專利名稱：一種解淀粉芽孢桿菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種解淀粉芽孢桿菌YJOl及其在防治釀酒葡萄灰霉病、釀酒葡萄炭疽菌、釀酒葡萄白腐病，釀酒葡萄白粉病的應用，屬于生物技術領域。
背景技術：
近年來，食品安全問題頻發，農藥殘留和食品添加劑的添加是主要的原因。植物病害會造成植物的損失，而使用傳統手段防治會造成農藥殘留，環境污染，抗藥性等后果。而一些危險高毒農藥的禁用，促使著生物防治的發展。生物防治主要是利用有益菌與病原菌的營養競爭，或產生拮抗物質，或誘導抗病性或提高抗逆性來達到防治效果。與化學防治相比具有安全無毒的優點，現已成為各國的研究熱點。生物農藥指含非人工合成、具有殺蟲殺菌或抗病能力的的生物活性物質或生物制劑，包括生物殺蟲劑，殺菌劑，農用抗生素，生態農藥等。生物農藥具有選擇性強、對人畜安全、對環境影響小、改良潛力大等優點，能部分或完全替代化學農藥。生物農藥的研究和發展是我國大力支持的科研領域，也是提高食品安全的重要措施之一。釀酒葡萄上霉菌病害很多，如灰霉病，炭疽病，酸腐病，白腐病等等，造成的損失在30%以上。在釀酒葡萄上可使用的農藥很多，有波爾多液，百菌清，多菌寧，農利寧，碳特寧等多達幾十種。目前國內外生物農藥的研究雖然很多，但是真正應用的很少，因為成本問題或者效果問題。從保護生態環境和食品安全的角度出發，釀酒葡萄種植需要有低毒、污染少，對人體安全的微生物制劑來控制釀酒葡萄真菌病害，以達到安全食用的目的。也符合生物農業發展和政府、社會與生物農藥產業的發展。本發明從釀酒葡萄園中分離得到解淀粉芽孢桿菌抑菌YJ01，其產生的主要成分iturin主要作用于病原菌細胞膜的磷脂雙分子層，改變細胞膜通透性和功能性，從而抑制病原微生物的生長。由于其特殊的化學組成和兩親型分子結構，抑菌脂肽對其抑制菌是非特定作用，不會引起抗性，·非常適合開發成抑菌劑。而且動物和人體臨床試驗表明，iturin低毒、低致敏性。另一種主要成分surfactin具有良好的表面活性,和iturin —起作用能夠提高抑菌效果。
發明內容
本發明的目的在于提供一種對釀酒釀酒葡萄真菌具有拮抗作用的解淀粉芽孢桿菌，以及該解芽孢桿菌在防治釀酒釀酒葡萄真菌病害中的應用。本發明是通過以下技術方案實現的:
本發明提供的菌株為解淀粉芽孢桿菌YJ01,拉丁名為Bacillus amyloliquefaciens,是從河北省昌黎市華夏長城釀酒葡萄酒莊園的釀酒葡萄上分離得到的，目前已經在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏單位地址是:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼為100101，其保藏編號為=CGMCCN0.7328，保藏日期為2013年3月19日。菌株的生理生化性質如下:革蘭氏陽性菌，細胞形態桿狀，形成芽孢，接觸酶和氧化酶反應均為陽性。利用碳水化合物產酸試驗:淀粉水解、水解酪素及水解明膠均為陽性，檸檬酸利用試驗呈陽性，甲基紅試驗呈陰性。菌種具有較弱的抑制細菌和酵母能力，較強抑制霉菌的能力。該菌株經過中國科學院微生物研究所鑒定為解淀粉芽孢桿菌，其拉丁名為Bacillus amyloliquefaciens。該菌株的16SrNA基因序列測定結果如下:
TGCGGCGTGCCTATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACcTTGACGGTACCTAACcAGAAAGCcACGGCTAACTACGTGcCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGtTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAaTCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGgCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGTACAGATGAC
本發明主要通過兩種使用方式進行釀酒葡萄真菌病害的應用:一是提取解淀粉芽孢桿菌YJOl中的抑菌物質制作成菌劑配方。一是將解淀粉芽孢桿菌YJOl進行發酵培養制作成發酵液直接噴涂使用。解淀粉芽孢桿菌YJOl抑菌物質的制取及鑒定:
(I)斜面培養:培養時間1-2天，培養基成分(I升):蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，瓊脂15 20g，自然pH，培養溫度28 32 V。(2)種子培養:超凈工作臺中從斜面挑取經活化的單菌落接入種子培養液中，28°C搖菌]Λ2天,轉速200 r/min,得到種子液；種子培養液成分:蛋白胨10g/L,牛肉膏3gL/,氯化鈉 5g/L，pH 值 7.0 7.2。(3)發酵培養:按4%接種量，將上步驟獲得的種子液接入發酵培養基中，28°C振蕩培養2 3天，轉速200 r/min，得到解淀粉芽孢桿菌YJOl的發酵液。發酵培養基成分為:葡萄糖 30g/L,谷氨酸鈉(味精)15g/L，MgS04 0.5 g/L，KCl 0.5 g/L, KH2P04 1.0g/L,FeSO4 0.15 mg/L, MnSO4 5.0 mg/L, CuSO4 0.16 mg/L,水 1000ml，初始 PH 7.0。(4)抑菌產物提取方法:將發酵液在8000r/min條件下離心IOmin除去菌體,力口入6 mol/L的HCL調PH值到2，4°C冰箱低溫保存8h，8 000 r/min離心10 min收集沉淀，沉淀加入甲醇萃取，并加入lmol/L的NaOH調PH到7，多次萃取后合并萃取液，旋轉蒸發除去甲醇后獲得抑菌制品。(5)將抑菌物質經凝膠層析后，將獲得的純品送至北京微量研究所，經電噴霧質譜-電解基質解離(ES1-MS-CID)，解析獲得的碎片離子峰，確認主要含有伊枯草菌素(iturin)和表面活性素(surfactin)兩種物質。(6)將制得的抑菌制品解淀粉芽孢桿菌YJOl做成系列稀釋的不同濃度的溶液制品，其濃度范圍為30-100mg/L。發現在該濃度范圍內抑菌效果明顯。解淀粉芽孢桿菌YJOl發酵液的制備及應用:
(I)菌斜面培養:培養時間1-2天，培養基成分(I升):蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，瓊脂15 20g,自然pH,培養溫度28 32 V。(2)種子培養:超凈工作臺中從斜面挑取經活化的單菌落接入種子培養液中，28°C搖菌]Λ2天,轉速200 r/min,得到種子液；種子培養液成分:蛋白胨10g/L,牛肉膏3gL/,氯化鈉 5g/L，pH 值 7.0 7.2。(3)發酵培養:按4%接種量，將上步驟獲得的種子液接入發酵培養基中，28°C振蕩培養2 3天，轉速200 r/min，得到解淀粉芽孢桿菌YJOl的發酵液。發酵培養基成分為:葡萄糖 30g/L,谷氨酸鈉(味精)15g/L，MgS04 0.5 g/L, KCl 0.5 g/L, KH2P04 1.0g/L,FeSO4 0.15 mg/L, MnSO4 5.0 mg/L, CuSO4 0.16 mg/L,水 1000ml，初始 PH 7.0。(4)發酵液的使用為直接噴涂。與現有技術相比，本發明的優點是:解淀粉芽孢桿菌YJOl是從釀酒葡萄中分離得至IJ，因此對真菌引起的釀酒葡萄灰霉病、釀酒葡萄白粉病等病害的防治具有顯著的效果。解淀粉芽孢桿菌YJOl在防治釀酒葡萄真菌病害中的應用也屬于該發明的保護范圍。所述的解淀粉芽孢桿菌在抑制釀酒葡萄灰霉病、釀酒葡萄白粉病、釀酒葡萄白腐病、釀酒葡萄炭疽病、釀酒葡萄聚圍小叢殼菌、釀酒葡萄酸腐病具有很好的作用效果。
附圖1解淀粉芽孢桿菌YJOl對釀酒葡萄灰霉病病原菌灰釀酒葡萄孢霉菌實驗效果圖。附圖2解淀粉芽孢桿菌YJOl對釀酒葡萄聚圍小叢殼菌實驗效果圖。附圖3解淀粉芽孢桿菌YJOl提取的抑菌物質對釀酒葡萄防腐效果圖。
具體實施例方式實施例1:解淀粉芽孢桿菌發酵液對釀酒葡萄灰霉病病原菌灰釀酒葡萄孢霉菌和釀酒葡萄小叢殼菌的抑制效果。將滅菌后PDA培養基溫度保持在55°C，然后將斜面挑取一環病原菌，接入無菌水中，混勻后，取200 μ L液體加入PDA培養基中，混勻后到平板。待凝固后，在培養基正中間放入一無菌的牛津杯，輕輕擠壓，使牛津杯與培養基表面無縫隙，然后在牛津杯中注入200 μ L的無菌發酵液。最后在28°C培養箱中培養2d，觀察抑菌圈的有無。對實驗結果如灰釀酒葡萄孢霉菌圖1所示,對聚圍小叢殼菌抑制結果如圖2所示。表明發酵液對二種病原菌具有良好的抑制效果。實例二:解淀粉芽孢桿菌發酵液噴灑實驗實驗品種:7-8年生霞多麗277、赤霞珠685。實驗數量:每個實驗共做菌液，空白，波爾多液二組，每個實驗品種釀酒匍萄用地約IOOm2，約110株釀酒葡萄。實驗用藥:波爾多液由華夏長城葡萄酒公司配置，菌液由YJOl發酵而來，發酵
