專利名稱：一種菊花分枝性狀關聯分子標記的獲得方法
技術領域：
本發明公開了一種菊花分枝性狀關聯分子標記的獲得方法，屬于生物技術領域，用于菊花分枝性狀優良基因的定位和克隆及菊花新品種的培育。
背景技術：
菊花是我國十大傳統名優和世界四大切花之一，在花卉生產和園林綠化中占有重要地位。近年來，關于菊花株型、花器等觀賞性狀遺傳研究較多，在一定程度上推動了菊花雜交育種進程。但隨著育種工作的不斷深入，傳統的雜交育種方法因耗時較長，且無法定向改良特定性狀，在育種中存在一定局限性。分子標記輔助選擇育種為菊花育種工作提供了新的研究思路。隨著分子標記技術的發展，連鎖遺傳圖譜構建與數量性狀基因定位(quantitative trait loci, QTL)研究已經在月季、杜胃$、百合、康乃馨等許多觀賞植物中陸續展開。目前，關于菊花觀賞性狀相關的分子標記位點也有相關報道，但是菊花分枝性狀關聯分子標記的獲得方法尚未見報道。切花的品質主要由花型、花期和株型等性狀決定，而分枝性狀是菊花觀賞性狀——株型的重要構成因素，也是菊花品種改良的主要目標性狀之一。進一步理解切花菊分枝性狀的遺傳機制，并獲得控制分枝性狀的主效QTL，可為菊花分枝性狀的分子標記輔助育種創造條件。本發明將獲得的與菊花分枝性狀相關聯的分子標記，為菊花新品種選育、分枝性狀相關基因的精確定位和克隆奠定了理論基礎。參考文獻:Abe H，N akano M，Nakatsuka A，et al.Genetic analysis of floral anthocyaninpigmentation traits in Asiatic hybrid lily using molecular linkage maps[J].Theor Appl Genet，2002，105:1175 - 1182.
Crespel L，Chirollet M，Durel C，et al.Mapping of qualitative andquantitative phenotypic traits in Rosa using AFLP markers[J].Theor ApplGenet,2002，105:1207 - 1214.
Dunemann F，Kahnau R，Stange 1.Analysis of complex leaf and flowercharacters in Rhododendron using a molecular linkage map[J].Theor ApplGenet, 1999,98:1146 - 1155.
Debener T，Mattiesch L.Construction of a genetic linkage map for rosesusing RAPD and AFLP markers[J].Theor Appl Genet,1999,99:891 - 899.
Jeuken MJWj Pelgrom K，Stam Pj Lindhout P.Efficient QTL detectionfor nonhost resistance in wild lettuce:backcross inbred lines versusF2population[J].Theor Appl Genet, 2008.116 (6):854 - 857.
Murray Mj Thompson WF.Rapid isolation of high molecular weight plantDNA[J].Nucleic Acids Res, 1980,8:4321 - 4325.
Oyant LHS, Crespel L, Rajapakse S，et al.Genetic linkage maps of roseconstructed with new microsatellite markers and locating QTL controllingflowering traits[J].Tree Genetic&Genomes, 2008, 4:11 - 23.
Zhang F, Chen S M, Chen F D, Fang W M, Chen Y, Li F T.2011.SRAP - basedmapping and QTLs detection for inflorescence - related traits in chrysanthemum(Dendranthema morifolium).Molecular Breeding, 27(I):11 - 23.
陳發棣，蔣甲福，郭維明.2003.小菊花器若干性狀在F1代的表現[J].園藝學報，30 (2):175-182.
韓龍植，喬永利，張三元，等.不同生長環境下水道主要農藝性狀的QTL分析[J].中國農業科學，2005，38 (6): 1080 - 1087.
高麗霞，劉念，黃邦海.姜花屬SRAP分子標記連鎖圖譜構建[J].2009，31:317 - 325.
洪波，史春鳳，張曉嬌，高俊平.2009.菊花觀賞性狀和農藝性狀基因工程改良研究進展[J].中國農業科學，42 (4): 1348-1358.
黃中文，趙團結，喻德躍，等.大豆產量有關性狀QTL的檢測[J].中國農業科學，2009，42(12):4155-4165.
蔣甲福，陳發棣，郭維明.2003.小菊雜種一代部分性狀的遺傳與變異[J].南京農業大學學報，26 (2): 11-15.
