一種分子遺傳學診斷hTERT和SV40轉導質控細胞及其制備方法

一種分子遺傳學診斷hTERT和SV40轉導質控細胞及其制備方法
【專利摘要】本發明涉及醫學遺傳學診斷hTERT和SV40轉導質控細胞及其制備方法，其主要特征是以T4DNA連接重組子SV40LTag-pcDNA3.1(-)和pLXSNneo-hTERT，以脂質體導入常見染色體數目異常組織細胞，G418篩選整合有重組子的細胞作傳代擴增后凍存，臨用時按質控所需比例混合，使原先每例細胞只有1種染色體數目異常轉變為含有一定比例的2種至5種染色體數目異常的嵌合體質控細胞，增加了鑒別診斷、嵌合體診斷的難度，原始細胞易得且將廢棄的多余細胞轉化為有效的永生化質控細胞，以疑難質控細胞作室間質評和室內質控，對及時發現和解決質量問題、提高診斷水平具有重要的意義。
【專利說明】-種分子遺傳學診斷hTERT和SV40轉導質控細胞及其制備 方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種分子遺傳學診斷hTERT和SV40轉導質控細胞及其制備方法，主要 應用于醫學分子遺傳學診斷實驗室作染色體病診斷的技術考核、室內質控和室間質評。

【背景技術】
[0002] 染色體是細胞核中的遺傳物質，人類有23對染色體，其中22對為常染色體，1對為 決定男女性別的性染色體。染色體上載有遺傳信息的基因，其中DNA占90%以上，RNA含量 隨細胞周期及生長情況而有所變化，一般占1%?10%。
[0003] 染色體結構異常、數目異常及嵌合體，臨床上表現為染色體病，屬于常見的出生缺 陷，如先天愚型、原發性閉經、兩性畸型等。染色體結構異常包括染色體易位、缺失、倒位、環 狀等；染色體數目異常是指多出或缺少1條或數條染色體；嵌合體核型是指同一病例個體 并存數種染色體核型。目前診斷染色體結構和數目異常的常規方法是染色體核型分析，即 用被檢的組織或細胞，經過細胞培養、〇. 02 μ Ι/ml秋水仙素終止細胞生長、分離中期細胞、 0.075mol/LKCl低滲、甲醇-冰乙酸（3 : 1)固定等染色體制片程序后，再經胰酶消化、G顯 帶、染色體核型分析，從而作出染色體結構和數目是否異常的判斷，但染色體核型分析需經 細胞培養和制片，一般需2?3周后才能作出診斷報告，不能達到快速診斷的目的。近年來 開展的熒光原位雜交技術，能快速作出染色體數目和結構是否異常的診斷，一般在24小時 就能作出診斷報告，因為產前診斷中的重大遺傳病如21-三體、18-三體、13三體、性染色體 數目異常均屬常見染色體數目異常，均可經熒光原位雜交作出快速診斷，所以近年來熒光 原位雜交技術已被越來越廣泛地應用于被定義為常見染色體數目異常的21-三體、18-三 體、13三體、性染色體異常（X與Y染色體）的產前診斷。
[0004] 作為所開展的各類實驗診斷項目，均應有相應規范的質量控制措施。實驗室的質 量控制是確保實驗診斷結果準確性的前提，已成為政府行為。為了加強實驗室的質量控制， 我國于1982年成立了衛生部臨床檢驗中心，下設室間質評辦公室，專職從事于實驗診斷項 目的質量控制。衛生部[衛醫發]1997第31號文件、《臨床實驗室管理辦法》、《醫院評審標 準實施細則》以及大量的文獻均指出，實驗室必須有規范的質量控制標準，所開展的實驗診 斷項目必須參加衛生部臨床檢驗中心組織的室間質評。自1982年以來，在臨床檢驗學科先 后開展了臨床實驗的室內質控、室間質評。包括了對各檢驗項目的實驗前、中、后以及儀器、 試劑和實驗人員的質量控制。質量控制已滲透到臨檢、生化、微生物、免疫、基因、細胞形態 學診斷等各個實驗項目。實驗室的質量控制已成為開展實驗診斷項目的準入制度、成為醫 院等級評審的重要標準。
[0005] 產前診斷的質量控制已引起日益重視。隨著我國對生殖健康和出生缺陷工作的 是益重視，近年來各省市均建立了產前診斷中心，開展了 21三體綜合癥、18三體綜合征、 神經管畸形等重大出生缺陷的產前篩查和產前診斷，其中與重大出生缺陷相關的胎兒羊水 染色體異常的診斷已成為目前產前診斷的主要項目。由于產前診斷是新開展的學科，大多 專業人員的技術經驗較為缺乏，特別是對于疑難、罕見病例、國內外首報病例以及如貓叫綜 合癥等染色體異常不明顯但臨床后果嚴重的病例，誤診現象時有發生。我國國家主席令 (1994年10月27日第三十三號）公布的"產前診斷法規標準"以及國務院辦公廳[國發辦 (1999) 15號]轉發衛生部"關于做好提高出生人口素質工作意見"的通知中均強調指出， "各省、市產前診斷中心必須加強產前診斷的質量控制、嚴把質量關"。
[0006] 產前診斷的質量控制是許多學者致力于研究的重要課題。國外有較多的文獻報 道了產前診斷質量控制的重要性，Sikkema-Raddatz B等對產前細胞遺傳學診斷的細胞培 養及制片過程的影響因素作了深入的研究，提出了室內質量控制的方法；Fries N和Merz E等提出了影像學產前診斷的質量控制方法；Pihlk等認為必須加強產前篩查的質量控制； 在2002?2004年期間，Bastien P等對法國23家實驗室作了弓形蟲產前分子診斷的室間 質量評價，認為室間質評對促進實驗室間的技術交流、發現問題、提高實驗診斷質量起到重 要的作用。
[0007] 雖然我國行政主管部門以及學術界十分重視產前診斷的質量控制（包括室內質 控和室間質評），但因沒有可行的質控物，所以無法開展實質性的質量控制。也就是說，要開 展產前診斷的室間質評和室內質控，首先必須要有質控物。研制可行的質控物、開展產前診 斷質量控制是質量管理人員以及本專業技術人員長期以來想方設法解決但始終沒有解決 的難題。
