專利名稱：一種高效提取脾氨肽的方法
技術領域：
本發明屬于生化制藥領域，涉及一種生物活性成分的提取方法，具體涉及一種脾氨肽的提取方法。
背景技術：
脾臟是人體及其它哺乳動物體內最大的免疫器官，占全身淋巴組織總量的25%，含有大量的淋巴細胞和巨嗜細胞，在體液免疫、細胞免疫、抗原提呈等免疫應答過程中發揮重要作用。脾臟在免疫應答過程有大量蛋白質(如抗體)和調控因子(如促吞噬素Tuftsin、腫瘤壞死因子TNF、白介素等)參與，所以脾臟富含具有免疫調節作用的生物活性多肽。國內外早有報道，從動物脾臟中提取的多肽組分“脾氨肽”具有調節免疫等生理功能，但是其中具體的活性組分還不是很清楚，很可能是多組分共同作用的結果。已經報道的脾氨肽的提取方法大同小異，大體來講都是先將健康動物(如豬、牛)的脾臟剪切、洗滌后制成勻漿液，再將勻漿液通過透析或超濾等方法(勻漿液不可用離心法或凍融法分離，因為該方法分離得到的產物不符合低分子量多肽的要求)處理獲得低分子量組分(通常平均分子量3500道爾頓)，該低分子量組分進一步處理后冷凍干燥即獲得脾氨肽成品。這些脾氨肽提取方法一個主要的不足就是脾氨肽的得率比較低，因為這些方法都浪費掉了高分子量的蛋白質組分。這些高分子量蛋白組分雖然通過自行降解成多肽小分子透析出來，但量少。因此，有必要在現有技術背景下，提出一種新的脾氨肽提取方法，能夠高效、低成本地提取脾氨肽。
發明內容
本發明的目的在于提供一種高效提取脾氨肽的新方法，能夠增加脾氨肽的產率，提聞脾臟的利用效率。本發明的上述目的是通過以下技術方案實現的:提供一種高效提取脾氨肽的新方法，具體步驟包括:A)將新鮮健康動物脾臟剪去脂肪、絞碎、稱重后進行勻漿；B)在步驟A)得到的勻漿液中添加低溫蛋白酶，用量為每克動物脾臟勻漿液中添加0.6-1.3U，然后裝入截留分子量為7000道爾頓的透析袋中，放到2-5°C無菌注射用水中透析，透析液用量為勻衆液重量的I倍，酶促透析時間為24 50小時；C)將步驟B)得到的透析液冷凍干燥后得到脾氨肽干粉。步驟A)所述的動物優選大規模人工飼養的肉用動物，進一步優選豬、牛或羊。步驟A)所述的勻漿，優選使用膠體磨完成。步驟B)所述的低溫蛋白酶用量優選為每克動物脾臟勻漿液中添加0.9-1.3U ;更優選為每克動物脾臟勻漿液中添加1.ο-l.3U ;最優選每克動物脾臟勻漿液中添加1.3U。步驟B)所述的低溫蛋白酶可以選自現有的各種低溫蛋白酶或多種低溫蛋白酶的混合物；優選食用植物來源的蛋白酶中的一種或兩種以上的混合物；進一步優選木瓜蛋白酶或菠蘿蛋白酶中的一種或兩種的混合物。步驟B)所述的無菌注射用水溫度優選3 4°C。步驟B)所述的酶促透析時間優選為48小時。本發明所述的高效提取脾氨肽的新方法，最優選包括以下步驟:A)將新鮮健康豬脾臟剪去脂肪、絞碎，稱重后加入0.85倍重量無菌注射用水進行膠體磨勻漿；B)在步驟A)得到的勻漿液中添加低溫蛋白酶，用量為每克豬脾臟勻漿液中添加
0.9-1.3U，然后裝入截留分子量為7000道爾頓的透析袋中，放到2-5°C無菌注射用水中透析，透析液用量為勻衆液重量的I倍，酶促透析時間為48小時；C)將上述透析液冷凍干燥后得豬脾脾氨肽干粉。本發明的提取方法，通過在動物脾臟勻漿液中添加適量低溫蛋白酶，將脾臟勻漿液中高分子量蛋白質酶解主動轉化為低分子量的多肽組分。再通過透析處理，將加入的蛋白酶連同其它高分子量組分除去，從而保證了提取得到的脾氨肽的質量。本發明方法中，由于脾氨肽的生產需要在低溫下進行，因此我們選用低溫蛋白酶進行酶促水解。在此基礎上，為了確定合理的低溫蛋白酶用量，我們嘗試了不同酶用量對脾氨肽產率的影響。