水稻Bph28基因在改良水稻抗褐飛虱性狀方面的應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于轉基因【技術領域】，具體為水稻Bph28基因在改良水稻抗褐飛虱性狀方面的應用。本發明利用來自普通野生稻的Bph28基因改良水稻抗褐飛虱性狀,將栽培稻中的Bph28等位顯性基因轉化抗蟲品種，覆蓋隱性基因Bph28的表達，使抗蟲品種的抗蟲性狀發生顯著弱化，提供了該基因在水稻抗蟲性狀方面的重要功能。本發明還涉及改良水稻的褐飛虱抗性的方法、Bph28等位基因的表達載體、其制備方法及應用。
【專利說明】水稻辦/^<9基因在改良水稻抗褐飛虱性狀方面的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于轉基因【技術領域】，具體涉及基因的一種新的應用。本發明還涉 及基因的的表達載體和一種改良水稻抗褐飛虱性狀方法。
【背景技術】
[0002] 水稻是世界主要糧食作物，控制各種的水稻病蟲害是亟待解決的嚴峻問題。在草 食性水稻害蟲中，對產量破壞性最強的就是褐飛虱。輕度的褐飛虱感染會導致作物株高降 低，生長活力受抑，分蘗數亦受到抑制。而嚴重的褐飛虱感染會使作物完全枯萎，產生"葉蟬 燒"現象。褐飛虱也可以成為水稻草矮病毒和水稻鋸齒葉矮縮病毒的傳播載體，在一些區域 造成嚴重的疾病傳播。
[0003] 近年來，褐飛虱感染問題在亞洲地區日漸嚴峻，農民多依賴化學殺蟲劑來控制蟲 害，費工費時，極大的加重了環境的負擔。最經濟有效且環保可持續的蟲害控制方法，是培 育對褐飛虱具有廣泛抗性的水稻品種并加以推廣。多數研究表明，具有抗性的水稻品種能 夠抑制蟲害的重量增長，并且大范圍的幾個世代后，可以顯著降低褐飛虱的種群水平。
[0004] 迄今為止，有27個褐飛虱抗性基因在水稻栽培種及野生種中進行了定位，僅有一 例被精確克隆到，水稻抗蟲性的分子機理也不甚明了。而且，對于褐飛虱的抗性資源大多來 自陸生秈稻，而來自粳稻的種質資源十分有限。同時，已有的提供抗性的野生稻品系均非栽 培稻的AA基因組背景，因此在基因滲入之后，由于缺少與其原有的非AA基因組遺傳背景的 互作，轉基因的抗性特征大大減弱。因此，發掘來自普通野生稻的新的抗性資源中的抗性基 因十分重要。在未來，通過多基因互作來抵制褐飛虱的抗性也是十分重要的方向。
【發明內容】
[0005] 本發明目的在于提出水稻功基因在改良水稻抗褐飛虱性狀方面的應用及方 法。
[0006] 本發明利用來自普通野生稻的基因改良水稻抗褐飛虱性狀。實施例中，將 栽培稻中的等位顯性基因轉化抗蟲品種，覆蓋隱性基因3#1的表達，使抗蟲品種的 抗蟲性狀發生顯著弱化，提供了該基因在水稻抗蟲性狀方面的重要功能。
[0007] 本發明提供了 基因在改良水稻抗褐飛虱性狀方面的應用。
[0008] 例如，將你力忽基因轉化水稻品種，以改良水稻抗褐飛虱性狀。
[0009] 其中，所述的你公^基因的序列如SEQ ID NO 1所示。
[0010] 本發明可以用于培育具有褐飛虱抗性的水稻，依次包括如下步驟： (1) 構建功等位基因表達載體； (2) 功等位基因表達載體轉化水稻受體； (3 )播種功等位基因轉化植株。
[0011] 其中，步驟（2)中采用抗蟲野生稻BPHR54為轉基因水稻受體，構建功7力忽等位基 因的過表達轉基因植株。
[0012] 本發明提供了改良水稻的褐飛虱抗性的一種方法，該方法依次包括如下步驟： (a) 構建功等位基因表達載體； (b) 功等位基因表達載體轉化水稻受體； (c) 播種功等位基因轉化植株。
[0013] 其中，步驟（b)中采用抗蟲野生稻作為轉基因水稻受體。
[0014] 本發明還提供了 一種功等位基因的表達載體，是在pCAMBIA1304載體35S組 成型啟動子下游插入等位基因。
[0015] 上述的表達載體的制備方法，是根據基因工程的常規操作，將感蟲秈稻118S的 功等位基因插入到pCAMBIA1304載體35S組成型啟動子下游。
[0016] 本發明還提供了上述的表達載體的應用，即將該表達載體應用于改良水稻抗褐飛 風性狀。
[0017] 本發明所述的你力忽基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。本發明所述的 功基因還包括指編碼具有水稻Bph28活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO. 1的簡 并序列。
[0018] 在本發明的另一方面，提供了一種表達水稻谷#1基因的方法，該方法包括： (a) 將基因的核苷酸序列可操作地連于表達調控序列，形成基因表達載 體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO. 1的核苷酸序列有至少70%的同源性； (b) 將步驟（a)中的表達載體轉入宿主細胞，形成含有功基因的重組細胞； (c) 在適合表達基因的條件下，培養步驟（b)中的重組細胞； (d) 分離出目的蛋白。
[0019] 在本發明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體。如，選用市售的載 體，然后將編碼本發明多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調控序列，可以形成蛋白表達 載體。
