專利名稱：一種微生物發酵生產吡咯喹啉醌的方法及所用的發酵培養基的制作方法
技術領域：
本發明涉及微生物發酵技術研究領域，具體的涉及一種微生物發酵高效生產吡咯喹啉醌(PQQ)的方法及所用的發酵培養基。
背景技術：
卩比咯喹啉醌(Pyrroloquinolinequinone,PQQ)是第三類氧化還原酶的輔酶,也是被稱為一種新的維生素，具有多種生理功能，在防治肝損傷和肝中毒、促進神經生長因子生成、調節自由基水平，抗輻射損傷、心血管疾病和糖尿病等方面有重要醫用價值。目前PQQ主要是化學合成法，微生物合成具有清潔低碳、溫和可控、成本低廉等優勢，是一種極具潛力的生產方式。影響微生物發酵生產PQQ大規模應用的主要因素有:(1)適合于工業生產的微生物不多；(2)文獻報道的PQQ生產菌株生產周期長，產率不高；(3)PQQ作為一種輔酶，并不是微生物的次級代謝產物，其合成調控受培養條件和代謝調控的嚴格制約。
發明內容
為了解決上述問題，本發明的目的是提供一種能使PQQ合成量增加的培養方法和發酵培養基，摸索一條行之有效的微生物發酵生產PQQ的控制方法，實現利用甲基營養菌高效生產PQQ的目的。本發明的另一目的是提供一種發酵制備所述PQQ的發酵培養基。為了實現本發明的目的，本發明提供了一種微生物發酵生產吡咯喹啉醌的方法，其包括如下步驟:(I)活化菌種:將原始菌種甲基營養菌Methylovorus sp.MP688接種到固體培養基中，在適合原始菌種生長的條件下進行培養，得活化的菌種；(2)種子液的培養:將步驟(I)所得活化好的菌種接種到液體培養基中，在適合菌體生長的條件下進行培養，得種子培養液；(3)發酵罐發酵:將步驟(2)所得種子培養液按比例接種到含有發酵培養基的發酵罐中；發酵培養過程中溫度恒定，同時，發酵罐的pH、溶解氧和攪拌轉速采用兩階段控制策略；氮源補料采用PH-氮源聯控方式進行，碳源補料采用間歇補料方式進行；(4)收獲發酵液，得吡咯喹啉醌。進一步地，本發明提供了以下優選的技術方案:其中，所述甲基營養菌Methylovorus sp.MP688，已于2010年8月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏號為CGMCCN0.4096。(詳細信息請參見中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所申請的專利號為201010548511.9的發明專利)。優選的，步驟(I)中所述培養溫度為30 35°C，培養時間為2 3天；所述固體培養基為在基本培養基的基礎上添加瓊脂粉和碳源甲醇，所述瓊脂粉在所述固定培養基中的濃度為I 2g/L，所述甲醇在所述固定培養基中的濃度為7.5 15g/L，其中，所述基本培養基的組分及配比如下:基本培養基(以IL計)MgSO4.7H200.4-lg,(NH4)2SO43_5g，KH2PO41.4g,Na2HPO4.12H20 3g,檸檬酸鐵10_30mg，CaCl210_30mg, MnCl2.4H205-lOmg,ZnSO4.7H205-1 Omg,CuSO4.5H200.5_2mg,葉酸0.02-0.05mg,生物素0.02-0.05mg,核黃素0.02-0.05mg,煙酸0.02-0.05mg,硫辛酸0.02-0.05mg。優選的，步驟(2)具體步驟為:步驟(I)所得活化好的菌種挑單菌落，接種到5ml液體培養基中30 35°C搖床振蕩，轉速為200 250轉/分，培養2 3天，然后取I 2ml前述菌液接種至含有IOOml液體培養基的三角瓶中在相同條件下繼續擴繁培養，直至得到菌株細胞密度(0D_)為1.2 1.5的種子液；其中，所述液體培養基為在基本培養基的基礎上添加碳源甲醇，所述甲醇在液體培養基中的濃度為7.5 15g/L。其中，所述基本培養基的組分及配比如下:基本培養基(以IL計)MgSO4.7H200.4-lg,(NH4)2SO43_5g，KH2PO41.4g,Na2HPO4.12H20 3g,檸檬酸鐵10_30mg，CaCl210_30mg,MnCl2.4H205-lOmg,ZnSO4.7H205-1 Omg,CuSO4.5H200.5_2mg,葉酸0.02-0.05mg,生物素0.02_0.05mg，核黃素0.02-0.05mg,煙酸0.02-0.05mg,硫辛酸0.02-0.05mg。