我們向相同體積的脾臟勻漿液中分別加入不同量的低溫蛋白酶，然后將這些勻漿液分別裝入截留分子量7000道爾頓的透析袋中并將透析袋放入裝有透析液(本工作中透析液為無菌 注射用水)的容器中。由于透析袋孔徑的限制，只有分子量小于7000道爾頓的多肽才能通過透析袋孔進入透析液中，而分子量大于7000道爾頓的蛋白質則被截留在透析袋中，從而達到將低分子量多肽與高分子量蛋白質分離的目的，使提取得到的脾氨肽100%為7KD以下。如果在勻漿液中加入蛋白酶，由于蛋白酶的分子量都大于7000道爾頓，蛋白酶會被截留在透析袋內。蛋白酶在透析袋內能將截留的高分子量蛋白質逐漸水解為低分子量的多肽，這些酶解產生的多肽也會通過透析袋孔進入透析液中，從而與蛋白酶分開，可以防止進一步酶解。表1:菠蘿蛋白酶的濃度對脾氨肽產率的影響(兩個批次的實驗結果)批次1:
權利要求
1.一種高效提取脾氨肽的方法，具體步驟包括: A)將新鮮健康動物脾臟剪去脂肪、絞碎、稱重后進行勻漿； B)在步驟A)得到的勻漿液中添加低溫蛋白酶，用量為每克動物脾臟勻漿液中添加0.6-1.3U，然后裝入截留分子量為7000道爾頓的透析袋中，放到2-5°C無菌注射用水中透析，透析液用量為勻衆液重量的I倍，酶促透析時間為24 50小時； C)將步驟B)得到的透析液冷凍干燥后得到脾氨肽干粉。
2.權利要求1所述的高效提取脾氨肽的方法，其特征在于:步驟A)所述的動物為豬、牛或羊。
3.權利要求1所述的高效 提取脾氨肽的方法，其特征在于:步驟A)所述的勻漿使用膠體磨完成。
4.權利要求1所述的高效提取脾氨肽的方法，其特征在于:步驟B)所述的低溫蛋白酶用量為每克動物脾臟勻漿液中添加0.9-1.3U。
5.權利要求1所述的高效提取脾氨肽的方法，其特征在于:步驟B)所述的低溫蛋白酶用量為每克動物脾臟勻漿液中添加1.3U。
6.權利要求1所述的高效提取脾氨肽的方法，其特征在于:步驟B)所述的低溫蛋白酶選自食用植物來源的蛋白酶中的一種或兩種以上的混合物。
7.權利要求6所述的高效提取脾氨肽的方法，其特征在于:所述的食用植物來源的蛋白酶選自木瓜蛋白酶或菠蘿蛋白酶中的一種或兩種的混合物。
8.權利要求1所述的高效提取脾氨肽的方法，其特征在于:步驟B)所述的無菌注射用水溫度為3 4°C。
9.權利要求1所述的高效提取脾氨肽的方法，其特征在于:步驟B)所述的酶促透析時間為48小時。
10.權利要求1所述的高效提取脾氨肽的方法，包括以下步驟: A)將新鮮健康豬脾臟剪去脂肪、絞碎，稱重后加入0.85倍重量無菌注射用水進行膠體磨勻漿； B)在步驟A)得到的勻漿液中添加低溫蛋白酶，用量為每克豬脾臟勻漿液中添加·0.9-1.3U，然后裝入截留分子量為7000道爾頓的透析袋中，放到2-5°C無菌注射用水中透析，透析液用量為勻衆液重量的I倍，酶促透析時間為48小時； C)將上述透析液冷凍干燥后得豬脾脾氨肽干粉。
全文摘要
本發明提供一種高效提取脾氨肽的方法，具體步驟包括將新鮮健康動物脾臟剪去脂肪、絞碎、稱重后進行勻漿；在得到的勻漿液中添加低溫蛋白酶，用量為每克動物脾臟勻漿液中添加0.6-1.3U，然后裝入截留分子量為7000道爾頓的透析袋中，放到2-5℃無菌注射用水中透析，透析液用量為勻漿液重量的1倍，酶促透析時間為24～50小時；將得到的透析液冷凍干燥后得到脾氨肽干粉。本發明的方法能提高脾氨肽產量50%-150%，從而提高了動物脾臟的利用效率。
文檔編號C12P21/06GK103194513SQ20131010334
公開日2013年7月10日 申請日期2013年3月27日 優先權日2013年3月27日
發明者蔣舒, 柯祖敏 申請人:浙江豐安生物制藥有限公司