[0020] 如本文所用，"可操作地連于"指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影 響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達并參與多肽的 分泌，那么信號肽（分泌前導序列）DNA就是可操作地連于多肽DNA;如果啟動子控制序列 的轉錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結合位點被置于能使其翻譯的位置 時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，"可操作地連于"意味著相鄰近，而對于分泌前 導序列則意味著在閱讀框中相鄰。
[0021 ] 在本發明中，術語"宿主細胞"包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的 例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞，昆蟲細胞、和哺乳動 物細胞。較佳地，該宿主細胞是真核細胞，如CH0細胞、C0S細胞等。
[0022] 本發明還包括：水稻基因的分離、克隆與轉基因功能研究等。
[0023] 1)φΑ忽基因與蛋白結構組成 水稻你 Α忽基因，基因序列全長612bp，無內含子。序列如SEQ. ID Ν01.所示。cDNA genbank登錄號為KC019173,該登陸編碼區序列全長612bp。編碼203個氨基酸，序列如 SEQ. ID N02.所示。該基因的結構與其編碼的蛋白質組成如下： 水稻你基因結構見圖1所示。
[0024] 蛋白結構見圖2所示，含有一個B3 DNA-binding結構域。 2 )功等位基因表達載體的構建 米用 pCAMBIA1304 (Center for the Application of Molecular Biology of International Agriculture, Canberra, ACT, Australia)為表達載體，將秈稻 118S 的 功等位基因插入到pCAMBIA1304載體35S組成型啟動子下游，得到含功等位基因的 表達載體。其結構圖如圖3所示。
[0025] 3)功也等位基因轉化實驗 采用具有高級別抗褐飛虱性狀的野生稻品種BPHR54為轉基因受體，構建/?等位基 因表達的轉基因植株。將BPHR54成熟種子去殼消毒后接種在脫分化植物組織培育基上誘 導愈傷組織。在愈傷組織誘導2-3周后，采用基因槍微彈轟擊法，將含等位基因的經 純化的PCAMBIA1304質粒DNA導入BPHR54愈傷組織細胞。在添加30ppm潮霉素的MS培養 基上連續培養3-4周篩選抗性細胞系，然后將篩選的細胞系轉移到分化培養基誘導長芽和 生根。
[0026] 4)轉化處理試管苗移載及轉化植株后代的分子檢測 將功等位基因轉化處理的BPHR54試管苗移載田間，并在分蘗期取葉片提取DNA采 用PCR擴放技術進行分子檢測，于2011年夏獲得陽性T0代植株。2011年冬，在海南島加代 繁殖，獲得轉基因 T1代，共計7個株系。
[0027] 5)功7力忽等位基因轉化野生稻BPHR54轉基因植株的PCR檢測 目的基因在野生稻BPHR54對照植株中不表達，而在轉基因植株中表達。見圖4所示。
[0028] 6)功也貨轉基因T1代群體抗蟲性狀的調查與統計 將轉基因 T1代于2012年夏播種，種植在廣西農科院植保所網室。三葉期時對其進行 抗蟲鑒定。取5個轉基因株系，每個株系約種植20株，10株X 2列。同時設立野生型敏感 親本與BPHR54抗蟲親本作為對照，統計各株系的抗蟲級數，統計結果如下：
【權利要求】
1. Bph28基因在改良水稻抗褐飛虱性狀方面的應用。
2. 如權利要求1所述的應用，其特征在于，將基因轉化水稻品種，以改良水稻抗 褐飛虱性狀。
3. 如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的功也貨基因的序列如SEQ ID NO 1所 /_J、1 ο
4. 如權利要求1所述的應用，其特征在于，培育具有褐飛虱抗性的水稻，依次包括如下 步驟： (1)構建功等位基因表達載體； 等位基因表達載體轉化水稻受體； (3)播種功等位基因轉化植株。
5. 如權利要求4所述的應用，其特征在于，步驟（2)中采用抗蟲野生稻BPHR54為轉基 因水稻受體，構建功等位基因的過表達轉基因植株。
6. 改良水稻的褐飛虱抗性的一種方法，其特征在于，該方法依次包括如下步驟： (a)構建功等位基因表達載體； 必;功等位基因表達載體轉化水稻受體； (c)播種功等位基因轉化植株。
7. 如權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟（b)中采用抗蟲野生稻作為轉基因水稻 受體。
8. -種功也貨等位基因的表達載體，其特征在于，感蟲秈稻118S的功也貨等位基因插 入到PCAMBIA1304載體35S組成型啟動子下游。
9. 如權利要求8所述的表達載體的制備方法，其特征在于，將感蟲秈稻118S的功7力忽 等位基因插入到PCAMBIA1304載體35S組成型啟動子下游而獲得。
10. 權利要求8所述的表達載體的應用，其特征在于，將該表達載體應用于改良水稻抗 褐飛虱性狀。
【文檔編號】C12N15/82GK104099342SQ201310112700
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2013年4月2日 優先權日:2013年4月2日
【發明者】羅小金, 王瑩, 楊金水 申請人:復旦大學