專利名稱：一種大型實驗動物克隆化細胞誘導為多能性干細胞的方法
技術領域：
本發明涉及一種多能性干細胞的誘導方法，具體地說是利用大型實驗動物克隆化細胞為靶細胞進行多能性干細胞的誘導、體外培養條件優化及功能驗證，最終獲得高增值力、高分化潛能的大型實驗動物多能性干細胞，屬于動物資源學和細胞生物學交叉學科和領域。
背景技術：
隨著醫學生物科學的突飛猛進發展，認識到公害問題不僅已成為糧食、人口、老年人等的重大社會問題，而且還涉及到地球上生活著的動物生存問題，例如產業公害、食品公害、藥品毒性等，均直接影響人體健康，對這些問題的研究，最終必然要通過動物實驗(包括動物疾病模型的開發等)來闡明解決。因此，實驗動物科學，特別是實驗動物的重要性愈來愈被人們所認識，它已被認為是動物追求幸福生活的支柱，故實驗動物科學亦被稱之為生命科學。為此，先進國家對實驗動物科學的發展，均給給予高度的重視，其投入的經濟物資和技術力量，幾乎可同發展原子能科學相提并論，其重要意義可想而知。動物細胞在體外的生存周期是有限的，正常組織來源的體細胞在通常的體外培養條件下可生長和分裂，但經過有限次的細胞傳代后，就會停止增殖，發生衰老和死亡。這無疑又局限了其在生物技術和臨床研究方面的應用。在實際操作中對于相同樣本反復采集也是不可能的，一次性大量取樣則更不人道。但是，在傳統的方法中，研究的接力式進行和標本的暫時性的采集中存在的矛盾很難調和，所以建立和保存實驗動物的多能性干細胞，可有效的對同一研究對象進行持久的連續性的研究。多能性干細胞具有穩定的增殖特性和功能狀態，能為生命科學研究提供性狀恒定的研究對象，可作為細胞工程和組織工程等研究領域的標準細胞，已應用于生命科學研究的多個領域。在眾多轉化體外細胞使其永生化的方法技術中，我們常以采集樣本方便，病毒轉化永生化細胞率高，操作周期短的EB病`毒轉化外周血B淋巴細胞建立永生細胞系，為保存實驗動物基因，研究影響動物疾病基因的最合適方法。EB病毒轉化實驗動物外周血B淋巴細胞建立的永生細胞株讓原本有一定壽命的動物細胞能夠不間斷地繁殖下去，使各個領域實驗動物的基因得以永久的保存。永生細胞株在轉化前后其細胞和分子遺傳學是穩定的，但細胞株在長期傳代的過程中遺傳特征是否發生改變，是一個關系著科學研究中實驗結果準確性的重要問題，也是我們繼續研究的方向。
發明內容
本發明的目的是提供一種大型實驗動物克隆化細胞誘導為多能性干細胞的方法。為實現上述目的，本發明采取以下技術方案:采用高活性、高純度的大型實驗動物克隆化細胞為靶細胞，該細胞具有以下特征:生長速度快，活率高，凋亡率低。大型實驗動物多能性干細胞的誘導方法包括下述步驟:
(I)克隆化細胞培養:以懸浮細胞培養法為基礎，轉化與24孔板少量培養時采用全 RPM11640 培養基 A:78 % 基礎 RPMI1640+20 % FBS(GIBC0 特級)+1 % 雙抗 +1 %L-Giutamine+0.2%H印es (調節pH至7.0);永生細胞轉入中瓶后使用全RPMI1640。培養基 B:73%基礎 RPMI1640+15% FBS (BIOCHROM AG 優級)+1 %雙抗+1 % L-Giutamine+0.2%Hepes (調解pH至7.0)。37.5°C、5% CO2培養體系對永生化細胞進行轉化與培養。(2)多能性干細胞的誘導:三因子無飼養層體系誘導大型實驗動物多能性干細胞。(3)多能性干細胞的培養體系優化:在培養體系中添加LIF和bFGF等因子及采用STO飼養層等對多能干細胞的培養體系進行優化。(4)多能性干細胞的鑒定:采用形態學觀察、體外增值能力測定、堿性磷酸酶染色和免疫熒光鑒定大型實驗動物多能干細胞。本發明的優點與效益:本 發明對傳統的四因子誘導多能干細胞方法及培養液成分進行調整與改進，可以高效誘導出大型實驗動物多能性干細胞，細胞質量與現有技術相比有大幅提高；改進培養條件后，大型實驗動物多能性干細胞形態和生長速度沒有發生變化，細胞質量穩定，且細胞傳代生長穩定，與現有培養技術相比有顯著提高，適合大規模培養。誘導方法的調整及培養方法的改進，大幅降低了成本。