專利名稱：致瀉性大腸桿菌檢測試劑盒及其檢測分型方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學及微生物檢測技術領域，尤其涉及一種致瀉性大腸桿菌檢測試劑盒及其檢測分型方法。
背景技術：
大腸桿菌為人和動物腸道中的常居菌，一般多不致病，在一定條件下可引起腸道外感染。而某些血清型菌株具有較強的致病性，可引起腹瀉，此種菌株可通過飲食導致腹瀉。致瀉性大腸桿菌(DEC)是細菌性腹瀉的常見病原菌，它包括腸致病性大腸桿菌(enteropathogenie E.coli, EPEC)> 腸產毒性大腸桿菌(enterotoxigenicE.coli, ETEC)、腸侵襲性大腸桿菌(enteroinvasive E.coli, EIEC)、腸出血性大腸桿菌(enterohemorrhagic E.coli, EHEC)和腸粘附性大腸桿菌(enteroaggregative E.coli,EAEC)。DEC感染主要見于嬰幼兒，近年來其在成人腹瀉病人中的檢出率有所增加，并成為部分地區致腹瀉的主要病原菌，且對常用藥物出現了較高的耐藥性，因此受到了廣泛的關注。傳統的分離培養技術是DEC鑒定、檢測的標準方法，但常規的細菌培養與鑒定方法不足以將各種DEC鑒別開，因為許多血清型與基因型不一致。且傳統方法需要經過一系列復雜的實驗步驟，檢測周期長，操作繁瑣，準確性低，耗時費力，無法滿足臨床和實際工作的需要。DEC引起的臨床癥狀多為水樣腹瀉，無法從癥狀判讀型別指導臨床用藥，因此這需要既能快速檢測又能實現多重檢測。隨著分子生物學技術的快速發展，PCR技術已被廣泛應用于細菌的檢測和分類。然而常規PCR技術的后電泳容易導致污染， 易產生假陽性，使檢測結果不準確。實時定量PCR以快速、準確等突出優點被廣泛應用，但目前所采用的實時定量PCR方法多為單一的熒光定量PCR方法，只能檢測一種致病菌，不能滿足多重檢測的要求，因此效率有待提高。
發明內容
本發明的目的在于提供一種致瀉性大腸桿菌檢測試劑盒，旨在解決現有檢測技術中檢測對象單一，檢測效率低，準確度不高的問題。本發明實施例是這樣實現的，一種致瀉性大腸桿菌檢測試劑盒，包括PCR反應緩沖液、MgCl2、dNTP、DNA聚合酶，還包括以下引物和探針:針對stp基因的引物和探針:stp-F:5’ -GCAAGCCCTCACGTAGCGAAAAAAGCGAGTGCACCTCGACA-3’ (SEQ ID NO:1),stp-R:5’-GCAAGCCCTCACGTAGCGAACAGTTGACTGACTAAAAGAGGGG-3’(SEQ ID NO:2)，stp-probe:5，-CGCGTCTCAAATATCCGTGAAACAACATGACGCG-3’ (SEQ ID NO:3)；針對sth基因的引物和探針:sth-F:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGTGGTCCTGAAAGCATGAATAG-3’ (SEQ ID NO:4)，sth-R:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAACAACAAAGCAACAGGTACATACG-3，(SEQ ID NO:5),sth-probe:5’-CGCGGTGAATTGTGTTGTAATCCTGCTTGTACCGCG-3’ (SEQ ID NO:6)；
針對It基因的引物和探針:lt-F:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAACAGGAGGTTTCTGCGTTAG-3’ (SEQ ID NO:7)，lt-R:5’-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGGTGGGAAACCTGCTAATCT-3’ (SEQ ID NO:8),lt-probe:5’-CGCCGGTATTACAGAAATCTGAATATAGCTCCGGCG-3’ (SEQ ID NO:9)；針對aggR基因的引物和探針:aggR-F:5， -GCAAGCCCTCACGTAGCGAATGCAAAAGAAGAAATCAACAGT-3， (SEQ IDNO:10),aggR-R:5， -GCAAGCCCTCACGTAGCGAACAGAATCGTCAGCATCAGCTAC-3， (SEQ IDNO:11),aggR-probe:5’-CGGACAAAAGTAGATGCTTGCAGTTGTCCG-3’ (SEQ ID NO: 12)；針對eaeA基因的引物和探針:eaeA-F:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGTAACCAGGCTTCGTCACA-3’ (SEQ ID NO: 13)，eaeA-R:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGGAAAAAACGCTGACCCG-3’ (SEQ ID NO: 14)，eaeA-probe:5，-CCCAGTGGTAATAACTTTGACGGTAGTTCACTGGG-3，(SEQ ID NO: 15)；針對escV基因的引物和探針:escV-F:5， -GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGGCTCTCTTCTTCTTTATGGCTG-3’ (SEQ IDNO:16)，escV-R:5’ -GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGGGAAAGAAGTTAGTTCAAGAGGAT-3’ (SEQ IDNO:17)，escV-probe:5，-CCCGCGCAACAGTTGTGGTGGATATCATTATCGCGGG-3， (SEQ ID NO:18)；針對stxl基因的引物和探針:stxl-F:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAASAGCGGTTACATTGTCTGGT-3，(SEQ ID NO:19)，stxl-R:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAACTGCGTCAGTGAGGTTCCA-3’ (SEQ ID NO:20)，stxl-probe:5，-CCGCGTACGGGGATGCAGATAAATCGCGG-3’ (SEQ ID NO:21)；針對stx2基因的引物和探針:stx2-F: 5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAACATGACAACGGACAGCAGTTA-3，(SEQ ID NO:22)，stx2-R:5’ -GCAAGCCCTCACGTAGCGAATCTGGTCATTGTATTACCACTGAA-3’ (SEQ IDNO:23)，stx2-probe:5，-CCGCCACTCACTGGTTTCATCATATCTGGCGG-3’ (SEQ ID NO:24)；針對ipaH基因的引物和探針:ipaH-F:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGAAAACCCTCCTGGTCCATC-3’ (SEQ ID NO:25)，ipaH-R:5， -GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGTCTGGAAGGCCAGGTAGACTT-3， (SEQ IDNO:26)，ipaH-probe:5，-CCCGGCTGGAGGACATTGCCCGGG-3’ (SEQ ID NO:27)；其中各條探針序列5’端連接有熒光基團，3’端連接有淬滅基團；該檢測試劑盒還包括如下Homo-tag:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAA-3，(SEQ ID NO:28)。本發明實施例的另一目的在于提供一種致瀉性大腸桿菌檢測和分型方法，該檢測和分型方法利用本發明的致瀉性大腸桿菌檢測試劑盒，步驟如下:
獲得并處理樣品，加入至致瀉性大腸桿菌檢測試劑盒中，進行熒光定量PCR反應，獲得檢測結果。本發明提供的致瀉性大腸桿菌檢測試劑盒及其檢測方法，根據目前國際上對致瀉性大腸桿菌的五種分類(腸產毒性大腸桿菌(ETEC)、腸粘附性大腸桿菌(EAEC)、腸侵襲性大腸桿菌(EIEC)、腸致病性大腸桿菌(EPEC)和腸出血性大腸桿菌(EHEC))設計同源加尾引物和改良分子信標探針，利用實時熒光定量PCR技術，對五種致瀉性大腸桿菌同時進行檢測和分型，本發明的檢測方法特異性好，靈敏度高，操作簡便，結果易于判讀，避免了假陽性的出現，適用于對致瀉性大腸桿菌的快速篩查和分型。
具體實施例方式為了使本發明要解決的技術問題、技術方案及有益效果更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。本發明實施例提供一種基于改進的熒光定量PCR技術的致瀉性大腸桿菌檢測試劑盒，包含PCR反應緩沖液、MgCl2、dNTP、DNA聚合酶，同時該檢測試劑盒還包括以下引物和探針:針對stp基因的引物和探針:stp-F:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAAAAAGCGAGTGCACCTCGACA-3’ (SEQ ID NO:1),stp-R:5’-GCAAGCCCTCACGTAGCGAACAGTTGACTGACTAAAAGAGGGG-3’(SEQ ID NO:2)，stp-probe:5， -CGCGTCTCAAATATCCGTGAAACAACATGACGCG-3’ (SEQ ID NO:3)；針對sth基因的引物和探針:sth-F:5’-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGTGGTCCTGAAAGCATGAATAG-3’ (SEQ ID NO:4)，
