專利名稱：具毒性質粒沙門氏菌熒光pcr檢測探針、試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發明屬于沙門氏菌屬檢測技術領域，尤其涉及具毒性質粒沙門氏菌熒光PCR檢測探針、試劑盒及檢測方法。
背景技術：
現有市場上銷售的沙門氏菌屬熒光定量PCR檢測試劑盒和沙門氏菌屬熒光PCR試劑盒，這些試劑盒是運用熒光PCR技術檢測出沙門氏菌屬的全部種類。但現有技術的PCR檢測沙門氏菌屬均為普通PCR方法，其檢測靈敏度較低，檢測速度較慢，PCR擴增時間太長，電泳成本較高且時間長。
發明內容
本發明要解決的技術問題在于:提供一種具毒性質粒沙門氏菌熒光PCR檢測探針，從而實現將具有毒性質粒的沙門氏菌能從眾多的沙門氏菌屬的種類中迅速準確檢測出來。本發明要解決的又一技術問題在于:提供一種具毒性質粒沙門氏菌熒光PCR檢測試劑盒，以利于方便快捷地將致病性沙門氏菌檢出。本發明要解決的再一技術問題在于:提供一種具毒性質粒沙門氏菌熒光PCR檢測方法，從而將具有毒性質粒的沙門氏菌能從眾多的沙門氏菌屬的種類中迅速準確檢測出
來。 為解決上述技術問題，本發明采取的技術方案是:具毒性質粒沙門氏菌熒光PCR檢測探針，為Taqman熒光探針,具有序列為:
5’ -FAM-AGG GCT GGC GAT GTT ACT C-TAMRA-3’705-723
19bp Tm= 57.4 GC=57.9HO DO FO
所述Taqman熒光探針與特異性引物spVR-P35_P36配套使用進行熒光PCR檢測。進一步地，所述特異性引物spvR-P35_P36為:
上游引物:
P35:5’ -GGA AAT CGG ACC TAC GGG-3’249-266
18bp Tm=57.4 GC=61.1% HO DO FO 下游引物:
P36:5’ -AAT CCC AGA GCC CGA CAG-3’755-738
18bp Tm=57.7 GC=61.1% HO DO F0。本發明還提供毒性質粒沙門氏菌熒光PCR檢測試劑盒，其包括所述的具毒性質粒沙門氏菌熒光PCR檢測探針。進一步地，所述試劑盒還包括沙門氏菌PCR反應液、Taq酶、沙門氏菌陽性對照及沙門氏菌陰性對照；所述沙門氏菌PCR反應液包括所述具毒性質粒沙門氏菌熒光PCR檢測探針以及所述引物P35和引物P36。進一步地，所述沙門氏菌陽性對照為鼠傷寒沙門氏菌DNA提取液；所述沙門氏菌陰性對照為大腸埃希氏菌DNA提取液。進一步地，所述試劑盒中的相對規格為:沙門氏菌PCR反應液為500 ML，Taq酶為5U/ML 20 ML，沙門氏菌陽性對照為0.5 mL，沙門氏菌陰性對照為0.5 mL ;所述檢測試劑盒
還包括一細菌基因組DNA提取試劑盒。進一步地，所述沙門氏菌PCR反應液組成及配比為:不含MgCl2的10 X PCR緩沖液 2.5iiL，25 mmol/L MgCl2 3 u L, 10 mmol/L dNTPs 0.5 u L, 10 ii mol/L 的引物 P35 和引物P36各0.5iiL，10iimol/L的TaqMan探針0.5 y L ;或者，單次反應25 y L PCR反應液組成及配比為:Mg2+ Plus 的 10 XPCR 緩沖液 3.0ii L，25mM each 的 dNTP Mixture 0.5u L,5 U/U L 的 Taq DNA 聚合酶 0.25 ii L，25 ii mol/L 的 TaqMan 探針 0.5 ii L，50 ii mol/L 的引物 P35為 0.5 ii L，50 ii mol/L 的引物 P36 為 0.5 y L，50 y g/mL 模板 DNA 為 2 y L,超純水 17.75 u L。本發明還提供具毒性質粒沙門氏菌熒光PCR檢測方法，包括以下步驟:
