專利名稱：H7N9亞型流感病毒rRT-PCR檢測引物和探針及檢測流感病毒的方法及流感病毒標準品的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種rRT-PCR檢測技術及其標準品的制備，尤其涉及一種H7N9亞型流感病毒rRT-PCR檢測引物和探針及檢測流感病毒的方法及流感病毒標準品。
背景技術：
流感病毒基因組由8條(甲、乙型)或者7條(丙型)負鏈RNA節段構成。根據病毒的核蛋白(NP)和基質蛋白(M)不同分為甲型、乙型、丙型。其中A型流感病毒根據血凝素(HA)基因分為HA1-16亞型，根據神經氨酸酶基因(NA)分為NA1-9亞型。H7N9亞型流感病毒是A型流感病毒的一種，禽類是其天然宿主，亞洲、北美洲等地區多個國家的禽類養殖場中檢測到過H7N9禽流感病毒。動物實驗表明，H7N9亞型流感病毒能夠感染雪貂的上呼吸道和下呼吸道，提示其具有感染人的風險，目前尚無一種快速、靈敏的方法用于檢測H7N9亞型流感病毒及其重配變異株。
發明內容
本發明的目的是提供一種操作簡單、應用方便的H7N9亞型流感病毒rRT-PCR檢測引物和探針及檢測流感病毒的方法及流感病毒標準品。本發明的目的是通過以下技術方案實現的:
本發明的H7N9亞型流感病毒rRT-PCR檢測弓I物和探針，包括以下一種或多種弓I物和探針:H7N9亞型流感病毒HA基因特異性引物和探針、H7N9亞型流感病毒NA基因特異性引物和探針；所述H7N9亞型流感病毒HA基因特異性引物和探針針對H7N9亞型流感病毒HA基因相對保守區；所述H7N9亞型流感病毒NA基因特異性引物和探針針對H7N9亞型流感病毒NA基因相對保守區。本發明的應用上述的H7N9亞型流感病毒rRT-PCR檢測引物和探針檢測流感病毒的方法，包括步驟:首先，利用核酸提取試劑從待測樣本中提取流感病毒RNA ；然后，利用一步法或兩步法rRT-PCR試劑加入所述引物和探針進行核酸擴增；之后，根據Ct值判斷rRT-PCR檢測結果，判斷待檢樣本流感病毒是否陽性。本發明的流感病毒標準品，含有H7和N9亞型的全長基因，用于上述檢測流感病毒的方法的陽性對照品。由上述本發明提供的技術方案可以看出，本發明所述的H7N9亞型流感病毒rRT-PCR檢測引物和探針及檢測流感病毒的方法及流感病毒標準品，由于包括針對H7N9亞型流感病毒HA基因和NA基因相對保守區引物和探針，可以通過rRT-PCR法檢測H7N9亞型流感病毒及其變異株，操作簡單、應用方便。
具體實施例方式本發明的H7N9亞型流感病毒rRT-PCR (real-time RT-PCR)檢測引物和探針，其較佳的具體實施方式
是，包括以下一種或多種引物和探針:H7N9亞型流感病毒HA基因特異性引物和探針、H7N9亞型流感病毒NA基因特異性引物和探針；所述H7N9亞型流感病毒HA基因特異性引物和探針針對H7N9亞型流感病毒HA基因相對保守區；所述H7N9亞型流感病毒NA基因特異性引物和探針針對H7N9亞型流感病毒NA基因相對保守區。所述引物和探針包括長度為18 31bp的寡核苷酸片段。所述H7N9亞型流感病毒HA基因特異性引物和探針包括以下兩套引物/探針組合，共計四條引物序列和二條探針序列:第一套:弓丨物序列:5’ AGAGATGAAATGGCTCCTGTCAA3，、5，GGTCTTTCCTTGTATTTTTGTATGACTTAG3，；探針序列:5’FAM-AGATAATGCTGCATTCCCGCAGATG-BHQ1-3’ ；第二套:引物序列:5’TCTCGGTCAATGTGGACTTCTG3’、5’ TTAAATCGGCTGAAAATTCTAGGAA3’ ；探針序列:5’FAM-ATCACTGGACCACCCCAATGTGACCA-BHQ1-3’ ；所述H7N9亞型流感病毒NA基因特異性引物和探針包括以下二條引物序列和一條探針序列:弓丨物序列:5，TGGCAATGACACACACTAGTCAGT3，、5，ATTACCTGGATAAGGGTCGTTACACT3，；探針序列:5，FAM-AGACAATCCCCGACCGAATGACCC-BHQ1-3，。所述探針序列兩端的標記FAM、BHQl為熒光素標記。本發明的應用上述的H7N9亞型流感病毒rRT-PCR檢測引物和探針檢測流感病毒的方法，其較佳的具體實施方式