本發明在方法等各方面彌補了現有多能干細胞技術的不足，大型實驗動物多能性干細胞的細胞活率及純度的提升也使實驗動物的基因得以永久的保存。由于大型實驗動物為有別于其他動物的一類特殊群體，他們所特有的基因成了及其珍貴的遺傳資源，使得人們在各領域內對大型實驗動物的研究極少。本發明所述的高增值力、高分化潛能的大型實驗動物多能性干細胞可有效的對同一研究對象進行持久的連續性的研究，為生命科學研究提供性狀恒定的研究對象，可作為細胞工程和組織工程等研究領域的標準細胞，用于生命科學研究的多個領域，對我國生命科學的研究具有深遠意義。下面結合附圖及最佳實施方式對本發明做進一步說明，以使公眾對發明內容有整體和充分的了解，而并非對本發明保護范圍的限定。前述部分已經充分公開了本發明可以實施的保護范圍，因此凡依照本發明公開內容進行的任何本領域公知的等同替換，均屬于對本發明的侵犯。
圖1為0CT4慢病毒載體轉染293T細胞；圖2為S0X2慢病毒載體轉染293T細胞；圖3為C-MYC慢病毒載體轉染293T細胞；圖4為KLF4慢病毒載體轉染293T細胞；圖5為RTTA慢病毒載體轉染293T細胞；圖6為0CT4慢病毒滴度測定；圖7為S0X2慢病毒滴度測定；圖8為C-MYC慢病毒滴度測定；圖9為KLF4慢病毒滴度測定；圖10為RTTA慢病毒滴度測定；
圖11為大型實驗動物克隆化細胞；圖12為誘導的大型實驗動物多能干細胞；圖13為大型實驗動物多能干細胞堿性磷酸酶染色；圖14為大型實驗動物多能干細胞oct4免疫熒光鑒定圖15為大型實驗動物多能干細胞SOX2免疫熒光鑒定圖16為大型實驗動物多能干細胞nanog免疫熒光鑒定圖17為大型實驗動物多能干細胞SSEAl免疫熒光鑒定
具體實施例方式實施例中所用的主要儀器及試劑來源:大型實驗動物主要是牛、羊的克隆化細胞來源:本實驗室保存。(一 )主要儀器設備1、激光掃描共聚焦顯微鏡:尼康TE-2000-E ；2、細胞融合 儀:美國BTX ECM-20013、顯微操作儀:日本尼康NT-88-V34、浮雕相差顯微鏡，Olympus IX-71 ;生物顯微鏡，Olympus CX31 ;倒置相差熒光顯微鏡:01ympus IX-71 ；5、_70°C超低溫冰箱:美國 kelvinator ；6、電動移液器:德國Accu-jet ；7、頗爾超純水器:Pall-pruelab_plus ；8、CO2 培養箱:Heraeus BB16UV ；9、液氮貯存器:四川東亞YES-50B-125F ；10、電泳儀:北京六一廠DYY-6C;11、電泳槽:北京六一廠DYC-24A:12、高性能無菌實驗臺:哈爾濱DL-CJ-2N ；13、低速離心機:CENTERIGUGETDL-40B ；( 二)主要試劑1、DMEM(Dulbecco， s modified eagle medium):2、載體 pEGEP_N3:Clontech ；3、膜蛋白酶(Trypsinl:250),吉姆薩(Giemsa): Amresco ；4、特級胎牛血清(Defined FBS):Hyclone ；5、臺盼藍(Trypan Blue), DMS0,秋水仙素(Colchicine), EDTA, Triton (曲拉通)X-100 >99%,TEMED，Bis (甲叉雙丙烯酰胺)98%，過硫酸銨(Ammonium Persulfate)，PMS,NAD,喔唑藍(Thiazolyl Blue),細胞松她素 B, Hoechst33342,離子霉素,6-DMAP:Sigma ；6、甘油分析純華綠淵；7、Tris:Promega ；8、丙烯酰胺> 99% (Acr)，甘氨酸> 99% (Clycine) =NOVON ；9、脂質體 Lipofectin:Gibco 公司；成纖維細胞培養所用液體配制:
10、DMEM培養液:DMEM9.6g,溶于超純水中，用NaHCO3約3.2g調節pH至7.2
7.4，加水定容至1L，用磁力攪拌器攪拌混勻，0.22 um濾膜過濾除菌，500ml/瓶分裝，貯存
