一種支持cho高密度懸浮培養的無血清無蛋白培養基的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種支持CHO高密度懸浮培養的無血清無蛋白培養基。公開了培養基組分包括氨基酸、微量元素及無機鹽、維生素、碳水化合物和其他有機分子，其中含有類固醇激素，而不含有轉鐵蛋白和胰島素。本發明所提供的培養基化學成分明確，無動物來源，污染風險小，能適用于多種不同CHO細胞株生長，細胞培養效果好，有利于下游分離和純化。
【專利說明】—種支持CHO高密度懸浮培養的無血清無蛋白培養基
【技術領域】
[0001]本發明涉及細胞培養領域。更具體地，本發明涉及用于CHO細胞培養的培養基。
【背景技術】
[0002]細胞培養技術是通過模擬細胞體內生長環境實現細胞體外培養。培養基為細胞體外培養提供營養并促進細胞生長和增殖。細胞培養基的發展經歷了雞胚汁、天然培養基、合成培養基，以及目前常用的低血清培養基、無血清培養基、無蛋白培養基和化學成分清晰的培養基。
[0003]通常，動物細胞的生長均有賴于血清的存在.在普通培養基中，如不加血清，絕大部分細胞將不能增殖。但使用血清的主要弊端是存在潛在的污染源，價格昂貴，批間差異大，對生產和科研帶來諸多不便。科學家發現在基礎培養基中加入替代血清作用的補充因子，如纖連蛋白、轉鐵蛋白、胰島素和表皮生長因子等成分，不少細胞即能在無血清供應的情況下生長。無血清培養基規避了血清帶來的風險。便于產品的分離純化。然而，一般一種無血清培養基只適用于一類細胞的培養，而且容易受到理化因素的影響。另外無血清培養基通常含有替代血清的蛋白和脂類，如轉鐵蛋白、脂類添加劑和胰島素等，仍然存在一定的污染風險和分離純化的障礙，成本也比較高。
[0004]中國倉鼠卵巢細胞-CHO細胞(Chinese hamster ovary cell)目前被廣泛用于生產各種基因工程蛋白產品。適合用于CHO細胞培養的培養基，根據它的來源及成分的明確程度來劃分，其發展大致可分為三個階段:即天然培養基階段(直接采用某些組織凝塊、生物性液體和組織提取液等作為細胞的培養基)，合成培養基階段(如MEM，DMEM，RPMI1640，F12等)和無血清培養基階段。合成培養基通常需在其中添加一些諸如血清(常用的如小牛血清、胎牛血清等，一般在5 —15%)等天然的體液性補充物才能較長時間地維持細胞生長。血清的主要作用在于向細胞提供激素(生化因子)、轉移蛋白和其它營養物質等。但即使采用低血清培養，還是不能忽視血清帶來的問題(如在培養過程中貼壁，不適用于大規模培養)。無血清培養基的優勢很大程度上體現在避免了血清的缺點，此外它還具有血清培養難以比擬的優點，如保存和應用方便；使用該種培養基制備的產品易于純化，提高回收率；成分明確，有利于研究細胞的生理調節機制等。但是，無血清培養基通常含有替代血清的蛋白和脂類，如轉鐵蛋白、脂類添加劑和胰島素等，仍然存在一定的污染風險和分離純化的障礙，成本也比較高。而且，一般一種無血清培養基只適用于一類細胞的培養，容易受到理化因素的影響。
【發明內容】
[0005]本發明是一種無血清無蛋白培養基，能適用于多種不同CHO細胞株生長的全能型培養基，它化學成分明確，無動物來源，其使用不僅將污染的風險降到最小，更有利于下游的分離和純化。
[0006]本發明是在商業化出售的培養基DMEM/F12 (可從Sigma, GIBCO等公司購買)基礎上進行開發，能夠支持細胞生長和穩定傳代的無血清無蛋白培養基，可適用于工業規模生產。
[0007]無血清無蛋白培養基的組分一般包括葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素、微量元素、類固醇激素和相關蛋白替代物，如何對這些成分進行合理設計，是開發和優化無血清無蛋白培養基的關鍵。
