新的短核苷酸串聯重復序列位點及其應用的制作方法

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新的短核苷酸串聯重復序列位點及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種新的短核苷酸串聯重復序列位點及其應用，短串聯重復序列基因座G7S0005，序列如SEQ?ID?NO.1所示，用于制備(a)用于遺傳關系分析的試劑或試劑盒；(b)用于個體識別的試劑或試劑盒；(c)用于親子鑒定或血緣分析的試劑或試劑盒；(d)用于檢測抽提羊水中是否存在母血污染的試劑或試劑盒；和/或(e)用于檢測骨髓移植后受體中的白細胞是否被供體細胞取代的試劑盒。短串聯重復序列基因座G7S0005區分度高，能夠有效地分析遺傳關系。
【專利說明】[0001] 新的短核苷酸串聯重復序列位點及其應用

【技術領域】
[0002] 本發明涉及一種短核苷酸串聯重復序列位點及其應用。
[0003]

【背景技術】
[0004] 短串聯重復序列（Short Tandem Repeat. STR)，又稱微衛星DNA (microsatellite DNA)，是一類重復單位2-6bp，重復次數10-60,片段長度在400bp以下的DNA串聯重復序列；其產生原因是DNA復制過程中滑動，或在復制和修復時滑動鏈與互補鏈堿基錯配，導致一個或幾個重復單位的缺失或插入。STR具有在基因組中分布廣泛、等位基因多、雜合度高、分型結果穩定，STR遺傳符合孟得爾遺傳定律（Koreth，J.，etal. 1996. Microsatellites and PCR ge-nomic analysis. J. Pathol. 178: 239-248.)等特點，并且多個STR基因座聯合檢測時，個體識別力和非父排除率高。因而STR以其遺傳多態性等特征，已被作為第二代遺傳標記廣泛應用于醫學個體識別、人類遺傳圖譜繪制、親子鑒定、法醫物證檢驗等領域，有效地推動了法醫鑒定學從以往物證樣本的個體排除向個體識別全面轉換。
[0005] 目前，個體識別的技術主要采用STR-PCR檢測，對多個STR基因座聯合分型，以確定未權關系或個體識別等，在實驗方法都相對成熟，但在STR基因座的選擇上，沒有統一標準。國內外生產商提供的檢測試劑盒中所用的位點不盡相同。早期歐美選用10個STR基因座加 1 個性別決定基因（E.A. Cotton, R.F. Allsop, J.F. Guest, R.R.E. Frazier, P. Koumi，I. P. Callow, A. Seager, R. L. Sparkes，Validation of the AmpFlSTR@SGM Plus ? system for use in forensic casework, Forensic Sci. Int. 112 (2000) 151 - 161.)。后來隨著技術發展、數據庫增多，比對信息難度加大，STR基因座的選擇也在不斷改進。現在比較有影響力的數據庫C0DIS(Combined DNA Index System)是由美國FBI 基于 13 個 STR 基因座（D3S1358, vWA，D16S539, D5S818, D7S820, CSF1P0, D13S317, ΤΡ0Χ， D8S1179，D21S11，D18S51，TH01，FGA.)構建，因而現在大多數STR檢測試劑盒生產商也在這13個核心基因座的基礎上增加或刪減一些位點以提高檢測效率及準確率（D. J. French， R. L. Howard, N. Gale, T. Brown, D. G. McDowell, P. G. Debenhan, Interrogation of short tandem repeats using fluorescent probes and melting curve analysis:A step towards rapid DNA identity screening. Forensic Science. (2008)333-339)〇例如Promega公司的PowerPlex?16 System試劑盒包括了 13個核心基因座，并增加了 PentaD、PentaE 和 AMEL0 三個基因座；美國 ABI 公司的 AmpF/STR? Identifiler? PCR Amplification Kit則是13個核心基因座加上D2S1338、D19S433和AMEL0 ;其公司的另外兩款試劑盒 AmpFlSTR?SGM Plus? PCR Amplification Kit 和 AmpFISTR? Sinofiler?PCR Amplification Kit也做了相應基因座位點的增減。