sth-R:5’-GCAAGCCCTCACGTAGCGAACAACAAAGCAACAGGTACATACG-3’ (SEQ ID NO:5)，sth-probe:5，-CGCGGTGAATTGTGTTGTAATCCTGCTTGTACCGCG-3’ (SEQ ID NO:6)；針對It基因的引物和探針:lt-F:5’-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAACAGGAGGTTTCTGCGTTAG-3’ (SEQ ID NO:7)，lt-R:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGGTGGGAAACCTGCTAATCT-3，(SEQ ID NO:8)，lt-probe:5，-CGCCGGTATTACAGAAATCTGAATATAGCTCCGGCG-3’ (SEQ ID NO:9)；針對aggR基因的引物和探針:aggR-F:5， -GCAAGCCCTCACGTAGCGAATGCAAAAGAAGAAATCAACAGT-3， (SEQ IDNO:10),aggR-R:5， -GCAAGCCCTCACGTAGCGAACAGAATCGTCAGCATCAGCTAC-3， (SEQ IDNO:11),aggR-probe:5’-CGGACAAAAGTAGATGCTTGCAGTTGTCCG-3’ (SEQ ID NO: 12)；針對eaeA基因的引物和探針:eaeA-F:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGTAACCAGGCTTCGTCACA-3’ (SEQ ID NO: 13)，eaeA-R:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGGAAAAAACGCTGACCCG-3’ (SEQ ID NO: 14)，eaeA-probe:5，-CCCAGTGGTAATAACTTTGACGGTAGTTCACTGGG-3，(SEQ ID NO: 15)；
針對escV基因的引物和探針:escV-F:5’ -GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGGCTCTCTTCTTCTTTATGGCTG-3’ (SEQ IDNO:16)，escV-R:5’ -GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGGGAAAGAAGTTAGTTCAAGAGGAT-3’ (SEQ IDNO:17)，escV-probe:5，-CCCGCGCAACAGTTGTGGTGGATATCATTATCGCGGG-3， (SEQ ID NO:18)；針對stxl基因的引物和探針:stxl-F:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAASAGCGGTTACATTGTCTGGT-3，(SEQ ID NO:19)，stxl-R:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAACTGCGTCAGTGAGGTTCCA-3’ (SEQ ID NO:20)，stxl-probe:5，-CCGCGTACGGGGATGCAGATAAATCGCGG-3，(SEQ ID NO:21)；針對stx2基因的引物和探針: stx2-F: 5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAACATGACAACGGACAGCAGTTA-3，(SEQ ID NO:22)，stx2-R:5’ -GCAAGCCCTCACGTAGCGAATCTGGTCATTGTATTACCACTGAA-3’ (SEQ IDNO:23)，stx2-probe:5，-CCGCCACTCACTGGTTTCATCATATCTGGCGG-3’ (SEQ ID NO:24)；
針對ipaH基因的引物和探針:ipaH-F:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGAAAACCCTCCTGGTCCATC-3’ (SEQ ID NO:25)，ipaH-R:5， -GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGTCTGGAAGGCCAGGTAGACTT-3， (SEQ IDNO:26)，ipaH-probe:5，-CCCGGCTGGAGGACATTGCCCGGG-3’ (SEQ ID NO:27)；以及Homo-tag:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAA-3，(SEQ ID NO:28)，其中上述探針序列SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 12、SEQID NO: 15,SEQ ID NO: 18,SEQ ID N0:21、SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:27 的 5’ 端連接有熒光