2-4d，溫度35°C。培養基成分:蛋白胨10g/L，牛肉膏3gL/，氯化鈉5g/L，pH值7.0 7.2。試驗方式:波爾多液由基地員工正常打藥，空白組不做處理。菌液組人工噴灑，每組實驗共8L。實驗每周打藥一次。噴灑前先摘除病果，然后進行打藥實驗，在下次實驗前統計病果數量，并且摘除。表一噴灑試驗結果
權利要求
1.一種解淀粉芽孢桿菌YjOl，其保藏編號為=CGMCC N0.7328，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
2.如權利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌YJOl作為防治釀酒葡萄病害的應用，其特征是:提取YJOl發酵液中的抑菌物質制作成菌劑配方，提取和使用方式如下: (1)斜面培養:培養時間1-2天，培養基成分:蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化鈉5g/L，瓊脂15 20g/L,自然pH,培養溫度28 32 V ； (2)種子培養:超凈工作臺中從斜面挑取經活化的單菌落接入種子培養液中，28°C搖菌1^2天,轉速200 r/min,得到種子液； (3)發酵培養:按4%接種量，將上步驟獲得的種子液接入發酵培養基中，28°C振蕩培養2 3天，轉速200 r /min，得到解淀粉芽孢桿菌YJOl的發酵液； (4)抑菌產物提取方法:將發酵液在8000r/min條件下離心IOmin除去菌體,加入6mol/L的HCL調PH值到2，4°C冰箱低溫保存8h，8 000 r/min離心10 min收集沉淀，沉淀加入甲醇萃取，并加入lmol/L的NaOH調PH到7，多次萃取后合并萃取液，旋轉蒸發除去甲醇后獲得抑菌制品； (5)將制得的抑菌制品做成系列稀釋的不同濃度的溶液制品，其濃度范圍為30-100mg/L0
3.如權利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌YJOl作為防治釀酒葡萄病害的應用，其特征是將解淀粉芽孢桿菌YJOl進行發酵培養制作成發酵液直接噴涂使用。
4.如權利要求2所述的種子培養液成分為:蛋白胨10g/L，牛肉膏3gL/，氯化鈉5g/L，pH 值 .0^7.2。
5.如權利要求2所述的發酵培養基成分為:葡萄糖30g/L，谷氨酸鈉15g/L，MgS04.0.5 g/L，KCl 0.5 g/L，KH2P04 1.0g/L, FeSO4 0.15 mg/L, MnSO4 5.0 mg/L, CuSO4 0.16 mg/L,水 1000ml，初始 PH 7.0。
6.如權利要求2所述的抑菌制品的使用濃度優選為50mg/L。
7.如權利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌YJOl在防治釀酒葡萄真菌病害中的應用。
8.根據權利要求7所述應用，其特征在于所屬真菌病害為釀酒葡萄灰霉病、釀酒葡萄白粉病、釀酒葡萄白腐病、釀酒葡萄炭疽病、釀酒葡萄聚圍小叢殼菌、釀酒葡萄酸腐病。
全文摘要
本發明公開了一種解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)YJ01，在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏,保藏編號為CGMCCN0.7328。該解淀粉芽孢桿菌主要用于釀酒葡萄的真菌病害的防治。本發明解淀粉芽孢桿菌YJ01能夠代謝出抑菌物質伊枯草菌素A(iturinA)和表面活性素(surfactin)，對釀酒葡萄的多種致病真菌具有明顯抑制作用。該菌種繁殖速度快，能夠人工培養，易于操作，便于生產應用，抗逆能力強等優點，尤其是對真菌引起的釀酒葡萄灰霉病，白腐病，炭疽病等病害的防治具有重要意義，培養條件簡單、容易保存，易于工業化生產，具有良好的開發應用前景。
文檔編號C12R1/07GK103243044SQ201310121048
公開日2013年8月14日 申請日期2013年4月9日 優先權日2013年4月9日
發明者郭陽, 龔谷迪, 嚴斌, 李濤, 孫志偉, 宋濤 申請人:中國食品發酵工業研究院