國內生產類似檢測試劑盒的單位也有很多，例如公安部二所推廣的DNA Typer ? 15,中德美聯生物技術有限公司的AG⑶EX22 STR熒光檢測試劑盒，所檢測基因座增至22個。
[0006] 以上試劑盒選擇的STR基因座的優點在于，以13個得到公認的核心基因座為基礎，附加一些其它位點以豐富所檢測得到的信息量，能較全面的反應出個體間的差異性，進而完成個體識別、父權判定等工作。但是所用的這些基因座中并非都是最優選擇，例如FGA 基因座存在序列長度過長、重復單元多但跨度不連續，從而影響了與其它位點的兼容性，不利于與多個基因座聯合檢測的多重體系運用；D19S433基因座則位于基因組中高度重復序列區，擴增引物設計存在較大麻煩，并且該位點的穩定性不高，應用于個體識別時所提供的可用信息質量和區分度都不高；再如D21S11基因座除了存在位于基因組中高度重復序列區域的問題之外，還發現在該基因座所在區域中可能存在CNV(基因拷貝數變異的情況；在遇到基因拷貝數非正常的樣本檢測時，會降低該位點STR分型的準確度，在個人識別中采用該基因座的效果也會大打折扣。隨著人類基因組圖譜的建立及測序技術的發展，以較低的成本，在較快的時間內對個人全基因組重測序成為可能，進而能在較大的信息量下篩選出區分度更高的STR基因座，推動了應用于個體識別等研究中的STR基因座的選擇與更新。
[0007] 因此，為克服兼容性差、存在CNV或位于高度重復序列區域等缺陷，本領域尚需一種新型的具有高區分度的短串聯重復序列。
[0008]

【發明內容】

[0009] 本發明的目的在于提供一種新型的短串聯重復序列基因座，不存在CNV，且不位于高度重復序列區域，具有高區分度。
[0010] 本發明的第一方面，提供一種分離的短串聯重復序列基因座G7S0005,序列如SEQ ID NO. : 1所示。
[0011] 本發明的第二方面，提供一種分離的核苷酸序列，所述核苷酸序列的結構如下： X1-X2-X3 式中，XI 為 SEQ ID N0. : 2 中第 1-800 位； X2為含有> 2個重復單元taga的遺傳多態區； X3 為 SEQ ID N0. : 2 中第 865-1644 位。
[0012] 本發明的第三方面，提供第一方面所述的短串聯重復序列基因座G7S0005的用途，用于制備： (a) 用于遺傳關系分析的試劑或試劑盒； (b) 用于個體識別的試劑或試劑盒； (c) 用于親子鑒定或血緣分析的試劑或試劑盒； (d) 用于檢測抽提羊水中是否存在母血污染的試劑或試劑盒；和/或 (e) 用于檢測骨髓移植后受體中的白細胞是否被供體細胞取代的試劑盒。
[0013] 在另一優選例中，所述的試劑包括⑴引物或引物對；（ii)探針；（iii)核酸芯片。
[0014] 在另一優選例中，所述的引物對的序列如SEQ ID NO. : 3和SEQ ID NO. :4所示。
[0015] 本發明的第四方面，提供一種特異性擴增短串聯重復序列基因座G7S0005的引物對，所述的引物對的序列如SEQ ID N0. : 3和SEQ ID N0. :4所示。
[0016] 在另一優選例中，所述短串聯重復序列基因座G7S0005如第一方面所述。
[0017] 本發明的第五方面，提供一種試劑盒，包括： (a) 用于特異性擴增短串聯重復序列基因座G7S0005的引物對； (b) 使用說明書。
[0018] 在另一優選例中，所述短串聯重復序列基因座G7S0005如第一方面所述。
[0019] 在另一優選例中，所述試劑盒還包括（c)特異性擴增選自下組的一種或多種基因座的引物對： D3S1358、vWA、D16S539、D5S818、D7S820、CSF1P0、D13S317、TPOX、D8S1179、D21S11、 D18S51、TH01、FGA、D2S1338、D19S433、AMEL0。