優選的，步驟(3)中所述種子培養液與發酵培養基的體積比為1:50 1:10 ;所述的發酵培養基，具體組成和配比如下:發酵培養基(以IL計)MgSO4.7H200.4-lg,(NH4)2SO43_5g，KH2PO42.1-2.8g,Na2HPO4.12H20 4.5_6g，檸檬酸鐵30_80mg，CaCl20.05-0.25mg,MnCl2.4H205-lOmg,ZnSO4.7H205-1 Omg,CuSO4.5H200.5-lmg,葉酸0.02-0.05mg。優選的， 步驟(3)中所述發酵溫度為30 35°C，發酵時間為6 8天。優選的，所述的兩階段控制策略的具體為:(I)初期:接種之后發酵初期通氣量控制在0.02 5vvm，不控制溶解氧，轉速控制在200 300rpm，初始pH值調整為6.5-7.0后，pH值不再控制；(2)后期:隨著細菌生長，pH值下降，待pH值下降到5.5 6.0時，通過泵反饋流加氨水將PH控制在此水平；待發酵罐中的溶解氧下降到飽和溶氧的30%時，通過溶解氧與轉速和通氣量關聯的策略將溶解氧控制在30% 50%的水平，具體為:優先調整轉速，所述轉速范圍為200 800rpm,當轉速達到上限800rpm時,調整通氣量,所述通氣量范圍是0.2 5vvm。優選的，步驟(3)中所述碳源為甲醇，所述氮源為硫酸銨、氨水中的一種或兩種；所述碳源初始濃度為7.5 15g/L，氮源初始濃度7.5 15g/L ;發酵過程中碳源的總濃度控制在15g/L以內，硫酸銨的總濃度控制在3g/L以內；所述pH-氮源聯控方式為當發酵液pH值隨著細菌生長下降到6.0時啟動氮源補料程序，通過流加方式進行氮源補料，所述的氮源補料液為0.10 0.25g/ml的氨水或硫酸銨；在線監測細菌的生長速率和氮源補料量曲線，一旦細菌的生長速率或者氮源補料速率與上一時間段相比有降低，通過間歇補料方式加入碳源甲醇，補料量為每升發酵液加入5 15g甲醇；所述甲醇為工業甲醇或分析純。優選的，步驟(4)的發酵液按照武漢大學趙永芳等專利《吡咯喹啉醌的提取方法》制備吡咯喹啉醌產品(專利授權號為CN1138776C)。吡咯喹啉醌含量的測定參照Geiger0.等人 1987 年的文獻 Enzymatic determination of pyrroloquinoline quinone usingcrude membranes from Escherichia coli。進一步地，本發明提供了一種吡咯喹啉醌，其是由上述方法生產得到。更進一步地，本發明提供了一種發酵培養基，具體組成和配比如下:發酵培養基(以IL計)MgSO4.7H200.4-lg,
(NH4)2SO43_5g，KH2PO42.1-2.8g,Na2HPO4.12H20 4.5_6g，檸檬酸鐵30_80mg，CaCl20.05-0.25mg,MnCl2.4H205-lOmg,ZnSO4.7H205-lOmg,CuSO4.5H200.5-lmg,葉酸0.02-0.05mg。更進一步地，本發明提供了上述發酵培養基在生產吡咯喹啉醌中的應用。本發明的有益效果如下:本發明采用發酵培養基，有利于甲基營養菌快速高效的合成吡咯喹啉醌，組分為無機鹽，無復雜的有機物，因此成本低廉，適合工業放大生產。本發明發酵培養過程中溫度恒定，發酵罐的pH、溶解氧和攪拌轉速采用兩階段控制策略；通過限制溶解氧(30-50%)和控制弱酸性環境(pH5.5-6.0)，將細菌生長速率維持在較低水平(低于20D_/24小時)，來協調細菌生長與PQQ的合成兩個過程，使碳源代謝流更多的流向合成PQQ的途徑，從而得到高產量的PQQ;同時，通過PH-氮源聯控方式進行氮源補料，通過間歇補料方式進行碳源補料，使發酵過程最優。本發明在7.5L自動發酵罐中培養6天最終細胞密度(OD6tltl)超過10，PQQ產量達到了 2g/L，PQQ生產強度為333.33mg/L/天，產量和生產強度超過已有文獻報道的最高值，并縮短了發酵周期；同時，本發明操作簡單，便于實現自動控制和連續發酵，為使用甲基營養菌工業化生產PQQ奠定了堅實的基礎。