李鴻漸.1993.中國菊花.南京:江蘇科學技術出版社.
李辛雷，陳發棣.2004.菊花種質資源與遺傳改良研究進展[J].植物學通報，21 (4):392-401.
李媛媛，沈金雄，王同華，等.利用SRAP、SSR和AFLP標記構建甘藍型油菜遺傳連鎖圖譜[J].中國農業科學，2007，40 (6):1118 - 1126.
張志明，趙茂俊，榮廷昭，等.玉米SSR連鎖圖譜構建與株高及穗位高QTL定位[J].作物學報，2007, 33 (2): 341 - 344.
發明內容
針對目前菊花分枝性狀優質基因的精確定位和克隆的研究在國內外幾乎空白這一現狀，本發明的目的是:篩選出一個或多個與菊花分枝性狀基因緊密關聯的分子標記，建立菊花分枝性狀分子標記輔助選擇體系，從而提高菊花優良分枝性狀的選擇效率，為菊花新品種選育奠定基礎。本發明的目的可以通過以下技術方案實現:一種菊花分枝性狀關聯分子標記的獲得方法，包括以下步驟:a試驗材料及其表型數據的獲得:供試材料為保存于南京農業大學“中國菊花種質資源保存中心”的菊花品種。第一年選擇分枝性狀差異明顯的兩個菊花品種進行人工雜交，獲得F1雜交種子，次年3月初經穴盤點播，連同親本扦插苗于4月中下旬單株標號后定植于“中國菊花種質資源保存中心”，常規管理同大田。分別于第二年和第三年秋季初花期調查親本和F1群體植株的分枝性狀，單株重復3次，并計算兩年性狀調查的平均值。利用Microsoft Excel2007軟件和SPSS15.0軟件對分枝性狀在兩個年份的表型數據分別進行基本描述性統計分析。b菊花連鎖圖譜構建:I)采用CTAB微量法提取親本及其F1雜交后代基因組DNA ；2)利用雜交親本對SRAP和SSR引物組合進行多態性篩選，將篩選出的多態性引物組合用于作圖群體的多態性擴增并統計擴增后的多態性條帶數據；對于共顯性標記，根據多態性標記電泳圖像譜帶，用a、b分別表示親本的帶型，用h表示雜合帶型，用u表示數據缺失。對于顯性標記，若母本有帶，父本無帶，則有帶記為d，無帶記為b ;若父本有帶，母本無帶，則有帶記為C，無帶記為a，用u表示數據缺失。以引物名稱作為多態性位點的名稱，如果同一個引物擴增出多個多態性位點，則在引物或引物組合名稱后按照分子量從大到小為序標注阿拉伯數字作為后綴以示區別。實驗用的Lambda DNA,Taq DNA 聚合酶、dNTPs 以及 IOObp DNA marker (100、300、500、700、1000、1500、2000bp)購自寶生物工程(大連)有限公司，SRAP和EST - SSR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
SRAP -PCR反應體系與反應程序:SRAP -PCR反應混合液總體積為10 μ 1，其中包括10XPCR buffer, 3mM Mg2+，200 μ M dNTP，0.5U Taq DNA 聚合酶，10 μ M SRAP 引物和 25ng 模板 DNA0 SRAP - PCR 反應程序:預變性 94°C /5min ;變性 94°C /lmin，退火復性 35°C /lmin,延伸 720C /lmin, 5 個循環；變性 94°C /lmin,退火復性 50°C /lmin,延伸 72°C /lmin, 35 個循環；延伸72°C /7min ;結束反應，10°C保存。SRAP -PCR產物采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染后拍照保存。SSR - PCR反應體系與反應程序:SSR - PCR反應混合液總體積為25 μ 1，其中包括 2.5μ 110 X PCR buffer, 1.5 μ 125 μ M Mg2+，2 μ 12.5mM dNTP，0.5U Taq DNA聚合酶，SSR引物各2μ 1，模板DNA50ng。