[0008] 國外文獻報道，猴腎病毒40(SV40)可以使某些人類細胞發生永生化。Poul in DL、 Kung AL和Sullivan CS等研究表明，SV40T抗原基因的導入能加快轉化細胞的生長速率， 永生化細胞在體外多次傳代后，仍具有相對穩定的增殖特性和功能狀態，同時也能保留其 原始細胞的許多分化表型；另有國外研究表明，導入外源性hTERT可以使細胞保持正常表 型及分化特征，近年來已利用hTERT成功建立了某些細胞的永生化細胞系，基本保持染色 體穩定、分化正常、接觸抑制、無致瘤性等相對"正常"的生長特征。在口腔醫學領域，日本 學者Kamata、Fujita和Fujii轉染hTERT建立了永生化人牙齦成纖維細胞、牙周細胞、牙髓 細胞系和牙囊細胞系，細胞群體倍增數達150次以上，細胞均表現原有的生物學特性，誘導 培養后都可以表達來源細胞的相關蛋白。Kitagawa等轉染hTERT建立了人成牙骨質細胞 系，細胞倍增達200次以上，細胞分化標志物如堿性磷酸酶、I型膠原等表達穩定；還有國外 研究表明，人體組織細胞在體外培養時會在較短時間內死亡而無法傳代，即在進入衰老期 (Ml期）前就會死亡。但猴腎病毒40(SV40)可以使某些人類細胞發生永生化，可使細胞渡 過Ml期后繼續存活、傳代培養20-30代，然后細胞又會進入危機期（M2期），細胞死亡率增 加并伴染色體異常，分裂的細胞逐漸減少，絕大多數細胞發生死亡。而hTERT可以維持細胞 染色體端粒的穩定，從而使細胞渡過危機期（M2期），可繼續存活、傳代達100-300代以上。 所以用SV40和hTERT同時轉染人離體組織細胞建立永生化細胞系，SV40可以使細胞渡過 Ml期，hTERT可以使細胞渡過M2期，比單獨使用其中之一建立的細胞系更穩定、壽命更長。 但是，至今尚未見有關以猴腎病毒40大T抗原基因（SV40LT)和端粒酶逆轉錄酶催化亞基 (hTERT)同時導入細胞以建立永生化細胞系并用作質控細胞的文獻報道。
[0009] 在產前診斷中，常有一些在診斷報告發出后剩余的病例活細胞，本可用作質量控 制細胞，但因為這類細胞未作特殊處理，很易死亡、難以大規模擴增以供許多實驗室反復多 次使用，所以就難以作為質控細胞使用。


【發明內容】

[0010] 為了解決醫學分子遺傳學診斷實驗室作染色體病診斷中無質控物的問題，本發明 人提出了本發明。
[0011] 本發明的目的是要提供一種用于醫學領域的分子遺傳學診斷實驗室作染色體病 診斷的技術考核、室內質控和室間質評的hTERT和SV40轉導質控細胞及其制備方法。
[0012] 本發明的目的是這樣實現的：以T4DNA連接經BamHI酶切質粒SV40LTag DNA 及載體 pcDNA3. 1 (-)DNA 的產物，構建 SV40LTag-pcDNA3. 1 (-)重組子；并以 Ligation Mix連接經EcoR I和Xho I雙酶切質粒pCIneo-hTERT和載體pLXSNneo的產物，構建 pLXSNneo-hTERT重組子，兩重組子經感受態細胞擴增純化、鑒定后以脂質體導入因臨床診 治需要而作染色體病診斷后并已確診為常見染色體數目異常之一的21-三體、18-三體、13 三體、X或Y染色體異常的剩余的呈貼壁對數生長的原代或傳代活細胞，使重組子與細胞的 DNA整合，以G418篩選整合有重組子的細胞，作傳代擴增后凍存，然后取這些常見染色體數 目異常的細胞，按質控所需比例混合，使原先每例細胞只有1種染色體數目異常轉變為含 有一定比例的2種至5種或多種染色體數目異常的嵌合體質控細胞，集中保存備用。
[0013] 本發明以因臨床診治需要而作染色體病診斷后并已確診為常見染色體數目異常 之一的21-三體、18-三體、13三體、X或Y染色體異常的剩余的呈貼壁生長的原代或傳代活 細胞為原始細胞，標本易得（如2012年本室發現21-三體43例、18-三體28例、13三體7 例、X染色體數目異常15例、Y染色體數目異常12例）且將廢棄的剩余細胞轉化為有效的 質控細胞；以轉基因同時導入SV40LTag-pcDNA3. 1 (-)和pLXSNneo-hTERT重組質粒而建成 的質控細胞具有永久生存、無限擴增的性能，可按需復制足夠的細胞系以滿足質控要求；將 5種各具單一染色體數目異常的細胞按質控所需比例混合后，使原先每例細胞僅有單一染 色體數目異常轉變為一定比例的2種至5種染色體數目異常的易誤診的嵌合體質控細胞， 從而增加了鑒別診斷、染色體嵌合體診斷的難度和復雜性，以疑難病例考核診斷水平、作室 內質控和室間質評，對及時發現質量問題、制定改進預案、提高診斷水平具有顯著的效果。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1是本發明制備的一種21-三體羊水組織細胞（代表性細胞）的質控細胞。
[0015] 圖2是本發明提出的5種染色體數目異常細胞等比例混合的質控細胞的熒光原位 雜交結果模擬圖。
[0016] 如圖1，細胞傳代至第150代、培養至第3天時，呈圓形、梭形、貼壁生長，細胞生長 匯合率已達45%。
[0017] 如圖2,包含有5個細胞，其中細胞1為18-三體細胞，1. 1、1. 2、1. 3各代表1條18 號染色體，比正常細胞多了 1條18號染色體；細胞2為少1條性染色體的細胞，2. 1代表1 條X染色體，正常細胞應還有1條X染色體或1條Y染色體；細胞3為多1條Y染色體的 細胞，3. 1、3. 2各代表1條Y染色體，正常細胞只有1條Y染色體；細胞4為13-三體細胞， 4. 1、4. 2、4. 3各代表1條13號染色體，細胞內多了 1條13號染色體，正常細胞為2條13號 染色體；細胞5為21-三體細胞，5. 1、5. 2、5. 3各代表1條21號染色體，細胞內多了 1條21 號染色體，正常細胞為2條21號染色體。