基團，3’端連接有淬滅基團。具體地，連接至探針5’端的熒光基團可發出熒光信號，連接至探針3’端的淬滅基團可以抑制熒光基團發出的熒光信號，在熒光定量PCR反應過程中，淬滅基團與熒光基團分離，熒光基團可以發出熒光信號，通過檢測熒光信號的積累可以對未知模板進行定量分析。其中，上述連接于5’端的熒光基團可以為FAM、HEX、R0X或Cy5，上述連接于3’端的淬滅基團可以為DABCYL或BHQ，優選為DABCYL。具體地，在本發明實施例的檢測試劑盒中，上述9組引物和探針分裝至兩個反應管體系中，其中第一反應管體系中包含針對Stp，sth, It, aggR四種基因的引物和探針，gpSEQ ID NOil-SEQ ID NO: 12，該反應管體系用于腸產毒性大腸桿菌(ETEC)和腸粘附性大腸桿菌(EAEC)的檢測分型，且其中四種探針序列SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:6、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 12的5’端的熒光基團分別為FAM、HEX、ROX和Cy5 ;第二反應管體系包含針對eaeA、escV、stxl、stx2 和 ipaH 五種基因的引物和探針，即 SEQ ID N0:13_SEQ ID N0:27,用于腸侵襲性大腸桿菌(EIEC)、腸致病性大腸桿菌(EPEC)和腸出血性大腸桿菌(EHEC)的檢測分型，其中五種探針序列 SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 18,SEQ ID N0:21、SEQ ID NO:24,SEQ ID N0:27的5’端的熒光基團選自FAM、HEX、R0X和Cy5，其中有兩條探針使用同一種熒光基團，另外三條對應于其他三種熒光基團。通過上述組合，使得兩種反應管體系分別構成四重反應體系和五重反應體系，即第一反應管體系中包括四組引物探針，第二反應管體系中包括五組引物探針，分成兩個反應管體系使得檢測結果更易識別，減少了相互干擾，提高了檢測準確度。更具體地，上述第一反應管體系的引物和探針所針對的基因中，stp，sth, It用于檢測ETEC，aggR用于檢測EAEC ;在上述第二反應管體系的引物和探針所針對的基因中，eaeA和escV用于檢測EPEC和EHEC，同時stxl和stx2用于檢測EHEC，由此結合上述EPEC和EHEC的檢測結果可對EPEC和EHEC進行檢測分型，而ipaH用于檢測EIEC。具體地，本發明的致瀉性大腸桿菌檢測試劑盒的兩個反應管體系中都包括Homo-tag 序列(SEQ ID NO: 28),該 Home-tag 序列與上述 stp, sth, It, aggR, eaeA, escV,stxl,stx2和ipaH九種基因的各對引物(即加尾引物)的標簽部分序列相同。該Homo-tag序列系統可有效地抑制引物二聚體的產生，減小多重PCR體系中各基因間擴增效率的差異，提高定量的精確度。具體地，本發明實施例的致瀉性大腸桿菌檢測試劑盒的第一和第二反應管體系中均包含PCR反應緩沖液、MgCl2, dNTP、DNA聚合酶，其中MgCl2的工作濃度為2-4mmol，優選為3mmol ；dNTP的濃度為0.1-0.3mmol，優選為0.2mmol ；DNA聚合酶濃度為0.8-1.2U，優選為IU0在本發明實施例中使用的DNA聚合酶可使用任何適用于熒光定量PCR反應的DNA聚合酶，優選為rTaq酶。在本發明實施例的致瀉性大腸桿菌檢測試劑盒中，第一反應管體系中各對引物，即 SEQ ID NO:1 與SEQ ID NO:2,SEQ ID N0:4與SEQ ID NO:5,SEQ ID N0:7與SEQ ID N0:8、SEQ ID NO: 10與SEQ ID NO: 11的工作濃度范圍均優選為0.2-0.3 μ mol，各條探針，即SEQID NO:3,SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:9和SEQ ID NO: 12 的濃度范圍均優選為0.2-0.25 μ mol。
在本發明實施例的致瀉性大腸桿菌檢測試劑盒中，第二反應管體系中各對引物，即 SEQ ID NO: 13 與 SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16 與 SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19 與 SEQID NO:20、SEQ ID NO:22 與 SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25 與 SEQ ID NO:26 的濃度范圍均優選為 0.3-0.5 μ mol，各條探針，即 SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 21、SEQ IDN0:24和SEQ ID NO:27的濃度范圍均優選為0.2-0.24 μ mol。