[0020] 本發明的第六方面，提供一種擴增體系，包括： (a) 用于特異性擴增短串聯重復序列基因座G7S0005的引物對；和 (b) 任選的、特異性擴增選自下組的一種或多種基因座的引物對： D3S1358、vWA、D16S539、D5S818、D7S820、CSF1P0、D13S317、TPOX、D8S1179、D21S11、 D18S51、TH01、FGA、D2S1338、D19S433、AMEL0 ; 并且所述引物對（a)和任選的引物對（b)位于同一擴增體系。
[0021] 在另一優選例中，所述短串聯重復序列基因座G7S0005如第一方面所述。
[0022] 在另一優選例中，所述的擴增體系為復合擴增體系，其中，所述的引物對（b)包括 1，2, 3,4, 5,6, 7,8,9,10,11，12,13,14,15,或 16 對特異性引物對；和 / 或所述復合擴增體系為熒光標記的復合擴增體系，其中，所述熒光標記是指選用下組的一種或多種熒光標記試劑標記所述基因座的引物：FAM、HEX、VIC、NED、PET、TAMRA、R0X、熒光素、FITC、IRD-700/800、CY3、CY5、CY3·5、CY5·5、TET、TAMRA、J0E、B0DIPYTMR、俄勒岡綠、羅丹明綠、羅丹明紅、德克薩斯紅或雅基馬黃。
[0023] 本發明的第七方面，提供一種擴增方法，包括步驟：在第六方面所述的擴增體系中，以待檢測樣本為模板，利用聚合酶鏈式反應進行基因座的擴增，從而獲得基因座擴增產物。
[0024] 在另一優選例中，所述方法還包括：對所述基因座擴增產物進行檢測的步驟。
[0025] 在另一優選例中，所述的檢測選自下組：毛細管電泳、測序、雜交。
[0026] 在另一優選例中，所述待測樣品選自下組：血液、唾液、精液、汗液、羊水、骨骼、或毛發。
[0027] 本發明的第八方面，提供一種遺傳關系分析方法，包括步驟：在第六方面所述的擴增體系中，以待檢測樣本為模板，利用聚合酶鏈式反應進行基因座的擴增，從而獲得基因座擴增產物；和其中，所述待檢測樣本包括分別來自不同個體的核酸樣本SI, S2,......，Si，式中i為彡2的正整數； (2) 對來自不同核酸樣本Sl，S2,……，Si的基因座擴增產物進行檢測，從而獲得對應于不同核酸樣本的檢測結果； (3) 對步驟（2)獲得的檢測結果進行比較，從而確定不同個體之間的遺傳關系。
[0028] 在另一優選例中，所述遺傳關系分析包括個體識別分析、親子鑒定分析、血緣關系分析。
[0029] 本發明提供了一種新型的STR基因座，不存在CNV，且不位于高度重復序列區域、雜合度高，分辨率高、兼容性高，能與已有的大多數位點在同一體系內使用，能夠有效區分隨機人群的遺傳關系。
[0030] 應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文（如實施例）中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
[0031]

【專利附圖】

【附圖說明】
[0032] 圖1為父本多個STR位點的檢測峰圖。
[0033] 圖2為母本多個STR位點的檢測峰圖。
[0034] 圖3為子代多個STR位點的檢測峰圖。
[0035] 圖4為無親緣關系樣本多個STR位點的檢測峰圖。
[0036]

【具體實施方式】
[0037] 本發明人經過廣泛而深入的研究，通過大量篩選，首次篩選出一種新型的短串聯重復序列基因座G7S0005,含有> 2個重復單元taga的遺傳多態區。該短串聯重復序列基因座區分度達到0.7612以上，與少量常規的STR基因座聯用，可有效區分遺傳關系，區分度高達0.99以上。在此基礎上，完成了本發明。
[0038] 短串聯重復序列基因座本發明通過大量篩選，分離出一種新的短串聯重復序列基因座，STR位點信息如表1所 /_J、1 〇
[0039] 表1 STR的基本信息瓦點至稱I重復數I重復單元I等位基因數I染色體位置I起始 |結束 G7SQQQ5 |ll |taga \7 \7 |l22564585 |l22564628 本發明提供的一種分尚的短串聯重復序列基因座，命名為G7S0005,序列如SEQ ID NO. : 1所示。