SSR-PCR反應程序:擴增條件:94°C預變性3min ；94°C變性40s，56°C退火30s，72°C延伸50s，35個循環；72°C延伸5min，4°C保存擴增產物經6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。3)運用JoinMap4.0軟件，選用‘CP作圖模型’設置LOD為4.0，分別對雙親的分離位點進行連鎖分析，獲得雙親的分子標記連鎖群，再用Mapchart2.2軟件繪制連鎖圖。c菊花分枝性狀的QTL定位:基于步驟b已經構建的分子遺傳圖譜并結合步驟a得到的表型數據，運用Win QTL Cartographer v2.5軟件及復合區間作圖法進行菊花分枝性狀QTL分析，并估算各QTL的加性效應及其對表型變異的貢獻率等遺傳參數。相關運行參數如下:ffalk speed=2cM ；ffindow size=10.00 ;Model=6。取 LOD 閾值為 2.5,當 LOD 峰值大于2.5時即可確定該處存在一個顯著QTL位點，置信區間根據LOD值的峰值兩側各下降I個LOD值來確定。QTL命名基本遵照McCouch等(1997)方法并稍作改動:性狀英文縮寫名稱(首字母大寫)+環境(El，E2) +連鎖群的序號。例如，“PbnElQl”表示利用2011年(El)表型數據在連鎖群Ql上檢測到的關于一級分枝數(Pbn)的數量性狀基因位點。d菊花分枝性狀關聯分子標記的確定:根據步驟c所得的主效QTL所在的標記區間即可確定與菊花分枝性狀緊密關聯的分子標記。根據步驟c所得的主效QTL所在的標記區間確定的與菊花分枝性狀緊密關聯的分子標記為:與一級分枝數緊密關聯的分子標記為PbnElM，其對應的引物對為SSR338和SSR63，引物對 SSR338 序列為:SEQ ID N0.1/SEQ ID N0.2，引物對 SSR63 序列為:SEQ IDN0.3/SEQ ID N0.4 ;同一級分枝數，分枝高度關聯分子標記為Bh E1N11，其對應的引物對為SSR185 和 Me3Eml5，引物對 SSR185 序列為:SEQ ID N0.5/SEQ ID N0.6，引物對 Me3Eml5 序列為:SEQ ID N0.7/SEQ ID N0.8 ;與一級分枝長度關聯的分子標記為PWE1N15，其對應的引物對為SSR341、Me4Em3、Me3Em8、Me20Em4和Me21Em5中的任意一對，引物對SSR341序列為 SEQ ID N0.9/SEQ ID N0.10，引物對 Me4Em3 序列為 SEQ ID N0.11/SEQ ID N0.12，引物對 Me3Em8 序列為 SEQ ID N0.7/SEQ ID N0.13，引物對 Me20Em4 序列為 SEQ ID N0.14/SEQID N0.15，引物對 Me21Em5 序列為 SEQ ID N0.16/SEQ ID N0.17。有益效果本發明選用的是以‘QX - 145’ (P1)為母本、‘南農銀山’為父本(P2)雜交獲得的92株F1分離群體為試材，利用SRAP和SSR分子標記構建了雙親的分子遺傳連鎖圖譜，獲得菊花分枝性狀的主效QTL及與其緊密關聯的分子標記。與目前技術相比，其優點是:(I) SSR標記為共顯性標記，多態性好，重復性聞，覆蓋整個基因組，具有多等位基因的特性，是構建遺傳連鎖圖譜較理想的分子標記。SRAP標記的正反引物分別針對基因組的內含子和外顯子區域設計，與SSR標記的擴增區域互補，可以作為SSR標記補充標記，有效地增加圖譜的密度和基因組覆蓋率，其多態性和效價比(產生多態性的效率/成本)都很聞。(2)分子標記輔助育種，克服菊花分枝性狀優良基因型鑒定的困難。選擇范圍更廣，強度更大。菊花的常規選育方法周期長，費時又費力。通過本發明構建了菊花的遺傳連鎖圖譜，為菊花觀賞性狀的QTL定位奠定了基礎；菊花分枝性狀關聯分子標記的獲得可以實現優良品種提早選擇，減少工作量，大大提高菊花新基因型的選擇效率，從而加快育種進程。