【具體實施方式】
[0018] 1、原始細胞：所用的原始細胞來源于因臨床診治需要而作染色體病診斷后并已確 診為常見染色體數目異常之一的21-三體、18-三體、13三體、X或Y染色體異常的剩余的 呈貼壁生長的原代或傳代活組織細胞，其原代或傳代活組織細胞也可以涉及染色體結構異 常的活組織細胞或除5種常見染色體數目異常以外的第1號至第22號染色體數目異常活 組織細胞。細胞類型為胎兒羊水、絨毛組織等細胞。
[0019] 2、SV40LT和hTERT的提取：（1)酶切SV40LT和hTERT :①酶切SV40LT :從市售購 買含有大T抗原基因的SV40冰凍干粉或SV40質粒，溶解于適量的H20或TE緩沖液中，力口 2uL10X酶切緩沖液、18uL H20和限制性內切酶BamH I(l-5U/ugDNA)，37°C溫育lh，75°C加 熱15min，滅活酶，加入5uL電泳加樣緩沖液（也可通過加入0. 5mol/L EDTA)終止反應以備 電泳。②酶切hTERT :hTERT位于質粒pClneo-hTERT的EcoRI與Sal I位點之間，pLXSNneo 載體多克隆位點（MCS)含EcoRI與Xhol酶切位點。從市售購買pCIneo-hTERT質粒，溶解 于適量的超凈H 20或TE緩沖液中，加2uL10X酶切緩沖液和18uL H20,加入限制性內切酶 EcoR I和Xho I各0. 5ul，37°C溫育lh，75°C加熱15min，滅活酶，加入5uL電泳加樣緩沖液 (也可通過加入0. 5mol/L EDTA)終止反應，按常規PCR法擴增hTERT后，收取擴增物以備 電泳。（2)SV40LT和hTERT電泳：① SV40LT(SV40DNA)電泳：取電泳級瓊脂糖以電泳緩沖液 配成10%瓊脂糖凝膠，倒入已封好的凝膠灌制平臺上，插上樣品梳，待膠凝固后從制膠平臺 上除去封帶，拔出梳子，放入加有足夠電泳緩沖液的電泳槽中，緩沖液高出凝膠表面約1mm， 用適量的10X加樣緩沖液制備DNA樣品，然后用移液器將樣品加入樣品孔中，并同時做合 適的DNA分子量標準對照物，接通電極，使DNA向陽極移動，在1-lOV/cm凝膠的電壓下電泳 至足夠分離DNA片段的距離時，關閉電源。②hTERT電泳：取電泳級瓊脂糖以電泳緩沖液配 成10%瓊脂糖凝膠，倒入已封好的凝膠灌制平臺上，插上樣品梳，待膠凝固后從制膠平臺上 除去封帶，拔出梳子，放入加有足夠電泳緩沖液的電泳槽中，緩沖液高出凝膠表面約1mm，用 適量的10X加樣緩沖液制備hTERT酶切樣品，然后用移液器將樣品加入樣品孔中，并同時 做合適的標準對照物，接通電極，使hTERT向陽極移動，在l-10V/cm(80V)凝膠的電壓下電 泳至足夠分離hTERT片段的距離時（30min)，關閉電源。（3) SV40LT和hTERT純化與回收： ① SV40LT純化與回收：從瓊脂糖中分離出約2600bp SV40大T抗原DNA :在300-360nm長波 紫外光源下（使用長波紫外光源以防止DNA損傷）將含目標DNA片段的凝膠條帶切下裝入 透析袋中，向透析袋內加入2ml電泳緩沖液，使之浸沒凝膠，并排空汽泡，將透析袋水平放 入電泳槽（長度方向與電泳平行），加入適量緩沖液將透析袋浸沒（約6-7mm)，接通電源， 150伏電洗，在紫外燈下觀察待DNA全部移出凝膠，改變電場方向繼續通電1分鐘，從透析袋 中吸出緩沖液于l -5ml Eppendorf管中，加入1. 5倍體積正丁醇，混勻抽提去EB，在臺式離 心機上最高速2分鐘，吸去上層正丁醇溶液，如此重復二次，在下層DNA的溶液中加入等體 積酚氯仿（2個）抽提2次，上清液轉入到另一 Eppendorf管中加入1/10倍體積3M NaAc、 2倍體積預冷無水乙醇，于20°C過夜，12000g，4°C下離心10分鐘，得DNA沉淀，棄上清，加入 70%乙醇洗滌2次后棄干乙醇，加入50μ1 TE溶解DNA。此外，還可用低熔點瓊脂糖凝膠 法、DNA濾膜插片法等將目的DNA片段從凝膠中分離、純化出來。②hTERT純化與回收：從 瓊脂糖中分離hTERT條帶：在長波紫外光源下將含目標hTERT片段的凝膠條帶切下裝入透 析袋中，向透析袋內加入2ml電泳緩沖液，使之浸沒凝膠，并排空汽泡，將透析袋水平放入 電泳槽（長度方向與電泳平行），加入適量緩沖液將透析袋浸沒（約6-7mm)，接通電源，150 伏電洗，在紫外燈下觀察待hTERT全部移出凝膠，改變電場方向繼續通電1分鐘，從透析袋 中吸出緩沖液于l -5ml Eppendorf管中，加入1. 5倍體積正丁醇，混勻抽提去EB，在臺式離 心機上最高速2分鐘，吸去上層正丁醇溶液，如此重復二次，自下層hTERT的溶液中加入等 體積酚氯仿（2個）抽提2次，上清轉入另一 Eppendorf管中加入1/10倍體積3M NaAc、2 倍體積預冷無水乙醇，于20°C過夜，12000g，4°C下離心10分鐘，得hTERT沉淀，棄上清，力口 入70%乙醇洗滌2次后棄干乙醇，加入50 μ 1 TE溶解hTERT。此外，還可用低熔點瓊脂糖 凝膠法、hTERT濾膜插片法等將目的hTERT片段從凝膠中分離、純化出來。
[0020] 3、SV40LT 和 hTERT 分別與載體 pcDNA3. 1 和 pLXSNneo 構建重組子：（1) SV40LT/ pcDNA3. 1重組子的構建：取9 μ 1上述DNA成份（0. 1-5 μ g)、10 μ 12 X連接緩沖液、 1 μ 110mmol/LATP、T4DNA連接酶（20?500粘性末端單位）或大腸桿菌DNA連接酶、 pcDNA3. 1 空載體混合，15°C溫育 24h，構建成 SV40LT/pcDNA3. 1 重組子。（2)pLXSNne〇-hTERT 重組子的構建：取9 μ 1上述純化的hTERT成份（0. 1-5 μ g)、1 μ 110mmol/L ATP、10ul Ligation Mix或大腸桿菌DNA連接酶、2ul pLXSNneo空載體混合，15°C溫育24h，構建 pLXSNneo-hTERT 重組子。