在本發明實施例的致瀉性大腸桿菌檢測試劑盒中，第一和第二反應管體系中均包含Home-tag序列，該Home-tag序列濃度優選為0.5-1.0 μ mol,更優選為0.5 μ mol。本發明實施例還提供一種致瀉性大腸桿菌檢測和分型方法，該檢測和分型方法利用本發明的致瀉性大腸桿菌檢測試劑盒進行，該方法包括以下步驟:SOl獲得樣品并進行提取核酸處理，然后加入至本發明的致瀉性大腸桿菌檢測試劑盒中；S02在熒光PCR儀上進行熒光定量PCR反應；S03獲得檢測結果并進行分析。具體地，本發明實施例的致瀉性大腸桿菌檢測和分型方法可使用25μ L反應體系或其他體積的反應體系進行檢測和分型。其中，對于25 μ LPCR反應體系，模板(即待檢測樣品)加入量為5 μ L，對于其他體積的PCR反應體系，可對模板加入量進行等比例調節。
具體地，對于上述步驟S01，其中所述樣品不限于任何檢測樣品，只要能對其中的核酸進行提取即可進行檢測及分型。且其中提取核酸可以采用水煮法使菌體破裂而獲得DNA，但不限于此。在步驟S02中，PCR反應程序為:95°C 預變性 3min ；95°C變性 10s，58°C退火 20s，72°C延伸 15s，共 5 個循環；95°C變性 10s，55°C退火 20s，72°C延伸 15s，共 40 個循環。在步驟S03中，對熒光定量PCR反應體系的熒光強度進行測量分析，以達到設定的閾值時所需的循環次數Ct值作為結果判斷的標準，其中O < Ct < 35為陽性，Ct ^ 38或為O時判斷為陰性，Ct值在35至38之間時，在35 < Ct < 38且有明顯指數擴增判斷為陽性，否則為陰性。本發明實施例的熒光定量PCR檢測和分型方法可對待檢測樣本中的致瀉性大腸桿菌的存在進行檢測 并對其分型，利用該檢測及分型結果，還可廣泛用于臨床及實驗室中對于致瀉性大腸桿菌的分析和研究，還可用于對于食品等的致瀉性大腸桿菌的檢測，以防止食品污染，避免由此引起的腹瀉。本發明實施例的熒光定量PCR檢測和分型方法特異性好，靈敏度高，操作簡便，結果易于判讀。以下結合具體實施方式
對本發明的致瀉性大腸桿菌檢測試劑盒及檢測方法進行詳細闡述。實施例一致瀉性大腸桿菌檢測試劑盒的制備1.合成針對 stp, sth, It, aggR, eaeA, escV, stxl, stx2 和 ipaH 九種基因的引物和探針，即SEQ ID NOil-SEQ ID NO:27，其中各探針序列3’端均連接有DABCYL，各條探針序列對應的熒光基團如下:SEQ ID NO: 3 對應于 HEX，SEQ ID NO:6 對應于 FAM，SEQ ID NO:9 對應于 ROX，SEQID勵:12對應于〇丫5，SEQ ID NO: 15 對應于 Cy5，SEQ ID NO: 18 對應于 HEX，SEQ ID N0:21 對應于 R0X，SEQ ID NO: 24 對應于 ROX，SEQ ID NO: 27 對應于 FAM ；合成Homo-tag序列(SEQ ID NO: 28),均制備成50 μ M濃度的儲存液；2.分別制備PCR緩沖液，MgCl2溶液，dNTP溶液，rTaq酶溶液；3.取PCR反應八聯管，向其中加入PCR緩沖液，MgCl2溶液，dNTP溶液，rTaq酶溶液，使其在25 μ L體系中符合以下最終濃度要求:MgCl2 3mmoldNTP 0.2mmolrTaq 酶 IU，并向其中分別加入0.25 μ L的Homo_tag(50 μ Μ),該Homo-tag在25 μ L反應體系中最終濃度為0.5 μ mol ；4.將步驟3獲得的八聯管分成兩組:A組和B組，其中A組中加入針對stp，sth,lt，aggR四種基因的引物和探針，即SEQ ID N0:1-SEQ ID NO: 12，其中各對引物，即SEQID NO:1 與 SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO:4 與 SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7 與 SEQ ID NO:8、SEQ ID NO: 10與SEQ ID NO: 11在25 μ I體系中的最終濃度均為0.3 μ mol，各條探針，SPSEQ ID NO: 3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO: 12 在 25 μ I 體系中的最終濃度均為0.2 μ mol ；向B組中加入針對eaeA、escV、stxl、stx2和ipaH五種基因的引物和探針，即 SEQ ID N0:13-SEQ ID NO: 27，其中各對引物，即 SEQ ID NO: 13 與 SEQ ID NO: 14,SEQ IDNO:16 與 SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19 與 SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22 與 SEQ ID NO:23、SEQ ID NO: 25與SEQ ID NO: 26在25 μ I體系中的最終濃度均為0.5 μ mol，各條探針，SPSEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24 和 SEQ ID N0:27 在 25μ1 體系中的最終濃度均為0.2 μ mol ；5.