圖1本發明發酵生產PQQ的結果。圖中:.表示細菌生長曲線，■表示PQQ合成曲線。
具體實施例方式下面結合附圖及其具體實施方式
詳細介紹本發明。但本發明的保護范圍并不局限于以下實例，應包含權利要求書中的全部內容。以下實施例中所使用的藥品，購自國藥集團化學試劑有限公司，藥品級別為分析純；實施例中使用的儀器均為生物實驗室常規儀器，所用的發酵罐型號為B10STARBplus, Germany。實施例1甲基營養菌Methylovorus sp.MP688的活化Methylovorus sp.MP688保藏于中國普通微生物菌種保藏中心CGMCC4096,是一株PQQ產量達到生產水平的菌株。用原始菌株(甘油保藏或者凍干 狀態)在固體培養基平板上劃線，30°C培養2天；挑單菌落，接種到5ml液體培養基中，30°C，搖床200轉/分，培養48小時作為活化種子。所述固體培養基為在基本培養基的基礎上添加瓊脂粉和碳源甲醇，所述瓊脂粉在所述固定培養基中的濃度為lg/L ;所述液體培養基為在基本培養基的基礎上添加碳源甲醇；其中所述甲醇在固定培養基或液體培養基中的濃度為10g/L ;所述基本培養基的組分及配比如下:基本培養基(以IL計)MgSO4.7H200.4-lg,(NH4)2SO43_5g，KH2PO41.4g,Na2HPO4.12H203g,檸檬酸鐵30mg，CaCl230mg,MnCl2.4H205mg,ZnSO4.7H205mg,CuSO4.5H200.5mg,葉酸0.02mg,生物素0.02mg，核黃素0.05mg,煙酸 0.05mg，硫辛酸0.05mg。實施例2種子液的制備取實施例1得到的菌液2ml，并接種至含有IOOml液體培養基的三角瓶，30°C，搖床200轉/分，培養36小時，同樣條件下活化1-2次，使最終細密度(0D_)為1.2 1.5，制成種子液。所用液體培養基同實施例1。實施例3在5L全自動發酵罐中進行PQQ生產實例A用實施例2的種子液，按照1:20的比例接種到7.5L自動發酵罐中。接種后發酵初期通氣量控制在lvvm，攪拌轉速控制在300rpm，溫度控制在0°C，初始pH值設為7.0 ;所述碳源甲醇初始濃度為7.5g/L，氮源硫酸銨初濃度15g/L ;所述的發酵培養基，具體組成和配比如下:發酵培養基(以IL計)MgSO4.7H200.4g,(NH4)2SO43g，KH2PO42.8g,Na2HPO4.12H20 6g,檸檬酸鐵60mg，CaCl20.05mg,MnCl2.4H205mg,ZnSO4.7H205mg,CuSO4.5H200.5mg,葉酸0.02mg。隨著細菌生長，pH值下降，待下降到6.0時，通過泵反饋流加氨水將pH控制在此水平；待發酵罐中的溶解氧下降到飽和溶氧的40%時，通過溶解氧與攪拌轉速和通氣量關聯的策略將溶解氧控制在40%的水平，攪拌轉速調整優先(800rpm上限)，轉速達到上限時調整通氣量，通氣量最大設置為5vvm。采用pH-氮源聯控技術實現氮源氨水的補料，補料液濃度為0.15g/ml ;在線監測細菌的生長速率，當細菌12小時內的生長速率曲線與前12小時生長速率降低時，通過間歇補料方式加入碳源甲醇，補料量為每升發酵液加入IOg甲醇；所述的碳源補料液，具體為工業甲醇或分析純。每12小時記錄和計算細胞密度(OD6tltl)和PQQ產量。在這種發酵條件下，經過6天的培養，最終細胞密度(0D_)可達到或超過10，PQQ產量達到或超過2g/L，PQQ生產強度至少為333.33mg/L/天，具體結果可參見圖1。實施例4在5L全自動發酵罐中進行PQQ生產實例B用實施例2的種子液和實施例3中的發酵培養基組成和配比，按照1:50的比例接種到7.5L自動發酵罐中。接種之后發酵初期通氣量控制在lvvm，攪拌轉速控制在300rpm，溫度控制在30°C，初始pH值設為6.5后不再控制；所述碳源甲醇初始濃度為7.5g/L，氮源硫酸銨初始濃度15g/L。