包括步驟:首先，利用核酸提取試劑從待測樣本中提取流感病毒RNA ；然后，利用一步法或兩步法rRT-PCR試劑加入所述引物和探針進行核酸擴增；之后，根據Ct值判斷rRT-PCR檢測結果，判斷待檢樣本流感病毒是否陽性。所述流感病毒包括以下一種或多種病毒:禽H7N9亞型流感病毒、內部基因變異的禽H7N9亞型流感病毒、人感染H7N9亞型流感病毒、人感染內部基因變異的H7N9亞型流感病毒。本發明的流感病毒標準品，其較佳的具體實施方式
是:含有H7和N9亞型的全長基因，用于上述的檢測流感病毒的方法的陽性對照品。進一步用于H7和N9的RNA體外轉錄和蛋白質體外合成。
本發明中的引物和探針序列(5’ 一3’)及其檢測的靶片段如下:
權利要求
1.一種H7N9亞型流感病毒rRT-PCR檢測引物和探針，其特征在于，包括以下一種或多種引物和探針: H7N9亞型流感病毒HA基因特異性引物和探針、H7N9亞型流感病毒NA基因特異性引物和探針； 所述H7N9亞型流感病毒HA基因特異性引物和探針針對H7N9亞型流感病毒HA基因相對保守區； 所述H7N9亞型流感病毒NA基因特異性引物和探針針對H7N9亞型流感病毒NA基因相對保守區。
2.根據權利要求1所述的H7N9亞型流感病毒rRT-PCR檢測引物和探針，其特征在于，所述引物和探針包括長度為18 31bp的寡核苷酸片段。
3.根據權利要求2所述的流感病毒rRT-PCR檢測引物和探針，其特征在于: 所述H7N9亞型流感病毒HA基因 特異性引物和探針包括以下兩套引物/探針組合，共計四條引物序列和二條探針序列: 第一套:引物序列:5’ AGAGATGAAATGGCTCCTGTCAA3’、5’ GGTCTTTCCTTGTATTTTTGTATGACTTAG3’ ； 探針序列:5’ FAM-AGATAATGCTGCATTCCCGCAGATG-BHQ1-3’ ； 第二套:引物序列:5’ TCTCGGTCAATGTGGACTTCTG3’、5’ TTAAATCGGCTGAAAATTCTAGGAA3’ ； 探針序列:5’ FAM-ATCACTGGACCACCCCAATGTGACCA-BHQ1-3’ ； 所述H7N9亞型流感病毒NA基因特異性引物和探針包括以下二條引物序列和一條探針序列:引物序列:5’ TGGCAATGACACACACTAGTCAGT3’、5’ ATTACCTGGATAAGGGTCGTTACACT3’ ； 探針序列:5’ FAM-AGACAATCCCCGACCGAATGACCC-BHQ1-3’。
4.根據權利要求3所述的流感病毒rRT-PCR檢測引物和探針，其特征在于，所述探針序列兩端的標記FAM、BHQl為突光素標記。
5.一種應用權利要求1至4中任一項所述的流感病毒rRT-PCR檢測引物和探針檢測流感病毒的方法，其特征在于，包括步驟: 首先，利用核酸提取試劑從待測樣本中提取流感病毒RNA ； 然后，利用一步法或兩步法rRT-PCR試劑加入所述引物和探針進行核酸擴增； 之后，根據Ct值判斷rRT-PCR檢測結果，判斷待檢樣本流感病毒是否陽性。
6.根據權利要求5所述的檢測流感病毒的方法，其特征在于，所述流感病毒包括以下一種或多種病毒: 禽H7N9亞型流感病毒、內部基因變異的禽H7N9亞型流感病毒、人感染H7N9亞型流感病毒、人感染內部基因變異的H7N9亞型流感病毒。
7.一種H7N9亞型流感病毒標準品，其特征在于，含有H7和N9亞型的全長基因，用于權利要求5或6所述的檢測流感病毒的方法的陽性對照品。
8.根據權利要求7所述的H7N9亞型流感病毒標準品，其特征在于，進一步用于H7和N9的RNA體外轉錄和蛋白質體外合成。
全文摘要
本發明公開了一種流感病毒rRT-PCR(real-time RT-PCR)檢測引物和探針及檢測流感病毒的方法及H7N9亞型流感病毒標準品，包括H7N9亞型流感病毒特異性引物和探針3種共9條寡核苷酸引物和探針序列，同時包括待檢樣本的處理、rRT-PCR反應體系及反應條件、結果分析。能快速有效的甄別人和動物中的H7N9亞型流感病毒。操作簡單、應用方便，為臨床診斷、檢驗檢疫等領域的流感疫情早期預警機制提供了可行的技術支持。
文檔編號C12Q1/68GK103160617SQ20131012244
公開日2013年6月19日 申請日期2013年4月10日 優先權日2013年4月10日
發明者舒躍龍, 趙翔, 王大燕, 高榮保, 李曉丹 申請人:中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所