[0040] 重復數11,即11個重復單元taga。
[0041] 等位基因數，即為實驗結果統計所得的等位基因數。
[0042] 本發明提供的分離的核苷酸序列，結構如下： X1-X2-X3 式中，XI 為 SEQ ID N0. : 2 中第 1-800 位； X2為含有> 2個重復單元taga的遺傳多態區； X3 為 SEQ ID N0. : 2 中第 865-1644 位。
[0043] 在另一優選例中，所述的X2的長度為30-150bp，較佳地60-130bp或70-120bp，更佳地 80-11 Obp。
[0044] 在另一優選例中，所述的X2為含有彡5個重復單元taga的遺傳多態區。
[0045] 在另一優選例中，所述的X2為含有彡11個重復單元taga的遺傳多態區。
[0046] 在另一優選例中，X2為SEQ ID NO. : 1所示的多核苷酸或其片段（包括在5'端、 3'端和/或中間區域因缺失一個或多個堿基所形成的片段）。
[0047] 本發明的短串聯重復序列基因座G7S0005,能夠用于： (a) 制備用于遺傳關系分析的試劑或試劑盒； (b) 制備用于個體識別的試劑或試劑盒； (c) 制備用于親子鑒定或血緣分析的試劑或試劑盒； (d) 制備用于檢測抽提羊水中是否存在母血污染的試劑或試劑盒；和/或 (e) 制備用于檢測骨髓移植后受體中的白細胞是否被供體細胞取代的試劑盒。
[0048] 所述的試劑還包括⑴引物或引物對；（ii)探針；（iii)核酸芯片。較佳地，所述的引物對的序列如SEQ ID N0. : 3和SEQ ID N0. :4所示。
[0049] 本發明還提供一種特異性擴增短串聯重復序列基因座G7S0005的引物對，序列如 SEQ ID N0. : 3 和 SEQ ID N0. :4 所示。
[0050] 所述的引物對中的一個或兩個引物帶有可檢測標記物。
[0051] 所述的可檢測標記物包括：突光標記物或量子點標記物。
[0052] 所述熒光標記包括但不限于：FAM、HEX、VIC、NED、PET、TAMRA、R0X、熒光素、FITC、 IRD-700/800、CY3、CY5、CY3. 5、CY5. 5、TET、TAMRA、J0E、B0DIPY TMR、俄勒岡綠、羅丹明綠、羅丹明紅、德克薩斯紅或雅基馬黃。上述熒光標記物為本領域已知的標記物，均有市售商品，可通過購買獲得。
[0053] 試劑盒本發明提供的試劑盒，包括： (a) 用于特異性擴增短串聯重復序列基因座G7S0005的引物對； (b) 使用說明書。
[0054] 較佳地，所述的引物對的序列如SEQ ID N0. : 3和SEQ ID N0. :4所示。
[0055] 所述試劑盒還包括（c)特異性擴增選自下組的一種或多種基因座的引物對： D3S1358、vWA、D16S539、D5S818、D7S820、CSF1P0、D13S317、ΤΡ0Χ、D8S1179、D21S11、 D18S51、TH01、FGA、D2S1338、D19S433、AMEL0。
[0056] 在所述試劑盒中，所述的各特異性引物對位于同一或不同的容器中。
[0057] 在另一優選例中，所述的試劑盒還包括一種或多種以下試劑： (d) 用于PCR擴增的試劑； (e) 用于電泳的試劑； (f) 用于抽提DNA的試劑； (g) 標準品。
[0058] 擴增體系及擴增方法本發明提供的擴增體系，包括： (a) 用于特異性擴增短串聯重復序列基因座G7S0005的引物對；和 (b) 任選的、特異性擴增選自下組的一種或多種基因座的引物對： D3S1358、vWA、D16S539、D5S818、D7S820、CSF1P0、D13S317、TPOX、D8S1179、D21S11、 D18S51、TH01、FGA、D2S1338、D19S433、AMEL0 ; 并且所述引物對（a)和任選的引物對（b)位于同一擴增體系。
[0059] 較佳地，所述的引物對的序列如SEQ ID N0. : 3和SEQ ID N0. :4所示。
[0060] 在另一優選例中，所述的擴增體系是聚合酶鏈式反應PCR擴增體系。
[0061] 在另一優選例中，所述的擴增體系為液相。