[0021] 4、重組子的純化、擴增、鑒定：（l)SV40LT/pcDNA3. 1重組子的擴增、分離與鑒定： ①大腸桿菌感受態的制備：其基本方法是用冰預冷的CaCl2或多種2價陽離子等處理細菌， 使之進入感受態得以轉化，用CaCl 2制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態細胞，常用于成批制 備感受態細菌，本法適用于大多數大腸桿菌菌株，操作過程簡述如下：從37°C培養16?20h 的新鮮平板中挑取一個單菌落（如大腸桿菌DH52)，或lml新鮮的16?20h過夜培養物，轉 到一個含有l〇〇mlLB培養基的1L或500ml燒瓶中，于37°C劇烈振搖培養約2?3h(旋轉 搖床200?300r/min)，每隔20?30min測量0D600值~ 0. 4,在無菌條件下將細菌轉移到 一個，用冰預冷的50ml聚丙烯離心管中，在冰上放置10?20min后，于4°C用SorvallGS2 轉頭（或與其離心管相配的轉頭）以4000r/min離心10min，以回收細胞，倒數培養液，將 管倒置lmin以使最后殘留的痕量培養液流盡，以10ml用冰預冷的0. lmMCaCl2重懸每份沉 淀，放于冰上，于4°C用SorvallGS3轉頭（或與其相應的轉頭）以4000r/min離心10min，以 回收細胞，倒出培養液，將管倒置lmin以使最后殘留的痕量培養液流盡，每50ml初始培養 物用2ml冰預冷的0. 1M CaCl2重懸每份沉定，此時，可以迅速將細胞分裝成小份，液氮中冰 凍，-70°C貯存備用，用冷卻的無菌吸頭從每種感受態細胞懸液中各取200 μ 1轉移到無菌 的微量離心管中，每管加 DNA或連接反應混合物（體積彡10 μ 1，DNA彡50ng)，輕輕旋轉以 混勻內容物，在冰中放置30min，將離心管放到預加溫到40°C的循環水浴中的試管架上，放 置90s?2min，不要搖動試管，快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻1?2min，每離心管加 800μ 1S0C培養基，用水浴將培養基加溫到37°C，然后將管轉移到37°C搖床上，溫育45min 使細菌復蘇，并且表達質粒編碼的抗生素抗性標記基因，將適當體積（每個90mm平板可達 200 μ 1)已轉化的感受態細胞轉移到含200mmol/LMgS04和相應抗生素的S0B培養基上，將 平板置于室溫至液體被吸收，倒置平皿，于37°C培養，12?16h后可出現菌落。②重組子 的篩選、擴增與提取：用無菌牙簽或滅菌接種針挑選單個菌落接種于5mL無菌的LB培養基 或豐富培養基（如超級肉湯或TB超級肉湯培養基）中，培養過夜后，再加入到500mL含LB 培養基（含有適當抗生素）的2L燒瓶中，再于37°C培養至飽和狀態（0D6C4,為提高產 量，應采用表面積較大及帶折流板的燒瓶以盡量增大通氣度，振搖速度應大于400r/min)， 于4°C，6000g離心lOmin，用4mL GTL溶液重懸沉淀，并轉移到一個容積彡20mL的高速離心 管中（細菌沉淀可以在-20°C或-70°C無限期保存），加入lmL新配的含25mg/mL溶菌酶的 GTE溶液，重懸沉淀，于室溫放置lOmin，加入10mL新配NaOH/SDS溶液，并且輕輕混勻直至 液體變得均一、清亮而粘稠，于冰上放置l〇min，加入7. 5mL乙酸溶液，用吸管輕輕攪拌直至 粘稠度下降并形成大的沉淀，于冰上放置l〇min，于4°C，20000g離心lOmin，將上清輕輕倒 入至另一個干凈的離心管中，如果有可見的飄浮物可用數層紗布過濾，加入0. 6倍體積的 異丙醇，顛倒混勻，室溫放置5?lOmin，于室溫，1500g離心lOmin，加入2II1L701%乙醇輕輕 洗滌沉淀，然后短暫快速離心，吸去乙醇，并真空干燥（沉淀可在4°C長期保存）。③重組子 的鑒定：上述從感受態大腸桿菌中提取的DNA(含SV40T/pcDNA3. 1)，同上法用限制性內切 酶BamH I進行酶切，10g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，獲得大小約2600bp及5600bp的2條帶， 前者符合GenBank中SV40T片段的大小。（2)pLXSNne〇-hTERT重組子的純化、擴增、鑒定 ： ①大腸桿菌感受態的制備：其基本方法是用冰預冷的CaCl2或多種2價陽離子等處理細菌， 使之進入感受態得以轉化，用CaCl 2制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態細胞，常用于成批制 備感受態細菌，本法適用于大多數大腸桿菌菌株，操作過程簡述如下：從37°C培養16?20h 的新鮮平板中挑取一個單菌落（如大腸桿菌DH52)，或lml新鮮的16?20h過夜培養物， 轉到一個含有lOOmlLB培養基的1L或500ml燒瓶中，于37°C劇烈振搖培養約2?3h(旋 轉搖床200?300r/min)，每隔20?30min測量0D600值~ 0. 