專利名稱：真菌固體發酵法的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物發酵領域，提供了一種用于真菌發酵培養，尤其是固體發酵培養的培養基，以及對真菌的發酵工藝進行了優化。
背景技術：
固體發酵(solid-state fermentation, SSF)是在指沒有或幾乎沒有自由水存在下，在有一定濕度固態基質中，用一種或多種微生物進行的一個生物反應過程(Singhaniaet al., 2009)。從生物反應過程的角度考慮，固態發酵是以氣相為連續相的生物反應過程，更為具體的，我們可以認為固體發酵是一種在培養基為固體微粒的情況下進行利用的一種發酵手段(Mitchell et al.，2000b)。固體發酵與液體發酵相比有許多顯著的優點:培養基更為便宜、低能耗、投入成本低、更容易控制發酵體積、產生的廢水較少(Pandey Aet al., 2000; Pandey A et al.，2008)。以培養基的用料為例，用于固體發酵的培養基比較單純，一般來說，例如谷物類、小麥麩、小麥草、大宗谷物或農產品等均可被使用，所以發酵原料成本較經濟。對于大多數的微生物而言，其生長的環境并沒有大量的自由水存在。即便是海洋中的微生物，其中有超過98%的種類是生長于水下表層的固體介質中的，對于真菌而言，所有已知的真菌中只有不到1%的種類是在海洋中發現的(Carlile & Watkinson, 1994;Kelecom, 2002)。也正是因為如此，固體發酵能夠較好地模擬真菌的生長環境，從而適用于真菌的生物發酵。到目前為止，有許多人研究了影響固體發酵進程的生物化學和工程學的因素(Mitchell et al., 2000a, 2000b; Pandey, 2003)，但是 SSF 中的許多技術問題仍然沒有得到解決(H01ker et al.，2004)。即便如此，SSF在生物技術中的運用已經很廣泛了(Raimbault, 1998; Pandey et al., 2000, 2001)。在許多綜述中可以查到運用SSF技術生產的一些生物 產品或代謝物，如次級代謝產物(Balakrishnan & Pandey,1996; Robinson et al., 2001)、黃曲霉素(Barrios-Gonzalez & Tomasini, 1996)、工程酶(Pandey et al., 1999)、細菌酶(Babu & Satyanarayana, 1996)、淀粉糖化酶(Selvakumar et al., 1998)、纖維素酶(Cen & Xia, 1999)、中國食品(Han et al.,2001)、木質素的生物轉化(Tengerdy & Szakacs, 2003)、食用菌種植和天然香料的生產(Wang, 1999)、富蛋白食物(Nigam & Singh, 1996)等。關于固體發酵工藝的優化，一般情況下，都會從溫度、培養基、初始pH、含水量、接種量、種齡、發酵時間等角度考慮，而關于培養基，更是涉及了碳源、氮源和無機鹽的選擇(Davood Mazaheri et al., 2012; Tamires Carvalho dos Santos et al., 2012;Madhuri Narra et al., 2012; Fatma Chaari et al., 2012)。以含水量為例，在蛋白酶和脂肪酶的生產中，高含水量會降低培養基質的多孔性，從而妨礙氣體的交換，而低含水量則會減少微生物的生長，從而使酶的產量下降(Mahanta et al.，2008)。再以發酵時間(發酵進程)對固體發酵的影響為例，Biazus等人在采用玉米麥芽糖進行研究的時候發現，發酵開始時，產物的量很低，而隨后產物的量就迅速上升直到達到最大值，在達到最大產物量后，產物的生成就受到了抑制，并且產物的活性也會下降(Biazus et al.，2006)。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種真菌固體發酵法，采用該真菌固體發酵法能夠快速有效地得到產氣霉屬真菌固體發酵的產物。