[0062] 在另一優選例中，所述的擴增體系含有聚合酶、dNTP等用于PCR聚合的試劑。
[0063] 優選地，所述的擴增體系為復合擴增體系，其中，所述的引物對（b)包括1，2,3,4， 5,6, 7,8,9,10,11，12,13,14,15,或 16 對特異性引物對。
[0064] 較佳地，所述復合擴增體系為熒光標記的復合擴增體系，其中，所述熒光標記是指選用下組的一種或多種熒光標記試劑標記所述基因座的引物：FAM、HEX、VIC、NED、PET、 TAMRA、ROX、熒光素、FITC、IRD-700/800、CY3、CY5、CY3. 5、CY5. 5、TET、TAMRA、JOE、BODIPY TMR、俄勒岡綠、羅丹明綠、羅丹明紅、德克薩斯紅或雅基馬黃。
[0065] 在另一優選例中，所述各對引物中的一個引物的5'端帶有熒光標記。
[0066] 本發明的擴增方法，包括步驟：在上述擴增體系中，以待檢測樣本為模板，利用聚合酶鏈式反應進行基因座的擴增，從而獲得基因座擴增產物。
[0067] 所述方法還包括：對所述基因座擴增產物進行檢測的步驟。較佳地，所述的檢測采用選自下組的方法：毛細管電泳、測序、雜交。
[0068] 所述待測樣品選自下組：血液、唾液、精液、汗液、羊水、骨骼、或毛發。
[0069] 在另一優選例中，所述樣品來自于人。
[0070] 遺傳關系分析方法本發明提供一種遺傳關系分析方法，包括步驟： (1)在上述擴增體系中，以待檢測樣本為模板，利用聚合酶鏈式反應進行基因座的擴增，從而獲得基因座擴增產物；和其中，所述待檢測樣本包括分別來自不同個體的核酸樣本SI, S2,......，Si，式中i為彡2的正整數； (2) 對來自不同核酸樣本Sl，S2,……，Si的基因座擴增產物進行檢測，從而獲得對應于不同核酸樣本的檢測結果； (3) 對步驟（2)獲得的檢測結果進行比較，從而確定不同個體之間的遺傳關系。
[0071] 在另一優選例中，所述遺傳關系分析包括個體識別分析、親子鑒定分析、血緣關系分析。
[0072] 在另一優選例中，所述的不同個體來自同一家族。
[0073] 本發明提到的上述特征，或實施例提到的特征可以任意組合。本案說明書所揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個特征，可以任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似特征的一般性例子。
[0074] 本發明的有益之處在于： (1)提供了一種新型的STR基因座，不存在CNV，且不位于高度重復序列區域。
[0075] (2)新STR基因座的雜合度高，分辨率高。
[0076] (3)新STR基因座兼容性高，能與已有的大多數位點在同一體系內使用。
[0077] (4)新STR基因座或與已知STR基因座結合，能夠有效區分隨機人群的遺傳關系。
[0078] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如 Sambrook 等人，分子克隆：實驗室手冊（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數是重量百分比和重量份數。
[0079] 除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
[0080] 實施例1 將本發明新的STR基因座G7S0005與10個常用基因座位點（VWA，D16S539, D5S818， D7S820, D13S317, D8S1179, D18S51，TH01，D2S1338, AMEL0)組合，采用多重熒光 PCR 技術檢查樣本，所用4個樣本分別為有親緣關系的一家三口樣本，和1個無親緣關系的對照樣本。 G7S0005和10個常用基因座引物序列如表2所示。
[0081] 表2引物序列

【權利要求】
1. 一種分離的短串聯重復序列基因座G7S0005,其特征在于，所述基因座的序列如SEQ ID NO. :1 所示。
