篩選，挑選母本冬棗和父本中至少一方表現(xiàn)為雜合的引物作為核心引物。
5.根據(jù)權利要求4所述的棗樹SSR標記分子遺傳圖譜的構建方法，其特征在于，所述核心引物為表3中所示的170對核心引物。
6.根據(jù)權利要求4或5所述的棗樹SSR標記分子遺傳圖譜的構建方法，其特征在于，所述步驟2)包括檢測提取的DNA的質(zhì)量。
7.根據(jù)權利要求6所述的棗樹SSR標記分子遺傳圖譜的構建方法，其特征在于，所述步驟3 ) PCR擴增采用的是三引物法，即由在正向引物的5 ’端加上Ml3尾巴序列、特異反向引物以及帶有熒光標記的通用型M13引物。
8.根據(jù)權利要求7所述的棗樹SSR標記分子遺傳圖譜的構建方法，其特征在于，所述步驟3) PCR擴增之后還包括對PCR擴增后的結果進行檢測，采用毛細管電泳檢測。
9.根據(jù)權利要求8所述的棗樹SSR標記分子遺傳圖譜的構建方法，其特征在于，所述步驟4)中所述生物學軟件為Genemarker V1.75軟件,讀取后的數(shù)據(jù)經(jīng)過FlexiBinv2程序矯正后用于后續(xù)分析。
10.根據(jù)權利要求1所述的棗樹SSR標記分子遺傳圖譜的構建方法，其特征在于，所述步驟4)中分別對PCR擴增結果進行X 2檢驗，分析其是否符合孟德爾分離定律，在5%的顯著水平下找到偏分離標記并去除，分別將三種分離形式:1:1、1:2:1、1:1:1:1的標記類型轉(zhuǎn)化為統(tǒng)一的格式，選用全同胞群體遺傳圖譜構建軟件FslinkageMAP進行分子遺傳圖譜的構建 。
全文摘要
本發(fā)明公開一種棗樹SSR標記分子遺傳圖譜的構建方法，包括如下步驟1)提取待測棗樹親本和子代的基因組DNA；2)以親本材料篩選SSR引物；3)分別利用上述SSR引物，各自以待測棗樹親本和子代的基因組DNA為模版，進行PCR擴增；4)利用生物學軟件分析PCR擴增結果，構建棗樹SSR標記分子遺傳圖譜。本發(fā)明建立了高效低成本的棗樹SSR標記技術體系，獲得的SSR標記和核心引物組，具有高效性、穩(wěn)定性和共顯性等優(yōu)點。利用該套標記可以進行棗樹遺傳圖譜構建、遺傳多樣性分析、品種鑒定和分子標記輔助育種等研究，推動棗樹遺傳學和育種技術的發(fā)展。
文檔編號C12Q1/68GK103173562SQ201310127570
公開日2013年6月26日 申請日期2013年4月12日 優(yōu)先權日2013年4月12日
發(fā)明者龐曉明, 王斯琪, 李穎岳, 劉君, 續(xù)九如 申請人:北京林業(yè)大學