4,在無菌條件下將細菌轉移 到一個，用冰預冷的50ml聚丙烯離心管中，在冰上放置10?20min，于4°C用SorvallGS2 轉頭（或與其離心管相配的轉頭）以4000r/min離心10min，以回收細胞，倒數培養液，將 管倒置lmin以使最后殘留的痕量培養液流盡，以10ml用冰預冷的0. lmMCaCl2重懸每份沉 淀，放于冰上，于4°C用SorvallGS3轉頭（或與其相應的轉頭）以4000r/min離心10min， 以回收細胞，倒出培養液，將管倒置lmin以使最后殘留的痕量培養液流盡，每50ml初始培 養物用2ml冰預冷的0. 1M CaCl2重懸每份沉定，此時，可以迅速將細胞分裝成小份，液氮中 冰凍，-70°C貯存備用。②以感受態大腸桿菌純化和擴增pLXSNneo-hTERT重組子：用冷卻的 無菌吸頭從每種感受態細胞懸液中分別取200 μ 1轉移到無菌的微量離心管中，在每管中 加 DNA或連接反應混合物（體積< 10μ 1，DNA< 50ng)，輕輕旋轉以混勻內容物，在冰中放 置30min，將離心管放到預加溫到40°C的循環水浴中的試管架上，放置90s?2min，不要搖 動試管，快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻1?2min，每離心管加800 μ 1S0C培養基，用 水浴將培養基加溫到37°C，然后將管轉移到37°C搖床上，溫育45min使細菌復蘇，并且表達 質粒編碼的抗生素抗性標記基因，將適當體積（每90mm平板可達200μ1)已轉化的感受態 細胞轉移到含200mmol/LMgS04和相應抗生素的SOB培養基上，將平板置于室溫至液體被吸 收，倒置平皿，于37°C培養，12?16h后可出現菌落。③篩選、擴增重組子：用無菌牙簽或滅 菌接種針挑選單個菌落接種于5mL無菌的LB培養基或豐富培養基（如超級肉湯或TB超級 肉湯培養基）中，培養過夜后，再加入到500mL含LB培養基（含有適當抗生素）的2L燒瓶 中，再于37°C培養至飽和狀態（0D 6C4,為提高產量，應采用表面積較大及帶折流板的燒 瓶以盡量增大通氣度，振搖速度應大于400r/min)，于4°C，6000g離心10min，用4mL GTL溶 液重懸沉淀，并轉移到一個容積彡20mL的高速離心管中（細菌沉淀可以在-20°C或_70°C 無限期保存），加入lmL新配的含25mg/mL溶菌酶的GTE溶液，重懸沉淀，于室溫放置lOmin， 加入10mL新配NaOH/SDS溶液，并且輕輕混勻直至液體變得均一、清亮而粘稠，于冰上放置 lOmin，加入7. 5mL乙酸溶液，用吸管輕輕攪拌直至粘稠度下降并形成大的沉淀，于冰上放 置lOmin，于4°C，20000g離心lOmin，將上清輕輕倒入至另一個干凈的離心管中，如果有可 見的飄浮物可用數層紗布過濾，加入0. 6倍體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫放置5?lOmin， 于室溫，1500g離心lOmin，加入2mL70%乙醇輕輕洗滌沉淀，然后短暫快速離心，吸去乙醇， 并真空干燥（沉淀可在4°C長期保存）。④重組質粒的鑒定與擴增：挑取平皿上的單菌落， 接種于3ml含100ug/ml氨芐青霉素 LB培養基中，37°C，250r/min搖床中培養，14h后收集 培養物，4°C、10000r/min離心5min，按試劑盒說明書小量提取并純化重組質粒；以EcoRI 和Hindlll雙酶切重組質粒反應體系：限制性內切酶各0. 5ul、10Xbuffer2ul、重組質粒 1〇111、加水補足至2〇111，371：酶切111。酶切產物于80￥電壓條件下進行0.8%瓊脂糖電泳， 時間30min，凝膠成像系統拍照；按常規測定重組質粒的序列；重組質粒經酶切、測序鑒定 準確后，將含有該質粒的細菌接種至LB培養液中，擴增培養，按大劑量質粒抽提試劑盒說 明書進行大劑量質粒抽提純化，紫外分光光度計測定質粒濃度及純度后備用。
[0022] 5、重組子SV40LT/pcDNA3. 1和pLXSNneo-hTERT導入染色體異常組織細胞及其陽 性克隆的篩選與擴增：①染色體異常組織細胞的收集與培養：以無菌操作提取在作其他實 驗或其他檢查后多余、廢棄的染色體異常組織細胞，以細胞終濃度約為IX 105/mL備用，取 上述呈單個分散的細胞或經處理后成為單個分散的細胞接種于含5?10nm〇l/L胰島素、 20%胎牛血清的RPMI 1640液中或接種于含20%胎牛血清、5?10nm〇l/L胰島素的低糖 DMEM細胞培養基中，置于37°C，體積分數5% C02培養箱內，細胞貼壁培養約3?4天、細胞 形態為梭形、小園形細胞不到10%、貼壁細胞的匯合率達75%?85%、處于剛進入對數生 長期時，即考慮收集培養細胞，先吸干凈培養瓶中的培養液，加入l_2ml0. 01 %的膠原酶II 液（以消化液能覆蓋整個瓶底為準），靜置2-10min (顯微鏡下動態監測），吸去膠原酶II 液，加入低糖DMEM或RPMI 1640培養液，用吸管吸取瓶內培養液，反復吹打瓶壁細胞，形成 細胞懸液，轉入離心管離心沉淀，去上清液，細胞沉淀用上述培養液清洗2次后，制成懸液， 用作重組子導入。②SV40T/pcDNA3. 1的導入：在上法分離所得細胞中，選用脂質體轉染法， 將上述2 X 105個細胞接種于35mm培養皿中，在37°C C02培養箱培養24?36h，使細胞生成 單層、細胞形態為梭形、尚未見或僅見少于10%小園形細胞、貼壁細胞的匯合率達55%? 65%、處于將進入或剛進入對數生長期時，即轉染重組子SV40T/pcDNA3. 1，在1. 5ml微量離 心管中制備下列溶液：管4，將5￥4017?(^嫩3.1溶于10(^1無血清培養液中；管8，將2(^1 Lipofectamine溶于80 μ 1無血清培養液中，將管A和管B混勻，室溫下置45min，吸去細 胞培養液后，用無血清培養液洗滌細胞2次，在Lip〇f ectamine-SV40T/pCDNA3. 1混合物中 加入lml無血清培養液，輕輕混勻，再滴加至細胞培養皿內，然后加入lml無血清培養液，在 C〇2培養箱培養l〇h，吸出轉染液，加4ml完全培養液繼續培養16h，棄去培養液，更換濃度為 4001^17 1的G418培養液繼續培養，8?10天后選擇單個細胞集落進行亞克隆，擴大培養后 再加大G418濃度到800mg · Γ1，將能在高濃度的G418環境中穩定生長的克隆進行傳代擴 增。