2. -種分離的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列的結構如下： X1-X2-X3 式中，XI 為 SEQ ID NO. : 2 中第 1-800 位； X2為含有> 2個重復單元taga的遺傳多態區； X3 為 SEQ ID NO. : 2 中第 865-1644 位。
3. 如權利要求1所述的短串聯重復序列基因座G7S0005的用途，其特征在于，用于制備： (a) 用于遺傳關系分析的試劑或試劑盒； (b) 用于個體識別的試劑或試劑盒； (c) 用于親子鑒定或血緣分析的試劑或試劑盒； (d) 用于檢測抽提羊水中是否存在母血污染的試劑或試劑盒；和/或 (e) 用于檢測骨髓移植后受體中的白細胞是否被供體細胞取代的試劑盒。
4. 如權利要求3所述的用途，其特征在于，所述的試劑包括（i)引物或引物對；（ii) 探針；（iii)核酸芯片。
5. 如權利要求4所述的用途，其特征在于，所述的引物對的序列如SEQ ID NO. : 3和 SEQ ID NO. :4 所示。
6. -種特異性擴增短串聯重復序列基因座G7S0005的引物對，其特征在于，所述的引物對的序列如SEQ ID NO. : 3和SEQ ID NO. :4所示。
7. -種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括： (a) 用于特異性擴增短串聯重復序列基因座G7S0005的引物對； (b) 使用說明書。
8. 如權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括（c)特異性擴增選自下組的一種或多種基因座的引物對： D3S1358、vWA、D16S539、D5S818、D7S820、CSF1P0、D13S317、TPOX、D8S1179、D21S11、 D18S51、TH01、FGA、D2S1338、D19S433、AMEL0。
9. 一種擴增體系，其特征在于，所述擴增體系包括： (a) 用于特異性擴增短串聯重復序列基因座G7S0005的引物對；和 (b) 任選的、特異性擴增選自下組的一種或多種基因座的引物對： D3S1358、vWA、D16S539、D5S818、D7S820、CSF1P0、D13S317、TPOX、D8S1179、D21S11、 D18S51、TH01、FGA、D2S1338、D19S433、AMEL0 ; 并且所述引物對（a)和任選的引物對（b)位于同一擴增體系。
10. 如權利要求9所述的擴增體系，其特征在于，所述的擴增體系為復合擴增體系，其中，所述的引物對（b)包括1，2, 3,4, 5,6, 7,8,9,10,11，12,13,14,15,或16對特異性引物對；和/或所述復合擴增體系為熒光標記的復合擴增體系，其中，所述熒光標記是指選用下組的一種或多種熒光標記試劑標記所述基因座的引物：FAM、HEX、VIC、NED、PET、TAMRA、R0X、熒光素、FITC、IRD-700/800、CY3、CY5、CY3·5、CY5·5、TET、TAMRA、J0E、B0DIPYTMR、俄勒岡綠、羅丹明綠、羅丹明紅、德克薩斯紅或雅基馬黃。
11. 一種擴增方法，其特征在于，包括步驟：在權利要求9-10中任一所述的擴增體系中，以待檢測樣本為模板，利用聚合酶鏈式反應進行基因座的擴增，從而獲得基因座擴增產物。
12. -種遺傳關系分析方法，其特征在于，包括步驟： (1) 在權利要求9-10中任一所述的擴增體系中，以待檢測樣本為模板，利用聚合酶鏈式反應進行基因座的擴增，從而獲得基因座擴增產物；和其中，所述待檢測樣本包括分別來自不同個體的核酸樣本SI, S2,......，Si，式中i為彡2的正整數； (2) 對來自不同核酸樣本Sl，S2,……，Si的基因座擴增產物進行檢測，從而獲得對應于不同核酸樣本的檢測結果； (3) 對步驟（2)獲得的檢測結果進行比較，從而確定不同個體之間的遺傳關系。
【文檔編號】C12Q1/68GK104099326SQ201310111837
【公開日】2014年10月15日申請日期:2013年4月2日優先權日:2013年4月2日
【發明者】姜正文, 馬瑞曉, 張希申請人:天昊生物醫藥科技（蘇州）有限公司

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