隨著細菌生長，pH值下降，待下降到5.8時，通過泵反饋流加氨水將pH控制在此水平；待發酵罐中的溶解氧下降到飽和溶氧的30%時，通過溶解氧與攪拌轉速和通氣量關聯的策略將溶解氧控制在30% 的水平，攪拌轉速調整優先(800rpm上限)，轉速達到上限時調整通氣量，通氣量最大設置為5vvm。采用pH-氮源聯控技術實現氮源氨水的補料，補料液濃度為0.15g/ml ;在線監測細菌的生長速率，當細菌12小時內的生長速率曲線與前12小時生長速率降低時，通過間歇補料方式加入碳源甲醇，補料量為每升發酵液加入IOg甲醇；所述的碳源補料液，具體為工業甲醇或分析純。每12小時記錄和計算細胞密度(OD6tltl)和PQQ產量。在這種發酵條件下，經過6天的培養，最終細胞密度(0D_)可達到或超過10，PQQ產量達到或超過lg/L，PQQ生產強度至少為166.67mg/L/天。實施例5在5L全自動發酵罐中進行PQQ生產實例C用實施例2的種子液和實施例3中的發酵過程的全部參數控制，改變所用發酵培養基，具體組成和配比如下:MgSO4.7H20lg,(NH4)2SO45g，KH2PO42.lg,Na2HPO4.12H20 4.5g,檸檬酸鐵80mg，CaCl20.1 mg,MnCl2.4H205mg，ZnSO4.7H205mg，CuSO4.5H200.5mg，葉酸0.05mg。在這種發酵條件下，經過6天的培養，最終細胞密度(0D_)可達到或超過10，PQQ產量達到或超過1.5g/L，PQQ生產強度至少為250mg/L/天。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。
權利要求
1.一種微生物發酵生產吡咯喹啉醌的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)活化菌種:將原始菌種甲基營養菌Methylovorussp.MP688接種到固體培養基中，在適合原始菌種生長的條件下進行培養，得活化的菌種； (2)種子液的培養:將步驟(I)所得活化好的菌種接種到液體培養基中，在適合菌體生長的條件下進行培養，得種子培養液； (3)發酵罐發酵:將步驟(2)所得種子培養液按比例接種到含有發酵培養基的發酵罐中；發酵培養過程中溫度恒定，同時，發酵罐的pH、溶解氧和攪拌轉速采用兩階段控制策略；氮源補料采用PH-氮源聯控方式進行，碳源補料采用間歇補料方式進行； (4)收獲發酵液，得吡咯喹啉醌。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(I)中所述培養溫度為30 35°C，培養時間為2 3天；所述固體培養基為在基本培養基的基礎上添加瓊脂粉和碳源甲醇，所述瓊脂粉在所述固定培養基中的濃度為I 2g/L，所述甲醇在所述固定培養基中的濃度為.7.5 15g/L，其中，所述基本培養基的組分及配比如下: 基本培養基(以IL計) MgSO4.7H200.4-lg, (NH4)2SO43-5g， KH2PO41.4g， Na2HPO4.12H20 3g, 檸檬酸鐵10-30mg， CaCl210-30mg, MnCl2.4H205-10mg, ZnSO4.7H205-1Omg， CuSO4.5H200.5_2mg， 葉酸0.02-0.05mg， 生物素 0.02-0.05mg, 核黃素 0.02-0.05mg, 煙酸 0. 02-0.05mg, 硫辛酸 02-0.05mg。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)具體步驟為:步驟(I)所得活化好的菌種挑單菌落，接種到5ml液體培養基中30 35°C搖床振蕩，轉速為200-250轉/分，培養2 3天，然后取I 2ml前述菌液接種至含有IOOml液體培養基的三角瓶中在相同條件下繼續擴繁培養，直至得到菌株細胞密度(OD6tltl)為1.2 1.5的種子液；其中，所述液體培養基為在基本培養基的基礎上添加碳源甲醇，所述甲醇在液體培養基中的濃度為7.5 15g/L。