步驟1:模板DNA提取；
步驟2:配制熒光PCR反應體系，并設定空白、沙門氏菌陽性對照、沙門氏菌陰性對照，所述熒光PCR反應體系包括上述具毒性質粒沙門氏菌熒光PCR檢測探針；
步驟3:設定PCR反應條件進行熒光PCR檢測；
步驟4:結果判斷:根據擴增結果，對照空白管、陽性對照管、陰性對照管擴增曲線，確定樣品的擴增結果。進一步地，步驟2中所述沙門氏菌陽性對照為鼠傷寒沙門氏菌DNA提取液；所述沙門氏菌陰性對照為大腸埃希氏菌DNA提取液。進一步地，所述步驟2的熒光PCR反應體系25 L單次反應時組成及配比如下: 10 X PCR 緩沖液 Mg2+ Plus 3.0il L: 500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris Cl,在 25。。
下，pH9.0, 1.0% Triton X-100
dNTP Mixture 25mM each:0.5 u L5 U/u L Taq DNA 聚合酶:0.25 U L25 u mol/L TaqMan 探針:0.5 U L50 ii mol/L 引物 35: 0.5 u L50 ii mol/L 引物 36: 0.5 u L50 u g/mL 模板 DNA: 2 u L超純水:17.75iiL
所述PCR反應條件為95°C，5 min ；95°C , 5s, 60 V，40 s, 40個循環，4°C保存。本發明的有益效果:本發明利用特異性引物和探針，運用熒光PCR技術將具有毒性質粒的沙門氏菌能從眾多的沙門氏菌屬的種類中迅速檢測出來，而具有毒性質粒沙門氏菌種類，均為高致病性沙門氏菌，可以引起人類和動物致病，也是食源性疾病的重要病原菌之一。故本發明《具毒素質粒沙門氏菌熒光PCR快速檢測試劑盒》不僅用于食品檢測，也可應用于醫學診斷。 本發明的具毒素質粒沙門氏菌熒光PCR檢測探針、試劑盒及檢測方法，能快速檢測出具有毒性質粒的有致病作用的沙門氏菌，比普通PCR的檢測速度更快，不僅大大節省PCR的擴增時間，也節省了電泳的成本和時間，有助于對人和動物常見沙門氏菌病的早期臨床診斷和食物、水源、環境中沙門氏菌的跟蹤監測，并對于公共衛生、食品衛生、畜牧獸醫和口岸檢疫中的致病性沙門氏菌的檢出具有重要的實際意義。
圖1 (縱座標表示的是熒光強度，橫座標表示是循環數)是本發明實施例的具毒素質粒沙門氏菌熒光PCR快速檢測試劑盒檢測圖譜，其中從下往上9條曲線分別表示:1:大腸埃希氏菌(陰性對照)、S空白對照、1:鼠傷寒沙門氏菌、I豬霍亂沙門氏菌、￡樣品分離株沙門氏菌、S雞白痢沙門氏菌、T雞傷寒沙門氏菌、I'羊流產沙門氏菌、I；腸炎沙門氏菌。
具體實施例方式以下具體實施例對本發明作進一步的說明，以下實施例僅用于說明本發明，而不用于限定本發明的范圍。具有毒性質粒的沙門氏菌菌株對小鼠的毒力要比其相應的無質粒菌株強至數百甚至數萬倍，截至目前已先后在鼠傷寒、豬霍亂、腸炎、羊流產、雞傷寒、雞白痢等沙門氏菌中鑒定出不同分子量的毒力質粒，由于不同血清型沙門氏菌的毒力質粒(spv)中存在一個含毒力基因的高度保守的IOkb左右的區域，因此通過對此保守區的檢測，可以鑒定出常見的具有毒性質粒的沙門氏菌。本發明基于最常見的具有毒性質粒的沙門氏菌種類，在普通PCR的基礎上，設計出一條具有序列特異性的Taqman熒光探針；最終連同常規的DNA提取液，沙門氏菌PCR反應液、Taq酶等組裝成一套具毒素質粒沙門氏菌熒光PCR快速檢測試劑盒。