圖1基于SRAP和SSR測交標記位點的菊花品種‘QX - 145’的連鎖遺傳圖譜圖2基于SRAP和SSR測交標記位點的菊花品種‘南農銀山’的連鎖遺傳圖譜圖3與菊花各分枝性狀顯著相關聯的QTL在遺傳圖上的分布
具體實施例方式實施例1(一)試驗材料及其表型數據的獲得供試材料為保存于南京農業大學“中國菊花種質資源保存中心”的切花菊品種‘QX - 145’和‘南農銀山’。兩品種的部分分枝性狀差異明顯。2010年秋，以‘QX - 145’為母本，‘南農銀山’為父本進行人工雜交。選取母本‘QX - 145’發育良好的花蕾，在舌狀花剛露色時去雄，用硫酸紙袋套袋，同時將父本‘南農銀山’的花序套袋。待母本柱頭伸出并開叉呈銳角和分泌黏液時，收集已套袋父本的新鮮花粉，用毛筆對母本進行授粉、套袋，次日重復授粉。當花梗變黃枯萎時采集授粉花序，脫粒，獲得92 SF1雜交種子，次年3月初經穴盤點播，連同親本扦插苗于4月中下旬單株標號后定植于“中國菊花種質資源保存中心”，常規管理同大田。 將92株F1實生苗以扦插的方式獲得無性系，分別于2011和2012年秋季初花期調查親本和F1群體植株的分枝性狀，包括一級分枝數、分枝高度和一級分枝長度3個性狀，單株重復3次，并計算兩年性狀調查的平均值。具體統計方法參照李鴻漸等的方法(《中國菊花》，1993)。利用Microsoft Excel2007軟件和SPSS15.0軟件對分枝性狀在兩個年份的表型數據分別進行基本描述性統計分析(見表I)。表I菊花‘QX-145’，‘南農銀山’及其F1群體的分枝性狀在2011 2012年度的
描述性數據
權利要求
1.一種菊花分枝性狀關聯分子標記的獲得方法，其特征在于包括以下步驟: a、試驗材料及其表型數據的獲得:第一年選擇分枝性狀差異明顯的兩個菊花品種進行人工雜交，獲得F1雜交種子，次年3月初經穴盤點播，連同親本扦插苗于4月中下旬單株標號后定植，常規管理同大田，分別于第二年和第三年秋季初花期調查親本和F1群體植株的分枝性狀,單株重復3次，并計算兩年性狀調查的平均值，利用Microsoft Excel2003軟件和SPSS15.0軟件對分枝性狀在兩個年份的表型數據分別進行基本描述性統計分析； b、菊花連鎖圖譜構建: 1)采用CTAB微量法提取親本及其F1雜交后代基因組DNA； 2)利用雜交親本對SRAP和SSR引物組合進行多態性篩選，將篩選出的多態性引物組合用于作圖群體的多態性擴增并統計擴增后的多態性條帶數據； 3)運用JoinMap4.0軟件，選用‘CP作圖模型’設置LOD為4.0，分別對雙親的分離位點進行連鎖分析，獲得雙親的分子標記連鎖群，再用Mapchart2.2軟件繪制連鎖圖； C、菊花分枝性狀 的QTL定位:結合表型數據和分子遺傳圖譜，運用Win QTLCartographer v2.5軟件及復合區間作圖法進行菊花分枝性狀的QTL分析,并估算遺傳參數，所述的遺傳參數包含各QTL的加性效應及其對表型變異的貢獻率。
d、菊花分枝性狀關聯分子標記的確定:根據步驟c所得的主效QTL所在的標記區間即可確定與菊花分枝性狀緊密關聯的分子標記。
2.根據權利要求1所述的一種菊花分枝性狀關聯分子標記的獲得方法，其特征在于步驟a中所述的所選擇的雜交親本之間的分枝性狀要存在足夠大的差異，這樣QTL位點才有可能在分離群體中被檢測到，這種選擇不僅局限在表型上的差異，更重要的是遺傳上的差巳
3.根據權利要求1所述的一種菊花分枝性狀關聯分子標記的獲得方法，其特征在于步驟b中所述的所采用的分子標記是顯性標記SRAP和共顯性標記SSR相結合。
4.根據權利要求1所述的一種菊花分枝性狀關聯分子標記的獲得方法，其特征在于步驟c中所述的主效QTL是多年重復出現并且貢獻率大于10%的QTL。