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中所述種子培養液與發酵培養基的體積比為1:50 1:10 ;所述的發酵培養基，具體組成和配比如下: 發酵培養基(以IL計) MgSO4.7H200.4-lg, (NH4)2SO43-5g，KH2PO42.1-2.8g, Na2HPO4.12H20 4.5_6g， 梓檬酸鐵30_80mg, CaCl20.05-0.25mg, MnCl2.4H205-10mg, ZnSO4.7H205-1Omg， CuSO4.5H200.5-lmg, 葉酸0.02-0.05mg。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中所述發酵溫度為30 35°C，發酵時間為6 8天。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中所述的兩階段控制策略的具體為: (O初期:接種之后發酵初期通氣量控制在0.02 5vvm，不控制溶解氧，轉速控制在200 300rpm，初始pH值調整為6.5-7.0后，pH值不再控制； (2)后期:隨著細菌生長，pH值下降，待pH值下降到5.5 6.0時，通過泵反饋流加氨水或者硫酸銨將PH控制在此水平； 待發酵罐中的溶解氧下降到飽和溶氧的30%時，通過溶解氧與轉速和通氣量關聯的策略將溶解氧控制在30% 50%的水平，具體為:優先調整轉速，所述轉速范圍為200 800rpm,當轉速達到上限800rpm時,調整通氣量,所述通氣量范圍是0.2 5vvm。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中所述碳源為甲醇，所述氮源為硫酸銨、氨水中的一種或兩種；所述碳源初始濃度為7.5 15g/L，氮源初始濃度7.5 15g/L ;發酵過程中碳源的總濃度控制在15g/L以內,硫酸銨的總濃度控制在3g/L以內； 所述PH-氮源聯控方式為當發酵液pH值隨著細菌生長下降到6.0時啟動氮源補料程序，通過流加方式進行氮源補料，通過流加補料液進行氮源補料，所述的氮源補料液為0.10-0.25g/ml的氨水或硫酸銨； 在線監測細菌的生長速率和氮源補料量曲線，一旦細菌的生長速率或者氮源補料速率與上一時間段相比有降低，通過間歇補料方式加入碳源甲醇，補料量為每升發酵液加入5 15g甲醇；所述甲醇為工業甲醇或分析純。
8.—種吡咯喹啉醌，其特征在于，其是由權利要求1 7任意一項所述方法生產制備得到。
9.一種發酵培養基，其特征在于，該培養基的具體組成和配比如下: 發酵培養基(以IL計) MgSO4.7H200.4-lg, (NH4)2SO43-5g， KH2PO42.1-2.8g, Na2HPO4.12H20 4.5_6g， 梓檬酸鐵30_80mg, CaCl20.05-0.25mg， MnCl2.4H205-10mg，ZnSO4.7H205-10mg，CuSO4.5H200.5-lmg,葉酸0.02-0.05mg。
10.權利要求9所述的培養基在生產制`備吡咯喹啉醌中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種微生物發酵生產吡咯喹啉醌的方法和所用發酵培養基。采用控氧發酵培養法培養甲基營養菌，發酵培養基中含有的碳源為甲醇、氮源為硫酸銨，在發酵過程中分階段控制溶解氧水平為飽和溶氧的30-50%，通過補料控制pH在5.5-6.0，通過pH-氮源聯控技術實現補料，在7.5L發酵罐中培養6天最終細胞密度(OD600)超過10，PQQ產量達到了2g/L，PQQ生產強度為333.33mg/L/天，本發明操作簡單，便于實現自動控制和連續發酵，為使用甲基營養菌工業化生產吡咯喹啉醌奠定了堅實的基礎。
文檔編號C12P17/18GK103224965SQ20131010293
公開日2013年7月31日 申請日期2013年3月27日 優先權日2013年3月27日
發明者葛欣, 張惟材, 熊向華, 汪建華 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所