為了解決上述技術問題，本發明提供了一種真菌固體發酵法，將真菌按照0.1~0.3% (質量％)的接種量接種至真菌固體發酵培養基上，在黑暗中于23 28°C的發酵溫度下發酵5 10天；真菌固體發酵培養基由以下成分組成:熟小米100g、珍珠巖19 21g和營養液24 26ml ；熟小米的制備方法為:在IOOg生小米中加入55飛5ml 土豆汁，用滅菌鍋于12(Tl22°C加熱1Γ16分鐘，得熟小米；營養液的制備方法為:將葡萄糖0.5 3g、脫脂大豆粉5 7g,蛋白胨(peptone)I 5g，磷酸二氫鉀0.3 0.55g，硫酸鎂0.15g，用25 50ml的土豆汁溶解后調節pH至6，得營養液(呈糊狀)。作為本發明的真菌固體發酵法的改進:將真菌按照0.2^0.3% (質量％)的接種量接種至真菌固體發酵培養基上，在黑暗中于24 26°C的發酵溫度下發酵5 8天；真菌固體發酵培養基由以下成分組成:熟小米100g、珍珠巖20g和營養液25ml ；熟小米的制備方法為:在IOOg生小米中加入60ml 土豆汁，用滅菌鍋于121°C加熱15分鐘，得熟小米；營養液的制備方法為:將葡萄糖0.5g，脫脂大豆粉7g，蛋白胨1.0g,磷酸二氫鉀0.55g，硫酸鎂0.15g，用25ml的土豆汁溶解后調節pH至6，得營養液。作為本發明的真菌固體發酵法的進一步改進:營養液的制備方法中用濃度為
4.8 5.2mol/L (較佳為5 mol/L)的NaOH溶液調節pH。作為本發明的真菌固體發酵法的進一步改進:真菌為產氣霉屬真菌。具體而言:真菌為植物內生真菌。例如可選用保藏號為CGMCC 2864的內生真菌Muscodor sp.ZJLQ070。作為本發明的真菌固體發酵法的進一步改進:接種量為0.2^0.3%，發酵溫度為25°C，發酵時間為5 8天。作為本發明的真菌固體發酵法的進一步改進:用于接種的Z幾Q070菌株的種齡為6天。在本發明中，土豆汁采用常規方法制備而得，即，土豆汁的制備方法為:將200g新鮮去皮土豆切塊，用90(T990 ml的水煮沸30min后用4層紗布過濾，濾液自然冷卻至室溫后用蒸懼水定容至IL備用，pH為自然pH。本發明的真菌固體發酵培養基的制備方法為:將營養液、熟小米和珍珠巖均勻攪拌后，于121°C高壓(1.05 X IO5Pa)滅菌鍋滅菌20分鐘后備用。在本發明中:用于制備真菌固體發酵培養基的各項成分可通過市購的方式獲得，例如，脫脂大豆粉可購自河北省秦皇島金海食品工業有限公司生產的食品級的低溫脫脂大豆粉；蛋白胨可購自生工公司生產的PN5247型號的P印tone。本發明包括優化培養基，溫度，種齡和接種量。本發明采用正交設計和單因素實驗設計，分別從培養基配方、培養基營養液pH、發酵溫度、接種量、種齡這五個方面全面探索了ZJLQ070菌株的固體發酵工藝。此外，本發明采用DNS法、鑰酸銨比色法、中性甲醛法、質量差法測定了固體發酵過程中相關生物量參數(浸出液中的還原糖、總糖、溶磷和氨基氮及氨氮，質量損失率，含水量)在不同發酵時間的水平，最終得到了這些相關生物量參數隨發酵進程進行改變的發酵曲線。通過對發酵曲線的綜合分析推測在搖瓶小量固體發酵時，菌株的對數生長期開始于發酵起始后的第5-6天，結束于發酵起始后的第8天。本發明中涉及的真菌，尤其是植物內生真菌，是定殖于健康植物組織中并不表現出病害癥狀的一類真菌，這些內生真菌從分類上來講，主要是一些子囊菌，也有一些是擔子菌和卵菌。它們能與植物建立起互利共生的互作關系。這種共生互作為寄主植物帶來的好處是使植物增加了對病原微生物的抵抗能力，促進了植物的生長和對逆境的忍受能力。本發明中涉及的產氣霉屬Muscodor內生真菌，已知分布于中美洲、南美洲、東亞、東南亞和澳大利亞的熱帶、亞熱帶植物中。它們的一個重要特征就是能夠產生易揮發的有機化合物(volatile organic compounds, VOCs),這些VOCs能夠抑制甚至殺死許多的植物病原菌、線蟲甚至昆蟲和一些與人類疾病有關的病原菌。真菌例如選用保藏號為CGMCC 2864的內生真菌Muscodor sp.ZJLQ070。備注說明:ZJLQ070在專利2009 10153511.6有告知,保藏號為CGMCC2864。本發明具有如下優點:1、首次嘗試產氣霉屬真菌的固體發酵，開創先例；2、能夠快速有效地得到產氣霉屬真菌固體發酵的產物。
下面結合附圖對本發明的具體實施方式