[0008]本發明解決上述技術問題的技術方案如下:
[0009](I)選擇添加可替代生長因子、轉鐵蛋白和胰島素的組分如:孕酮、氫化可的松，檸檬酸鐵，硫酸鋅等物質；
[0010](2)利用統計學實驗設計確定各個組分的最佳劑量；
[0011]基于以上考慮，本發明的培養基主要由以下幾方面的組分構成:
[0012]氨基酸:培養基中主要營養物質之一，用于蛋白、核酸以及脂類等物質的合成，還可以通過幾個主要的中間代謝節點進入TCA循環，用于能量的生成，并同其他營養物質的代謝相關聯。;
[0013]無機鹽:NaCl維持滲透壓平衡，協調共同轉運有機大分子進入細胞-X，Ca2+，Mg2+，Zn2+等離子則參予代謝與信號轉導以及促進貼壁和細胞增殖；各種陰離子(S042—，NO3—等)，則主要用于調節轉細胞膜勢能或作為含硫或氮元素有機分子的前體；
[0014]維生素:培養基中主要營養物質之一，維生素在培養基中存在的量很微量，但在細胞代謝中作為細胞功能有機催化劑，起重要的調控作用。
[0015]碳水化合物:葡萄糖是主要的碳水化合物，作為主要的碳源和能源物質。
[0016]微量元素:微量元素主要起調節、傳遞和控制的作用，在無血清培養基中的作用尤為重要,如:
[0017]Fe:酶和血紅素的輔基，是線粒體中呼吸鏈的組成部分。
[0018]Cu:超氧化物歧化酶的輔基，是線粒體中呼吸鏈的組成部分。
[0019]Mg:對ATP酶、激酶等起活化作用。
[0020]Zn:酶的輔基。
[0021]Co:維生素B12的組成部分。
[0022]此外，培養基中還加入酚紅用作培養基pH的指示劑，為適合細胞發酵罐中的大規模培養而添加有0.1%的Pluronic F68以消除剪切力的影響。
[0023]根據將以上各類物質對細胞生長的不同作用，本發明將以上類別的物質按以下濃度進行設置:
[0024]氨基酸的組分和用量:
[0025]
【權利要求】
1.一種支持CHO高密度懸浮培養的無血清無蛋白培養基，其特征在于，培養基組分包括，氨基酸、微量元素及無機鹽、維生素、碳水化合物和其他有機分子，其中含有類固醇激素，而不含有轉鐵蛋白和胰島素。
2.根據權利要求1所述的無血清無蛋白培養基，其特征在于，培養基干粉中氨基酸的組分和用量如下，
3.根據權利要求1-2所述的無血清無蛋白培養基，其特征在于，培養基干粉中微量元素及無機鹽的組分和用量如下，
4.根據權利要求1-3所述的無血清無蛋白培養基，其特征在于，培養基干粉中維生素的組分和用量如下，
5.根據權利要求1-4所述的無血清無蛋白培養基，其特征在于，培養基干粉中碳水化合物和其他有機分子的組分和用量如下，
6.根據權利要求1-5所述的無血清無蛋白培養基，其特征在于，培養基干粉中各組分和用量如下，
微量元素及無機鹽的組分和用量，
碳水化合物和其他有機分子的組分和用量，
7.根據權利要求6所述的無血清無蛋白培養基，其特征在于，培養基干粉中各組分和用量如下，
8.根據權利要求1-7所述的無血清無蛋白培養基，其特征在于，培養基干粉中還含有植物來源經超濾后的水解物。
9.根據權利要求8所述的無血清無蛋白培養基，其特征在于，水解物的用量為4g/l。
10.權利要求1-9任一所述的培養基配置方法,其特征在于， a.將單位體積的培養基干粉加入90%單位體積的超純水中，設置溫度35°C左右，攪拌半小時，b.加入一定量的氫氧化鈉助溶，然后加入濃鹽酸和碳酸氫鈉，調節PH到.6.9-7.4，c.用0.2um負壓過濾，無菌避光保存。
【文檔編號】C12N5/071GK104073463SQ201310106385
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2013年3月29日 優先權日:2013年3月29日
【發明者】胡輝, 李軍, 翁志兵 申請人:上海中信國健藥業股份有限公司