[0023] 6、染色體數目異常組織細胞的傳代、擴增：收集上述經脂質體轉染法導入 SV40LT/pcDNA3. 1和pLXSNneo-hTERT的陽性單克隆細胞集落，以低糖DMEM或RPMI 1640 培養基配成約1 x 105/mL的細胞懸液，接種于數瓶20?50cm2培養瓶中，加入5mL含20mL/ L胎牛血清、10nm〇l/L胰島素的低糖DMEM或RPMI1640培養基，至細胞貼壁生長、匯合率達 80?85%、處于對數生長期的前期時收集細胞，再按上述步驟傳代培養，如此反復傳代接 種、培養，記錄代數并觀察細胞生長特點，以此建立可在體外反復傳代擴增的染色體數目異 常質控細胞。如圖1所示，細胞傳代至第150代、培養至第3天時，呈圓形、梭形、貼壁生長， 其細胞生長匯合率已達45%。細胞傳代至第151代后，生長變慢，貼壁生長稀疏。
[0024] 7、原液質控細胞的制備：⑴原液活質控細胞的制備：取生長狀態良好、處于對 數生長期的不同世代的貼壁細胞，經過消化、終止和離心分離（1200r/min，6min)，用含二 甲亞砜的凍存液0.5?lml重懸細胞，細胞密度為5X10 5個/ml，加入凍存管，經4°C， 0. 5h ;-20°C，2h ;-70°C，過夜，入_196°C液氮凍存。（2)原液固定質控細胞的制備：（1)終止 培養、收獲細胞前2?3h，加入濃度為20 μ g/ml的秋水仙素，每5ml培養基中用7號針頭， 加3?4滴使最終濃度為0. 1 μ g/ml。輕輕搖勻后，再放入恒溫箱內，繼續培養2?3h，以 積累較多停止在中期的分裂象。（2)收獲細胞：由恒溫箱取出培養瓶，以0.25%胰蛋白酶消 化貼壁細胞5分鐘，每次收獲1瓶，用吸管充分吹打培養瓶瓶壁，使細胞全部脫離瓶壁，然后 將細胞液移至錐形離心管內，1500轉/min，離心lOmin，去上清液。（3)低滲處理：加入37°C 預溫的〇.〇75mol/L KC18ml，反復吹打（約一百次）后，置37°C水浴箱中低滲處理25min左 右。（4)預固定：加入新鮮制備固定液lml (甲醇：冰醋酸=3 : 1)，輕輕混勻。（5)離心： 2000轉/min,離心lOmin，吸棄上清液。（6)固定：沿離心管壁慢慢加入固定液8ml，輕輕混 勻，固定l〇min。（7)離心：同上，吸去上清液。（8)再固定：加固定液8ml，混勻，固定lOmin。 (9)離心：同上，吸去上清液。（10)制備原液質控細胞懸液：根據細胞量多少，加入適量固定 液，充分混勻，制成濃度為l〇5/ml的細胞懸液，保存備用。
[0025] 8、應用質控細胞的制備：（1)應用活質控細胞的制備：提取5例在不同時間制備 的、凍存于_196°C液氮中的染色體數目異常的原液活質控細胞，以5例之比均為1 : 1的等 濃度、等體積或細胞數進行混合（如各取lml，混合液總體積為5ml)，制成等比應用活質控 細胞，理論上21-三體、18-三體、13-三體、X和Y染色體數目異常的核型各占20%;另外根 據需要，取1例原液活質控細胞與另外的1例、2例、3例或4例按1 : 0.5、1 : 1、1 : 2、 1 : 3、1 : 4、1 : 5、1 : 6、1 : 7、1 : 8、1 : 9、1 : 10、1 : 20 ?50 的體積比例或細胞數 比例進行混合，制成不等比應用活質控細胞，含有不同類型和比例的染色體數目異常，如某 1例取lml與另1例取50ml混合，則理論上前者的嵌合體比例為2%，后者為98% ;如某1 例取lml與另外1例染色體正常的同濃度細胞懸液50ml混合，則理論上前者的嵌合體比例 為2%。此外，應活質控細胞系還可進行傳代擴增后使用。（2)應用固定質控細胞的制備： 提取5例在不同時間制備的染色體數目異常的原液固定質控細胞，以5例之比均為1 : 1 的等濃度、等體積或細胞數進行混合（如各取lml，混合液總體積為5ml)，制成等比應用固 定質控細胞，理論上21-三體、18-三體、13-三體、X和Y染色體數目異常的核型各占20%; 另外根據需要，取1例原液固定質控細胞與另外的1例、2例、3例或4例按1 : 0.5、1 : 1、 1 : 2、1 : 3、1 : 4、1 : 5、1 : 6、1 : 7、1 : 8、1 : 9、1 : 10、1 : 20 ?50 的體積比例 或細胞數比例進行混合，制成不等比應用固定質控細胞，含有不同類型和比例的染色體數 目異常，如某1例取lml與另1例取50ml混合，則理論上前者的嵌合體比例為2%,后者為 98% ;如某1例取lml與另外1例染色體正常的同濃度細胞懸液50ml混合，則理論上前者 的嵌合體比例為2%。經如此反復傳代擴增和混合不同病例的染色體數目異常細胞所制備 的質控細胞（系），不但數量足夠的多，達到用之不盡，而且使原先一般每份原液活質控細 胞或原液固定質控細胞中只有一種染色體數目異常轉變為具有在同一份應用活質控細胞 或應用固定質控細胞中同時含有多種不同比例的、不同類型的易誤診染色體數目異常的特 征，從而增加了鑒別診斷、染色體嵌合體診斷的難度和復雜性，標本易得且將廢棄的多余細 胞轉化為可用于染色體核型分析的技術考核、室內質控及室間質評，在室內質量控制、室間 質量評價、提高診斷水平的應用中具有顯著的效果。