于 4。。。11、培養液:DMEM培養液中加入終濃度為10% (體積比)的FBS，0.22 u m濾膜過濾500ml/瓶分裝，4 °C貯存。12、雙抗貯存液:100萬IU的鏈霉素4支，80萬IU的青霉素5支溶于400ml滅菌去離子水中。13、I XPBS 緩沖液:NaC14.00g,KC10.10g，Na2HPO4 12H201.45g，KH2PO40.10g，加超純水定容至500ml，pH為7.2，高壓滅菌密封后4°C貯存。14,0.25% (質量體積比)胰蛋白酶溶液:1.25g胰蛋白酶干粉溶于PBS中，定容至500ml, pH為7.2 7.4，0.22 濾膜過濾分裝，_20°C貯存。15、0.9% (質量比)生理鹽水:0.45g NaCl溶于500ml超純水，高壓滅菌30min。16、細胞凍存液:將50ml DMSO加入450ml全培養液(含體積比15% FBS的全培養液)中，用0.22 ii m濾膜過濾IOOml/瓶分裝，貯存于_20°C冰箱。微生物檢測所用試劑:17、大豆胰蛋白胨:3g大豆胰蛋白胨，加IOOml超純水，調pH至7.3，高壓滅菌15 20min，分裝到15 X 150mm的玻璃管中。18、麥芽汁:2g麥芽汁加IOOml超純水,調pH至3 4,高壓滅菌15 20min,分裝到15X 150mm的玻璃管中。19、DAPI染液:超純水配制lmg/ml DAPI儲存液，PBS稀釋為0.5 lmg/ml。20、封片液:22.2ml0.1M 的檸檬酸，27.8ml0.2M 的 Na2HPO4 溶于 50ml 甘油中，NaOH調節pH至5.5，貯存于4°C。21、固定液:冰醋酸與甲醇以體積比1: 3的比例(現用現配)。染色體標本制備所用試劑:22、秋水仙素忙存液:10mg秋水仙素溶于IOml超純水中。23、稀釋液:超純水將貯存液稀釋10倍至終濃度為100 u g/ml。24、低滲KCl溶液:0.5g的KCl溶于IOOml超純水。25、固定液:冰醋酸與甲醇按體積比1: 3的比例配制。26、Giemsa 染色液原液:將Ig Giemsa染粉倒入研缽,加幾滴甘油，在研缽內研磨至無顆粒為止,然后加甘油至33ml，放在56°C保溫箱2h后，加入45ml甲醇攪拌均勻，棕色瓶中貯存備用。工作液:磷酸緩沖液將Giemsa原液稀釋10倍至終濃度為IOml。27、磷酸緩沖液的配制:KH2P040.34g加入IOOml去離子水(用NaOH調pH6.8)脂質體轉染 細胞所用試劑:28、質粒 DNA (DsRed 和 EGFP-N3)，脂質體 Lipofectamine，不含血清的 DMEM 培養液，含血清的DMEM培養液，pH7.4的PBS。同工酶分析所用試劑:29,0.9% (質量比)NaCl-0.06mmol EDTA 溶液:分別稱取 0.9g NaCl 和 0.0223gEDTA溶于IOOml超純水中即可。
30、DAPI染液:超純水配制lmg/ml DAPI儲存液，PBS稀釋為0.5 lmg/ml。實施例1大型實驗動物克隆化細胞的培養(I)初代培養:以懸浮細胞培養法為基礎，轉化與24孔板少量培養時采用全 RPMI1640 培養基 A:78 % 基礎 RPMI1640+20 % FBS(GIBC0 特級)+1 % 雙抗 +1 %L-Giutamine+0.2 % Hepes (調節PH至7.0)；永生細胞轉入中瓶后使用全RPMI1640培養基 B:73%基礎 RPMI1640+15% FBS (BIOCHROM AG 優級)+1 %雙抗+1 % L-Giutamine+0.2%Hepes (調解PH至7.0)。37.5°C、5% C02培養體系對永生化細胞進行轉化與培養。(2)傳代培養:棄除步驟(I)培養瓶內的培養液，用預熱至37°C的PBS小心洗滌培養瓶內殘留物2次，以去除殘余的血清、脫落的組織塊及死細胞。用胰蛋白酶消化后加入培養液6 IOml終止消化；消化后的細胞平均分裝入2個培養瓶中，放入37°C，5% CO2的培養箱中繼續培養。