從NCBI 的 GenBank 數據庫中搜索 S.typhimurium, S.choleraesuis,S.enteritidis, S.gall1-narum各代表菌株公布的spvR基因序列如序列表中SEQ ID N0.1，遞交NCBI進行Blast檢索，并遞交EBI利用ClustalW(l.82)軟件進行多重序列比對。通過Blast檢索和多重序列比對，發現spvR基因序列具有很強的保守性，結合多重PCR考慮，利用Primer Premier 5軟件設ii 對特異性引物spvR_P35_P36,與此同時,設計出一條Taqman突光探針,具體結果如下:
上游引物:
P35:5’ -GGA AAT CGG ACC TAC GGG-3’249-266
18bp Tm=57.4 GC=61.1% HO DO FO 下游引物:
P36:5’ -AAT CCC AGA GCC CGA CAG-3’755-738
18bp Tm=57.7 GC=61.1% HO DO FO Taqman突光探針:
5’ -FAM-AGG GCT GGC GAT GTT ACT C-TAMRA-3’705-723
19bp Tm= 57.4 GC=57.9HO DO FO
運用這條Taqman突光探針，同時與特異性引物spvR_P35_P36配套使用，在RocheIightcycler系列熒光定量PCR儀上進行熒光PCR實驗驗證，結果同時檢測出6種具有毒性質粒的沙門氏菌，特異性和靈敏性好。其最大的優點及積極效果是:能快速檢測出具有毒性質粒及有致病作用的沙門氏菌。本發明比普通PCR的檢測速度更快，不僅大大節省PCR的擴增時間，也節省了電泳的成本和時間。本發明進一步建立具毒性質粒沙門氏菌熒光PCR快速檢測試劑盒，用于對人和動物常見沙門氏菌病的早期臨床診斷和食物、水源、環境中沙門氏菌的跟蹤監測，并對于公共衛生、食品衛生、畜牧獸醫和口岸檢疫中的致病性沙門氏菌的檢出具有重要的實際意義。該毒性質粒沙門氏菌熒光PCR快速檢測試劑盒具體組成及其功用作為一實施例如下表1，但需說明的是，表中所述規格及數量可適當調整和選擇，也可選擇其它規格及數量:
權利要求
1.具毒性質粒沙門氏菌熒光PCR檢測探針,為Taqman熒光探針,具有序列為: 5’ -FAM-AGG GCT GGC GAT GTT ACT C-TAMRA-3’705-723 19bp Tm= 57.4 GC=57.9HO DO FO 所述Taqman熒光探針與特異性引物spVR-P35_P36配套使用進行熒光PCR檢測。
2.如權利要求1所述的具毒性質粒沙門氏菌熒光PCR檢測探針，其特征在于:所述特異性引物spvR-P35-P36為: 上游引物: P35:5’ -GGA AAT CGG ACC TAC GGG-3’249-266 18bp Tm=57.4 GC=61.1% HO DO FO 下游引物: P36:5’ -AAT CCC AGA GCC CGA CAG-3’755-738 18bp Tm=57.7 GC=61.1% HO DO F0。
3.具毒性質粒沙門氏菌熒光PCR檢測試劑盒，其特征在于:包括如權利要求廣2中任一項所述的具毒性質粒沙門氏菌熒光PCR檢測探針。
4.如權利要求3所述的具毒性質粒沙門氏菌熒光PCR檢測試劑盒，其特征在于:所述試劑盒還包括沙門氏菌PCR反應液、Taq酶、沙門氏菌陽性對照及沙門氏菌陰性對照；所述沙門氏菌PCR反應液包括所述具毒性質粒沙門氏菌熒光PCR檢測探針以及所述引物P35和引物P36。
5.如權利要求4所述的具毒性質粒沙門氏菌熒光PCR檢測試劑盒，其特征在于:所述沙門氏菌陽性對照為鼠傷寒沙門氏菌DNA提取液；所述沙門氏菌陰性對照為大腸埃希氏菌DNA提取液。