[0026] 9、染色體數目異常質控細胞庫的建立：將上述在不同時間制備的固定質控細胞 (原液固定質控細胞和應用固定質控細胞）以（甲醇：冰醋酸=3 : 1的）固定液配成濃 度為l〇5/ml的細胞懸液，經分裝、加滿固定液至管口和封口后，按年、月、日的制備日期及 標本來源地址的大寫英文字母編號，集中保存于_20°C，備作染色體數目診斷的質量控制之 用。同時將相應的5種染色體數目異常核型的標準描述、按照年、月、日的制備日期以及標 本來源地址的大寫英文字母編號錄入計算機，使用時從計算機中抽取待用質控細胞編號， 然后從質控細胞庫中找出相應的質控細胞作質量評價；活質控細胞（原液活質控細胞和應 用活質控細胞）以凍存液（5%二甲亞砜、95%胎牛血清）配成濃度為10 5/ml的細胞懸液， 經每管lml分裝后，按年、月、日的制備日期及標本來源地址的大寫英文字母編號，集中保 存于-196°C液氮中，備作染色體數目診斷的質量控制之用。同時將相應的各種染色體數目 異常核型的標準描述、按照年、月、日的制備日期以及標本來源地址的大寫英文字母編號錄 入計算機，使用時從計算機中抽取待用質控細胞編號，然后從質控細胞庫中找出相應的質 控細胞作質量評價
[0027] 10、室內質控中的應用：從計算機中抽取質控細胞編號，然后從質控細胞庫中找出 相應的質控細胞，發送到各實驗室或相關專業技術人員，在收到質控細胞后，作為室內質控 物，與臨床待作染色體數目異常診斷的標本在相同條件下作同步染色體數目診斷。如果質 控細胞的染色體數目診斷結果沒有達到要求，則說明診斷方法的試劑、儀器、操作方法等方 面有問題，應查明原因、重新檢測后報告結果。
[0028] 11、室間質評中的具體應用：
[0029] ①準備質控細胞：取1例或數例質控細胞，按需要的例次或比例混合，混合的質控 細胞株還可經擴增后發放使用。現以5例染色體數目異常質控細胞等比例細胞數混合為 例，每種染色體數目異常的細胞各占20%。然后將質控細胞發送到各受試對象做室間質量 評價。
[0030] ②熒光原位雜交（FISH)檢測質控細胞染色體數目及結果判定：各受試對象收到 質控細胞后，如為活質控細胞系，則可酌情對質控細胞系進行傳代擴增后測試，以增加細 胞數；如為固定質控細胞，則直接測試。試劑采用瑞士雅培制藥有限公司的AneuVysion 試劑盒，含有兩個不同的雜交區域，共完成5條染色體的數目分析：第18號（Spectrum Aqua,青色）、X(Spectrum Green,綠色）、Y(Spectrum Orange,紅色）號染色體為計數探 針（Chromosome Enumerating Probe，CEP)，混合后雜交第 1 個區域；第 13 號（Spectrum Green,淺綠色）和21 (Spectrum Orange,紫紅色）號染色體為區域特異性探針（Locus Specific Identifier，LSI)，混合后雜交第2個區域。方法是取13和21號染色體為位點 特異探針，18、X和Y染色體為著絲粒探針，將質控細胞系（與實驗室被檢標本）同步，經 2000r/min離心lOmin，去上清，留沉淀0. 2ml，離心管中加入4ml膠原酶37°C溫浴30min， 2000r/min離心lOmin，去上清，然后加入5ml預溫的15mol/L KC1，在37水浴中低滲25min， 2000r/min離心lOmin，去上清。加入新配制的固定液（甲醇：冰醋酸=3 : 1)固定lOmin， 離心2000r/min離心lOmin去上清，反復兩次。滴片，自然干燥老化。將制備好的標本片自 冰柜中取出，依次放人70 %、85 %、100 %乙醇中脫水，室溫干燥，預處理好的玻片置73 °C， 70%甲酰胺中5min。在暗室中將兩種探針混合液各10 μ 1加在玻片的靶區域，蓋上蓋玻片， 避免產生氣泡，封片膠將蓋玻片封好，置暗濕盒中42°C雜交過夜，清洗，在高倍鏡下觀察雜 交效果，每例標本計數60?100個細胞，記錄雜交信號數目并采集圖像，要求細胞核膜必須 完整，核內雜交信號明亮清晰無重疊，信號彌散及微弱均不作統計。
[0031] ③測試結果：經探針雜交后，細胞內的18號染色體顯示青色的點，每條18號顯示 1個青色的點，2條則顯示2個青色的點，3條則顯示3個青色的點；細胞內X(女性）染色 體顯示綠色的點，每條X染色體顯示1個綠色的點，2條則顯示2個綠色的點，3條則顯示3 個綠色的點；細胞內Y(男性）染色體顯示紅色的點，每條Y染色體顯示1個紅色的點，2條 則顯示2個紅色的點，3條則顯示3個紅色的點；細胞內的13號染色體顯示淺綠色的點，每 條13號顯示1個淺綠色的點，2條則顯示2個淺綠色的點，3條則顯示3個淺綠色的點；細 胞內的21號染色體顯示紫紅色的點，每條21號顯示1個紫紅色的點，2條則顯示2個紫紅 色的點，3條則顯示3個紫紅色的點。
[0032] 圖2為5種染色體數目異常質控細胞等濃度等量混合、制片、熒光原位雜交所得結 果模擬圖，如圖2所示，細胞1為18-三體細胞，1. 1、1. 2、1. 3各代表1條18號染色體，細胞 內多了 1條18號染色體，有3個青色的點，正常細胞為2條18號染色體、2個青色的點；細 胞2為少1條性染色體的細胞，2. 1代表1條X染色體，只有1個綠色的點，正常細胞應還有 1條X染色體（1個綠色的點）或1條Y染色體（1個紅色的點）；細胞3為多1條Y染色體 的細胞，3. 1、3. 2各代表1條Y染色體，正常細胞只有1條Y染色體、1個紅色的點；細胞4 為13-三體細胞，4. 1、4.2、4. 3各代表1條13號染色體，細胞內多了 1條13號染色體，有3 個淺綠色的點，正常細胞為2條13號染色體、2個淺綠色的點；細胞5為21-三體細胞，5. 1、 5. 2、5. 3各代表1條21號染色體，細胞內多了 1條21號染色體，有3個紫紅色的點，正常細 胞為2條21號染色體、2個紫紅色的點。