5.根據權利要求1所述的菊花分枝性狀關聯分子標記的獲得方法，其特征在于所述的統計擴增后的多態性條帶數據方法是:對于共顯性標記，根據多態性標記電泳圖像譜帶，用a、b分別表示親本的帶型，用h表示雜合帶型，用u表示數據缺失；對于顯性標記，若母本有帶，父本無帶，則有帶記為d,無帶記為b ;若父本有帶，母本無帶，則有帶記為c,無帶記為a,用u表示數據缺失；以引物名稱作為多態性位點的名稱，如果同一個引物擴增出多個多態性位點，則在引物或引物組合名稱后按照分子量從大到小為序標注阿拉伯數字作為后綴以示區別，根據多態性位點在父母本中的分離情況，加適當前綴以便作圖時參考:多態性位點只出現在雜交母本‘QX-145’中，則加前綴“Q”；多態性位點只出現在雜交父本‘南農銀山’中，加前綴“N”，對只存在于親本之一的多態性標記位點，按照1:1孟德爾分離比例在0.05顯著水平進行卡方檢驗。
6.根據權利要求1所述的菊花分枝性狀關聯分子標記的獲得方法，其特征在于所述的步驟菊花分枝性狀的QTL定位:基于步驟b已經構建的分子遺傳圖譜并結合步驟a得到的表型數據，運用Win QTL Cartographer v2.5軟件及復合區間作圖法進行菊花分枝性狀QTL分析，并估算各QTL的加性效應及其對表型變異的貢獻率等遺傳參數，相關運行參數如下:Walk speed=2cM, Window size=10.00，Model=6，取 LOD 閾值為 2.5，當 LOD 峰值大于 2.5 時即可確定該處存在一個顯著QTL位點，置信區間根據LOD值的峰值兩側各下降I個LOD值來確定，QTL命名方法為:性狀英文縮寫名稱(首字母大寫)+環境(E1，E2)+連鎖群的序號。
7.根據權利要求1所述的菊花分枝性狀關聯分子標記的獲得方法，其特征在于所述的選擇分枝性狀差異明顯的兩個菊花品種進行人工雜交:以‘QX-145’為母本、‘南農銀山’為父本雜交獲得的F1分離群體。
8.根據權利要求1所述的菊花分枝性狀關聯分子標記的獲得方法，其特征在于根據步驟c所得的主效QTL所在的標記區間確定的與菊花分枝性狀緊密關聯的分子標記為:與一級分枝數緊密關聯的分子標記為PbnElM，其對應的引物對為SSR338和SSR63，引物對 SSR338 序列為:SEQ ID N0.1/SEQ ID N0.2，引物對 SSR63 序列為:SEQ ID N0.3/SEQ IDN0.4 ;同一級分枝數，分枝高度關聯分子標記為Bh ElNlI，其對應的引物對為SSR185和Me3Eml5，引物對 SSR185 序列為:SEQ ID N0.5/SEQ ID N0.6，引物對 Me3Eml5 序列為:SEQID N0.7/SEQ ID N0.8 ;與一級分枝長度關聯的分子標記為PblElN15，其對應的引物對為SSR341、Me4Em3、Me3Em8、Me20Em4 和 Me21Em5 中的任意一對，引物對 SSR341 序列為 SEQ IDN0.9/SEQ ID N0.10，引物對 Me4Em3 序列為 SEQ ID N0.11/SEQ ID N0.12，引物對 Me3Em8 序列為 SEQ ID N0.7/SEQ ID N0.13，引物對Me20Em4 序列為 SEQ ID N0.14/SEQ ID N0.15，引物對 Me21Em5 序列 為 SEQ ID N0.16/SEQ ID N0.17。
全文摘要
本發明涉及一種菊花分枝性狀關聯分子標記的獲得方法，屬于生物技術領域，該方法包括以下幾個步驟a、試驗材料及其表型數據的獲得；b、菊花連鎖圖譜構建；c、結合表型數據和分子遺傳圖譜，進行菊花分枝性狀的QTL分析；d、菊花分枝性狀關聯分子標記的確定。本發明以‘QX‐145’(P1)為母本、‘南農銀山’為父本(P2)雜交獲得的92株F1分離群體為試材，獲得了多個與菊花分枝性狀顯著關聯的分子標記。菊花分枝性狀關聯分子標記的獲得，可用于菊花分枝性狀的優良基因的精細定位和克隆，大大提高選擇效率，從而加快育種進程。
文檔編號C12N15/10GK103232996SQ20131012131
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月9日 優先權日2013年4月9日
發明者陳發棣, 彭輝, 房偉民, 蔣甲福, 陳素梅, 管志勇, 廖園 申請人:南京農業大學