(3)細胞凍存:A、換液:凍存前24h，棄除培養瓶內培養液并更換新鮮培養液6 10ml，繼續培養24h ；B、消化:用胰蛋白酶消化培養細胞，然后加入培養液6 IOml終止反應；C、計數:用紅細胞計數板計算凍存前細胞總數；D、收集:IOOOrpm離心8min，去上清液，加入4°C預冷的凍存液1ml，混勻后用吸管輕輕吹打使細胞重懸，用吸管輕輕吹打使細胞重懸，并盡量縮短凍存液與細胞在室中的存放時間(凍存液成分:10% DMS0+50%胎牛血清+40% DMEM)；E、分裝:將細 胞分裝入滅菌的凍存管中封口，標明日期、品種、細胞名稱、培養代數；F、預凍:將凍存管裝入程序降溫盒中，放于4°C 20 30min，使DMSO充分滲透到細胞內，達到內外平衡，然后置于_70°C冰箱中預凍4h以上。G、凍存:提出凍存管迅速投入液氮柜中，即完成細胞凍存。(4)細胞復蘇:將凍存管從液氮中取出后迅速置入42°C水浴中，快速晃動Imin左右，將細胞移入加有培養液的培養瓶中吹打均勻，放置含37°C 5% CO2的培養箱中繼續培養。實施例2大型實驗動物多能性干細胞的誘導:采用三因子無飼養層體系對實施例1培養的大型實驗動物克隆化細胞進行多能性干細胞的誘導，方法及結論如下。一、三因子慢病毒的制備方法:將含有三因子的慢病毒載體轉染293T細胞，制備慢病毒。結論:如圖1-5所示，三因子的轉染效率均在50%以上，如圖所示，慢病毒的滴度均在IO8以上，證明制備的三因子慢病毒均符合本實驗要求。二、三因子慢病毒浸染大型實驗動物克隆化細胞方法:將三因子慢病毒按10: I的比例浸染大型實驗動物克隆化細胞48h，換多能干細胞培養液繼續培養。設對照為:A.陽性對照:將四因子慢病毒按10: I的比例浸染大型實驗動物克隆化細胞48h，換多能干細胞培養液繼續培養。B.陰性對照:將不含因子慢病毒按10: I的比例浸染大型實驗動物克隆化細胞48h，換多能干細胞培養液繼續培養。結論:三因子可將大型實驗動物克隆化細胞誘導為多能干細胞。實施例3大型實驗動物多能性干細胞的培養體系優化:方法:在培養體系中添加LIF和bFGF等因子及采用STO飼養層等對多能干細胞的培養體系進行優化。結論:在培養體系中添加LIF和bFGF等因子可促進大型實驗動物多能性干細胞的增值，采用STO飼養層可起到同樣效果。實施例4大型實驗動物多能性干細胞的鑒定:方法:采用形態學觀察、體外增值能力測定、堿性磷酸酶染色和免疫熒光鑒定大型實驗動物多能干細胞。結論:大型實驗動物多能性干細胞體外增值能力強，堿性磷酸酶染色為陽性，多能性標記物免疫熒光鑒 定均為陽性。
權利要求
1.一種大型實驗動物克隆化細胞誘導為多能性干細胞的方法。
2.如權利要求1所述方法，其主要特征是采用三因子無飼養層體系誘導大型實驗動物多能性干細胞。本發明對傳統的四因子誘導多能干細胞方法及培養液成分進行調整與改進，采用S0X2、C-MYC和KLF4慢病毒可以高效誘導出大型實驗動物多能性干細胞，細胞質量與現有技術相比有大幅提聞。
3.如權利要求1所述方法，主要采用STO飼養層培養體系培養大型實驗動物多能性干細胞。本發明利用小鼠STO細胞作為飼養層后，大型實驗動物多能性干細胞形態和生長速度沒有發生變化，細胞質 量穩定，且細胞傳代生長穩定，與現有培養技術相比有顯著提高，適合大規模培養，大幅降低了成本。
全文摘要
本發明利用大型實驗動物克隆化細胞為靶細胞進行多能性干細胞的誘導、體外培養條件優化及功能驗證，最終獲得高增值力、高分化潛能的大型實驗動物多能性干細胞，屬于動物資源學和細胞生物學交叉學科和領域。本發明培養出的多能性干細胞無污染，細胞純度高；細胞質量穩定，傳代生長穩定，適合大規模培養。本發明涉及的大型實驗動物多能性干細胞可有效的對同一研究對象進行持久的連續性的研究，為生命科學研究提供性狀恒定的研究對象，可作為細胞工程和組織工程等研究領域的標準細胞，用于生命科學研究的多個領域，對我國生命科學的研究具有深遠意義。
文檔編號C12N15/867GK103160540SQ20131010891
公開日2013年6月19日 申請日期2013年4月1日 優先權日2013年4月1日
發明者胡鵬飛, 白春雨, 李向臣, 姜龍江, 李萬哲, 劉春華, 關偉軍 申請人:中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所, 哈爾濱體育學院