作進一步詳細說明。圖1:不同生小米與土豆汁比例下的固體發酵情況。A:生小米:土豆汁=1:0.75、營養液土豆汁用量為50%，培養基有明顯的結塊；B:生小米:土豆汁=1:0.50、營養液土豆汁用量為25%，無法觀測到菌體的生長；C:生小米:土豆汁=1:0.60、營養液土豆汁用量為25%，菌體生長且體系松散不結塊；D:生小米:土豆汁=1:0.60、營養液土豆汁用量為25%，可見到分布均勻的白色菌絲(B卩，D是C的放大圖)。圖2:發酵10天時發酵體系的質量損失率(％)與營養液初始pH的關系。圖3:發酵10天時發酵體系的質量損失率(％)與種齡的關系。圖4:25°C下ZJLQ070菌株在PDA平皿上的生長速率。圖5:發酵10天時發酵體系的質量損失率(％)與接種量的關系。圖6:發酵10天時發酵體系的質量損失率(％)與發酵溫度的關系。圖7:發酵產物浸出液中還原糖的含量與發酵時間的關系。圖8:發酵產物浸出液中總糖的含量與發酵時間的關系。圖9:發酵產物浸出液中溶磷的含量與發酵時間的關系。
圖10:發酵產物浸出液中氨氮的含量與發酵時間的關系。圖11:發酵體系中的含水量與發酵時間的關系。圖12:發酵體系的質量損失率與發酵時間的關系。圖13:ZJLQ070菌株固體發酵曲線。
具體實施例方式下面結合附圖對本發明的具體實施方式
作進一步詳細說明。實施例1:固體發酵培養基含水量的確定在固體發酵中，培養基的含水量將影響微生物的生長，含水量過高，將在培養過程中形成結塊，從而影響發酵的進行。本實施例中，通過改變熟小米的制備中，生小米與土豆汁之間的料水比以及營養液中土豆汁的用量來改變培養基的含水量。按照上述設計理論，在進行了大量初步選擇培養基的基礎上，選用了以下三個培養基配方進行試驗，從而確定培養基中較優含水量。配方一的固體發酵培養基由以下成分組成:熟小米100g，珍珠巖20g，營養液25ml ο制備過程如下:I)、熟小米制備:100g生小米中加入75ml 土豆汁，用滅菌鍋于121°C加熱15分鐘，得熟小米。2)、營養液制備:將葡萄糖3.0g,低溫脫脂大豆粉5.0g,蛋白胨(peptone) 5.0g,磷酸二氫鉀0.3g,硫酸鎂0.15g，用50ml的土豆汁溶解后再用濃度為5mol/L的NaOH溶液調節pH至6，得營養液(糊狀)。3)、將25ml營養液與IOOg熟小米和20g珍珠巖混拌在一起，121 °C高壓(1.05*105Pa)滅菌鍋滅菌20分鐘后備用。備注說明:按照上述配方一所得的培養基，滅菌前(即，步驟3)中營養液、熟小米和珍珠巖混拌后)的理論含水量約為54.62%。配方二的固體發酵培養基由以下成分組成:熟小米100g，珍珠巖20g，營養液25ml ο制備過程如下:I)、熟小米制備:100g生小米中加入50ml 土豆汁，用滅菌鍋于121°C加熱15分鐘，得熟小米。2)、營養液制備:將葡萄糖3.0g,低溫脫脂大豆粉5.0g,蛋白胨(peptone) 5.0g,磷酸二氫鉀0.3g,硫酸鎂0.15g，用25ml 土豆汁溶解后再用濃度為5mol/L的NaOH溶液調節pH至6，得營養液(糊狀)。3)、將25ml營養液與IOOg熟小米和20g珍珠巖混拌在一起，121 °C高壓(1.05*105Pa)滅菌鍋滅菌20分鐘后備用。備注說明:按照上述配方二所得的培養基，滅菌前(即，步驟3)中營養液、熟小米和珍珠巖混拌后)的理論含水量約為 28.35%。
配方三的固體發酵培養基由以下成分組成:熟小米100g，珍珠巖20g，營養液25ml。制備過程如下:I)、熟小米制備:100g生小米中加入60ml 土豆汁，用滅菌鍋于121°C加熱15分鐘，得熟小米。2)、營養液制備:將葡萄糖3.0g,低溫脫脂大豆粉5.0g,蛋白胨(peptone) 5.0g,磷酸二氫鉀0.3g,硫酸鎂0.15g，用25ml 土豆汁溶解后再用濃度為5mol/L的NaOH溶液調節pH至6，得營養液(糊狀)。3)、將25ml營養液與IOOg熟小米和20g珍珠巖混拌在一起，121 °C高壓(1.05*105Pa)滅菌鍋滅菌20分鐘后備用。備注說明:按照上述配方三所得的培養基，滅菌前(即，步驟3)中營養液、熟小米和珍珠巖混拌后)的理論含水量約為40.64%。