6.如權利要求4所述的具毒性質粒沙門氏菌熒光PCR檢測試劑盒，其特征在于:所述試劑盒相對規格為:沙門氏菌PCR反應液為500 ML，Taq酶為5U/ML 20 ML，沙門氏菌陽性對照為0.5 mL,沙門氏菌陰性對照為0.5 mL ;所述檢測試劑盒還包括一細菌基因組DNA提取試劑盒。
7.如權利要求6所述的具毒性質粒沙門氏菌熒光PCR檢測試劑盒，其特征在于:所述沙門氏菌PCR反應液組成及配比為:不含MgCl2的10 X PCR緩沖液2.5 ii L，25 mmol/L MgCl2 3u L, 10 mmol/L dNTPs 0.5 u L, 10 ii mol/L 的引物 P35 和引物 P36 各 0.5 y L，lOumol/L的TaqMan探針0.5 ii L ;或者，單次反應25 ii L PCR反應液組成及配比為:Mg2+Plus 的 10 X PCR 緩沖液 3.0ii L，25mM each 的 dNTP Mixture 0.5u L,5 U/u L 的 Taq DNA聚合酶 0.25ii L，25 u mol/L 的 TaqMan 探針 0.5 y L，50 y mol/L 的引物 P35 為 0.5 y L，50 u mol/L 的引物 P36 為 0.5 y L，50 y g/mL 模板 DNA 為 2 y L,超純水 17.75 u L。
8.具毒性質粒沙門氏菌熒光PCR檢測方法，包括以下步驟: 步驟1:模板DNA提取； 步驟2:配制熒光PCR反應體系，并設定空白、沙門氏菌陽性對照、沙門氏菌陰性對照，所述熒光PCR反應體系包括如權利要求f 2中任一項所述的具毒性質粒沙門氏菌熒光PCR檢測探針； 步驟3:設定PCR反應條件進行熒光PCR檢測； 步驟4:結果判斷:根據擴增結果，對照空白管、陽性對照管、陰性對照管擴增曲線，確定樣品的擴增結果。
9.如權利要求8所述的具毒性質粒沙門氏菌熒光PCR檢測方法，其特征在于:步驟2中所述沙門氏菌陽性對照為鼠傷寒沙門氏菌DNA提取液；所述沙門氏菌陰性對照為大腸埃希氏菌DNA提取液。
10.如權利要求8所述的具毒性質粒沙門氏菌熒光PCR檢測方法，其特征在于:所述步驟2的熒光PCR反應體系25 ii L單次反應時組成及配比如下:·10 XPCR 緩沖液 Mg2+ Plus 3.0ii L: 500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris Cl,在 25。。下，pH9.0, 1.0% Triton X-100dNTP Mixture 25mM each:0.5 u L·5 U/u L Taq DNA 聚合酶:0.25 U L·25 u mol/L TaqMan 探針:0.5 U L·50 ii mol/L 引物 35: 0.5 u L·50 ii mol/L 引物 36: 0.5 u L·50 u g/mL 模板 DNA: 2 u L超純水:17.75iiL 所述PCR反應條件 為95°C，5 min ；95°C , 5s, 60 V，40 s, 40個循環，4°C保存。
全文摘要
本發明涉及一種具毒性質粒沙門氏菌熒光PCR檢測探針、試劑盒及檢測方法，該熒光PCR檢測探針具有序列為5’-FAM-AGGGCTGGCGATGTTACTC-TAMRA-3’，705-723，19bp，Tm=57.4，GC=57.9，H0，D0，F0，Taqman熒光探針與特異性引物spvR-P35-P36配套使用進行熒光PCR檢測，從而將具有毒性質粒的沙門氏菌能從眾多的沙門氏菌屬的種類中迅速準確檢測出來。
文檔編號C12Q1/68GK103243159SQ20131012455
公開日2013年8月14日 申請日期2013年4月11日 優先權日2013年4月11日
發明者馬立農 申請人:深圳職業技術學院