[0033] ④結果評價：各受試實驗室將結果包括染色體數目異常的種類、比例回報室間質 評組織者，由組織者對各室結果作統一評比成績，找出誤診原因、討論改正措施，以動態發 現質量問題、加強質量管理、提高診斷質量。
【權利要求】
1. 一種用于醫學分子遺傳學診斷實驗室的hTERT和SV40轉導質控細胞及其制備方法， 其主要特征是以T4DNA連接重組子SV40LTag-pcDNA3. 1(_)和pLXSNneo-hTERT，以脂質體導 入常見染色體數目異常組織細胞，G418篩選整合有重組子的細胞作傳代擴增后凍存，臨用 時按質控所需比例混合，使原先每例細胞只有1種染色體數目異常轉變為含有一定比例、 多種組合染色體數目異常嵌合體質控細胞，增加了鑒別診斷、嵌合體診斷的難度，原始細胞 易得且將廢棄的多余細胞轉化為具有永久生存、無限擴增、可按需復制足夠細胞以滿足質 控要求的質控細胞，以此人為制備的疑難質控細胞作常見染色體數目異常檢測室間質評和 室內質控，對及時發現和解決質量問題、提高診斷水平具有重要的意義。
2. 根據權利要求1所述的一種用于醫學分子遺傳學診斷實驗室的hTERT和SV40轉導 質控細胞及其制備方法，其特征是常見染色體數目異常包含21-三體、18-三體、13三體、X 和Y染色體數目異常5類。
3. 根據權利要求1所述的一種用于醫學分子遺傳學診斷實驗室的hTERT和SV40轉導 質控細胞及其制備方法，其特征是hTERT和SV40同時與染色體數目異常組織細胞整合制成 了能傳代至第150代、培養至第3天、呈圓形、梭形、貼壁生長，細胞生長匯合率達45%的嵌 合體質控細胞。
4. 根據權利要求1所述的一種用于醫學分子遺傳學診斷實驗室的hTERT和SV40轉導 質控細胞及其制備方法，其特征是按質控所需比例混合包含： 以5例染色體數目異常原液活質控細胞之比均為1 : 1的等濃度、等體積或細胞數進 行混合（如各取lml，混合液總體積為5ml)，制成等比應用活質控細胞株，理論上21-三體、 18-三體、13-三體、X和Y染色體數目異常的核型各占20% ; 以1例原液活質控細胞與另外的1例、2例、3例或4例按1 : 0. 5、1 : 1、1 : 2、1 : 3、 1 : 4、1 : 5、1 : 6、1 : 7、1 : 8、1 : 9、1 : 10、1 : 20?50的體積比例或細胞數比例進 行混合，制成不等比應用活質控細胞，含有不同類型和比例的染色體數目異常； 以5例染色體數目異常的原液固定質控細胞，以5例之比均為1 : 1的等濃度、等體積 或細胞數進行混合（如各取lml，混合液總體積為5ml)，制成等比應用固定質控細胞，理論 上21-三體、18-三體、13-三體、X和Y染色體數目異常的核型各占20% ; 以1例原液固定質控細胞與另外的1例、2例、3例或4例按1 : 0. 5、1 : 1、1 : 2、 1 : 3、1 : 4、1 : 5、1 : 6、1 : 7、1 : 8、1 : 9、1 : 10、1 : 20 ?50 的體積比例或細胞數 比例進行混合，制成不等比應用固定質控細胞，含有不同類型和比例的染色體數目異常，如 某1例取lml與另1例取50ml混合，則理論上前者的嵌合體比例為2%，后者為98%。
5. 根據權利要求1、4所述的一種用于醫學分子遺傳學診斷實驗室的hTERT和SV40轉 導質控細胞及其制備方法，其特征是每1份質控細胞包含有1?5種不同的染色體數目異 常，可同時用于相對應的1?5種染色體數目異常檢測的質量控制，無需備用多份質控物， 使用方便、經濟。
6. 根據權利要求1、4所述的一種用于醫學分子遺傳學診斷實驗室的hTERT和SV40轉 導質控細胞及其制備方法，其特征是每1份質控細胞由1?5種不同比例的染色體數目異 常細胞組合而成，能設定染色體數目異常檢出率（百分比）的界限和質量指標；5種染色體 數目異常質控細胞之間以及與正常細胞之間可配制2%?100%的某1種或數種染色體數 目異常的嵌合體質控細胞，能反映、控制低比例染色體數目異常的檢測質量，或達到與低比 例染色體數目異常的實際病例的同步檢測，具有更有效的質量控制和質量評價效果。
7. 根據權利要求1所述的一種用于醫學分子遺傳學診斷實驗室的hTERT和SV40轉導 質控細胞及其制備方法，其特征是染色體數目異常永生化質控細胞庫包含：以固定液（甲 醇：冰醋酸=3 : 1的）為媒介的、-20°C保存的、按年、月、日的制備日期及標本來源地址 的大寫英文字母編號的、細胞濃度為l〇5/ml的、由原液固定質控細胞和應用固定質控細胞 構成的固定質控細胞；以凍存液（5%二甲亞砜、95%胎牛血清）為媒介的、-196°C液氮保存 的、按年、月、日的制備日期及標本來源地址的大寫英文字母編號的、細胞濃度為l〇 5/ml的、 由原液活質控細胞系和應用活質控細胞系構成的活質控細胞系。
8. 根據權利要求1所述的一種用于醫學分子遺傳學診斷實驗室的hTERT和SV40轉導 質控細胞及其制備方法，其特征在于，涉及以染色體結構異常、除5種常見染色體數目異常 以外的第1號至第22號染色體數目異常的細胞為原始細胞所制備的質控細胞株。
【文檔編號】C12N5/10GK104059885SQ201310111745
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2013年3月19日 優先權日:2013年3月19日
【發明者】翁炳煥 申請人:翁炳煥