分別用配方一、配方二和配方三所得的培養基進行固體發酵，即將內生真菌Muscodor sp.ZJLQ070以接種量0.2% (質量％)于25°C下黑暗培養發酵，發酵時間10天，定期(每隔24小時)觀察固體發酵體系中真菌的生長狀況:實驗結果如圖1所示:當用配方 一所得的培養基時，即當生小米與土豆汁的料水比為1:0.75、營養液土豆汁用量為50% (滅菌 前理論含水量為54.62%)時，發酵7天時，ZJLQ070生長旺盛，且培養基有明顯的結塊，并且結塊不易消除(圖1A)；當用配方二所得的培養基時，即料水比僅為1:0.5、營養液土豆汁用量為25% (滅菌前理論含水量為28.35%)時，ZJLQ070將難以生長，在發酵體系中無法觀測到菌體的生長(圖 1B)；當用配方三所得的培養基時，即在料水比為1:0.6、營養液土豆汁用量為25% (滅菌前理論含水量為40.64%)時，有較好的發酵結果，在發酵7天時，能夠見到明顯的菌體生長，且培養體系松散不結塊(圖1C)，仔細觀看，可見到培養基中分布均勻的白色菌絲(圖1D)。因此，適用于ZJLQ070菌株固體發酵的料水比為生小米:土豆汁=1:0.60，即配方三，此時的滅菌前理論含水量為40.64%。實施例2:固體發酵培養基配方的優化采用的培養基為確定了含水量的固體發酵培養基，其配方如實施例1中配方三。培養基的優化采用正交設計，如表I所示，以葡萄糖的用量為因素一，蛋白胨的用量為因素二，低溫脫脂大豆粉的用量為因素三，磷酸二氫鉀的用量為因素四，進行4因素3水平的正交設計。因素與水平、以及正交設計表如下表2:表1:4因素3水平的正交設計表(單位:克):
權利要求
1.真菌固體發酵法，其特征是:將真菌按照0.Γ0.3% (質量％)的接種量接種至真菌固體發酵培養基上，在黑暗中于23 28°C的發酵溫度下發酵5 10天； 所述真菌固體發酵培養基由以下成分組成:熟小米100g、珍珠巖19 21g和營養液24 26ml ； 所述熟小米的制備方法為:在IOOg生小米中加入55飛5ml 土豆汁，用滅菌鍋于12(Tl22°C加熱1 Γ16分鐘，得熟小米； 所述營養液的制備方法為:將葡萄糖0.5 3g、脫脂大豆粉5 7g，蛋白胨f5g，磷酸二氫鉀0.3^0.55g，硫酸鎂0.15g，用25 50ml的土豆汁溶解后調節pH至6，得營養液。
2.根據權利要求1所述的真菌固體發酵法，其特征是: 將真菌按照0.2^0.3% (質量％)的接種量接種至真菌固體發酵培養基上，在黑暗中于24 26°C的發酵溫度下發酵5 8天； 所述真菌固體發酵培養基由以下成分組成:熟小米100g、珍珠巖20g和營養液25ml ； 所述熟小米的制備方法為:在IOOg生小米中加入60ml 土豆汁，用滅菌鍋于121°C加熱15分鐘，得熟小米； 所述營養液的制備方法為:將葡萄糖0.5g，脫脂大豆粉7g，蛋白胨1.0g,磷酸二氫鉀0.55g，硫酸鎂0.15g，用25ml的土豆汁溶解后調節pH至6，得營養液。
3.根據權利要求1或2所述的真菌固體發酵法，其特征是:所述營養液的制備方法中用濃度為4.8 5.2mol/L的NaOH溶液調節pH。
4.根據權利要求3所述的真菌固體發酵法，其特征是:所述真菌為產氣霉屬真菌。
5.根據權利要求4所述的真菌固體發酵法，其特征是:接種量為0.2^0.3%，發酵溫度為25 °C，發酵時間為5 8天。
6.根據權利要求5所述的真菌固體發酵法，其特征是:用于接種的Z幾Q070菌株的種齡為6天。
全文摘要
本發明屬于微生物發酵領域。具體而言，本發明公開了一種真菌固體發酵法，將真菌按照0.1~0.3%的接種量接種至真菌固體發酵培養基上，在黑暗中于23~28℃的發酵溫度下發酵5~10天；真菌固體發酵培養基由以下成分組成熟小米100g、珍珠巖19~21g和營養液24~26ml；熟小米的制備方法為在100g生小米中加入55~65ml土豆汁，用滅菌鍋于120~122℃加熱14~16分鐘，得熟小米；營養液的制備方法為將葡萄糖、脫脂大豆粉、蛋白胨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂用25~50ml的土豆汁溶解后調節pH至6，得營養液。采用本發明的方法能夠快速有效地得到產氣霉屬真菌固體發酵的產物。
文檔編號C12P1/02GK103215313SQ201310111048
公開日2013年7月24日 申請日期2013年3月31日 優先權日2013年3月31日
發明者林福呈, 劉誠, 章初龍, 馮曉曉 申請人:浙江大學