向上述步驟4中獲得的A組管和B組管中分別加入去離子水使反應混合物體積為 20 μ I ;6.組裝制得致瀉性大腸桿菌檢測試劑盒。實施例二1.合成針對 stp, sth, It, aggR, eaeA, escV, stxl, stx2 和 ipaH 九種基因的引物和探針，即SEQ ID NOil-SEQ ID NO: 27，其中各探針序列3’端均連接有BHQ，各條探針序列對應的熒光基團如下:SEQ ID NO:3 對應于 FAM，SEQ ID NO:6 對應于 ROX，SEQ ID NO:9 對應于 Cy5，SEQID NO: 12 對應于 HEX，SEQ ID NO: 15 對應于 FAM，SEQ ID NO: 18 對應于 FAM，SEQ ID NO: 21 對應于 Cy5，SEQ ID NO: 24 對應于 HEX，SEQ ID NO: 27 對應于 ROX ；合成Homo-tag序列(SEQ ID NO: 28)，均制備成50 μ M濃度的儲存液；2.分別制備PC R緩沖液，MgCl2溶液，dNTP溶液，rTaq酶溶液；3.取PCR反應八聯管，向其中加入PCR緩沖液，MgCl2溶液，dNTP溶液，rTaq酶溶液，使其在25 μ L體系中符合以下最終濃度要求:MgCl2 2mmo1dNTP 0.3mmolrTaq 酶 1.2U,并向其中分別加入0.3μ L的Homo-tag (50 μ M)，該Homo-tag在25 μ L反應體系中最終濃度為0.6 μ mol ；4.將步驟3獲得的八聯管分成兩組:A組和B組，其中A組中加入針對stp，sth,lt，aggR四種基因的引物和探針，即SEQ ID N0:1-SEQ ID NO: 12，其中各對引物，即SEQID NO:1 與 SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO:4 與 SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7 與 SEQ ID NO:8、SEQ ID NO: 10與SEQ ID NO: 11在25 μ I體系中的最終濃度均為0.2 μ mol，各條探針，SPSEQ ID NO: 3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO: 12 在 25 μ I 體系中的最終濃度均為0.25 μ mol ;向B組中加入針對eaeA、escV、stxl、stx2和ipaH五種基因的引物和探針，即 SEQ ID N0:13-SEQ ID NO: 27，其中各對引物，即 SEQ ID NO: 13 與 SEQ ID NO: 14,SEQ IDNO:16 與 SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19 與 SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22 與 SEQ ID NO:23、SEQ ID N0:25與SEQ ID N0:26在25 μ I體系中的最終濃度均為0.3 μ mol，各條探針，SPSEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24 和 SEQ ID N0:27 在 25μ1 體系中的最終濃度均為0.24 μ mol ；5.向上述步驟4中獲得的A組管和B組管中分別加入去離子水使反應混合物體積為 20 μ I ;
6.組裝制得致瀉性大腸桿菌檢測試劑盒。實施例三特異性分析獲得204株涉及腸桿菌、球菌、弧菌等細菌，利用實施例一的檢測試劑盒進行特異性實驗并以陽性菌株作為對照，檢測菌株的情況見表1，其中檢測結果均為陰性。表I特異性分析結果
權利要求
1.一種致瀉性大腸桿菌檢測試劑盒，包括PCR反應緩沖液、MgCl2、dNTP、DNA聚合酶，其特征在于，還包括以下9組引物和探針: 針對stp基因的引物對SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2以及探針SEQ ID N0:3, 針對sth基因的引物對SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:5以及探針SEQ ID N0:6, 針對It基因的引物對SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8以及探針SEQ ID N0:9, 針對aggR基因的引物對SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 11以及探針SEQ ID NO: 12, 針對eaeA基因的引物對SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14以及探針SEQ ID NO: 15, 針對escV基因的引物對SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 17以及探針SEQ ID NO: 18, 針對stxl基因的引物對SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO:20以及探針SEQ ID NO:21, 針對stx2基因的引物對SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23以及探針SEQ ID NO:24, 針對ipaH基因的引物對S EQ ID NO:25和SEQ ID NO:26以及探針SEQ ID NO:27, 其中各條所述探針5’端連接有熒光基團，3’端連接有淬滅基團； 該檢測試劑盒還包括序列為SEQ ID NO:28的Homo-tag。
2.如權利要求1所述的致瀉性大腸桿菌檢測試劑盒，其特征在于，所述9組引物和探針分裝至兩個反應管體系中，使 SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 12 與 SEQ ID N0:13_SEQ ID NO: 27分隔開。
3.如權利要求1所述的致瀉性大腸桿菌檢測試劑盒，其特征在于，所述DNA聚合酶為rTaq 酶。
4.如權利要求1所述的致瀉性大腸桿菌檢測試劑盒，其特征在于，所述MgCl2的工作濃度為2-4mmol，所述dNTP的工作濃度為0.1-0.3mmol，所述DNA聚合酶工作濃度為0.8-1.2U。
5.如權利要求1所述的致瀉性大腸桿菌檢測試劑盒，其特征在于，所述引物序列SEQID NO: 1、SEQ ID N0:2、SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ IDNO: 10和SEQ ID NO: 11的工作濃度范圍為0.2-0.3 μ mol，所述探針序列SEQ ID N0:3、SEQ ID NO:6, SEQ ID N0:9 和 SEQ ID NO: 12 的工作濃度范圍為 0.2-0.25 μ mol ;所述引物序列 SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ IDNO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID N0:25 和 SEQ ID NO:26 的工作濃度范圍為0.3-0.5 μ mol，所述探針序列 SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 24和SEQ ID NO: 27的工作濃度范圍為0.2-0.24 μ mol。
6.如權利要求1所述的致瀉性大腸桿菌檢測試劑盒，其特征在于，所述Home-tag序列工作濃度為0.5-1.0 μ mol。
7.如權利要求1所述的致瀉性大腸桿菌檢測試劑盒，其特征在于，所述熒光基團選自FAM、HEX、ROX和Cy5，所述淬滅基團選自DABCYL和BHQ。
8.一種致瀉性大腸桿菌檢測和分型方法，包括如下步驟: 獲得并處理樣品，加入至致瀉性大腸桿菌檢測試劑盒中， 進行熒光定量PCR反應， 獲得檢測結果， 其特征在于，所述熒光定量PCR反應利用如權利要求1-7中任一項所述的致瀉性大腸桿菌檢測試劑盒進行。
9.如權利要求8所述的致瀉性大腸桿菌檢測和分型方法，其特征在于，所述熒光定量PCR反應的反應程序為: 95°C預變性3min ； 95°C變性10s，58。。退火20s，72。。延伸15s，共5個循環； 95°C變性10s，55°C退火20s，72°C延伸15s，共40個循環。
10.如權利要求8所述的致瀉性大腸桿菌檢測和分型方法，其特征在于，所述獲得檢測結果步驟中判定結果的方式如下: O< Ct彡35為陽性， Ct彡38或為O時判斷為陰性， Ct值在35至38之間時，在35 < Ct < 38且有明顯指數擴增判斷為陽性，否則為陰性。
全文摘要
本發明適用于分子生物學及微生物檢測技術領域，提供一種致瀉性大腸桿菌檢測試劑盒及檢測和分型方法，該檢測試劑盒包括PCR緩沖液、MgCl2、dNTP、DNA聚合酶，還包括stp、sth、lt、aggR、eaeA、escV、stx1、stx2、ipaH基因的引物及探針SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:27，還包括序列為SEQ ID NO:28的Homo-tag。該檢測和分型方法包括以下步驟獲得并處理樣品，加入至檢測試劑盒中；進行熒光定量PCR反應；獲得檢測結果。本發明的檢測和分型方法特異性好，靈敏度高，操作簡便，結果易于判讀，適用于對致瀉性大腸桿菌的快速篩查和分型。
文檔編號C12Q1/10GK103215358SQ20131012354
公開日2013年7月24日 申請日期2013年4月10日 優先權日2013年4月10日
發明者扈慶華, 石曉路, 李迎慧, 林一曼, 邱亞群, 陳瓊城, 陳清涼, 姜伊祥 申請人:深圳市疾病預防控制中心